GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

이 방법은 대장암 환자에서 발견되는 미세전이에 대한 종양 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스에서 GFP 표지, 환자 유래 대장암 오가노이드에 의해 유도된 미세 전이를 통해 매우 민감하게 검출할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생쥐의 먼 장기에서 대장 종양 또는 오가노이드 유래 미세 전이를 감지하기 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

Yu Okazawa와 함께 시술을 시연하는 사람은 Kosuke Mizukoshi와 Yu Koyama로, 둘 다 우리 그룹의 박사 과정 학생이자 외과 의사입니다. 인간 결장직장암 세포 오가노이드를 생성하려면 먼저 웰당 150마이크로리터의 인공 세포외 기질을 얼음 위의 12웰 플레이트에 추가합니다. 모든 웰이 코팅되면 섭씨 37도의 5% CO2 인큐베이터에서 30-60분 동안 플레이트를 배양하여 겔을 응고시킵니다.

다음으로, 5%태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 신선한 대장암 오가노이드 배양 배지에 환자 유래 종양 이종이식 세포 펠릿을 재현탁시켜 10-5 세포 농도의 3배를 달성하고 각 인공 세포외 기질에 1ml의 세포를 시딩합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음날 아침, 원심분리를 위해 부유 세포를 포함한 배양 상등액을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮기고 펠릿을 얼음 위의 신선한 인공 세포외 기질 70마이크로리터에 재현탁합니다.

결장직장암 세포의 생존력을 높이려면 인공 세포외 기질이 포함된 부유 종양 세포를 인공 세포외 기질로 코팅된 웰에 다시 오버레이하고 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 종양 세포 배양을 배양합니다. 새로운 세포외 기질 겔이 응고되면 1%FCS가 보충된 1ml의 신선한 대장암 오가노이드 세포 배양 배지를 배양액에 공급하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 7일에서 10일 동안 배양한 후 멸균 세포 스크레이퍼로 오가노이드를 기계적으로 분리하고 오가노이드를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 원심분리합니다.

그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 다시 부유시키고 또 다른 원심분리를 위해 부드럽게 두드립니다. 결장직장암 오가노이드를 해리하려면 500마이크로리터의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 용액을 튜브에 넣고 부드럽게 두드려 섞습니다. 실온에서 10분 후 1% FBS가 보충된 배지 500마이크로리터를 세포에 첨가하고 세포 현탁액을 매우 부드럽게 여러 번 피펫팅하여 오가노이드를 분해합니다.

처리 중 human CRC 오가노이드를 부드럽게 피펫팅하는 것은 배양에서 온전한 스페로이드 형성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 100마이크로리터의 5X GFP 렌티바이러스 스톡과 400마이크로리터의 신선한 대장암 오가노이드 배양 배지에 재현탁합니다. 특히 CRC를 거의 100% 감염시키기 위해서는 GFP 렌티바이러스의 높은 역가로 인간 CRC 오가노이드를 감염시키는 것이 필수적입니다.

각 튜브의 부피를 조정하여 중간 농도의 500마이크로리터당 5개의 해리된 종양 세포에 대해 5배 10을 달성하고 500마이크로리터의 세포를 인공 세포외 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트의 각 웰에 플레이트합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 18시간 후, 원심분리를 위해 떠다니는 세포 함유 상등액을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 얼음 위의 튜브당 70마이크로리터의 인공 세포 외 기질에 펠릿을 재현탁합니다. 결장직장암 세포의 생존력을 높이려면 종양 세포를 포함하는 인공 세포외 기질을 12웰 플레이트의 종양 오가노이드에 오버레이하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.

인공 세포외 기질 코팅이 응고되면 1%FCS가 보충된 1ml의 신선한 CRC 오가노이드 배양 배지를 배양액에 공급하고 세포를 3일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 형광 현미경으로 감염된 세포를 관찰하여 거의 100% GFP 양성을 확인하고 세포를 다시 4-6일 동안 인큐베이터에 넣습니다. CRC 환자 유래 종양 이종이식편의 자발적 전이 마우스 모델을 확립하기 위해, 입증된 바와 같이 GFP 표지된 오가노이드를 해리하고, 단일 종양 세포 현탁액을 50% 인공 세포외 기질 농도가 보충된 PBS 50마이크로리터당 5개의 종양 세포로 5배 10으로 희석합니다.

쥐당 50마이크로리터의 세포를 22게이지 바늘이 장착된 주사기에 넣고 종양 세포를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인하고 첫 번째 마취된 NOG 마우스를 실험실 벤치의 누운 자세에 놓습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 항문에서 직장 점막을 부드럽게 빼내고 즉시 종양 세포를 직장 점막하에 주입합니다.

CRC 환자 유래 종양 이종이식편의 실험적 전이 모델을 확립하기 위해, 단일 종양 세포 현탁액을 50 마이크로 리터 농도 당 4 개의 세포에 4 배 10으로 희석하고, 마우스 당 50 마이크로 리터의 세포를 22 게이지 바늘이 장착 된 주사기에 적재합니다. 첫 번째 마취 된 NOG 마우스를 벤치의 엎드린 자세로 놓고 왼쪽 옆구리의 아래쪽 부분을 작게 절개합니다. 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 복막을 조심스럽게 절개하여 비장을 노출시키고 핀셋을 사용하여 비장에 붙은 지방을 잡습니다.

그런 다음 50마이크로리터의 종양 세포 현탁액을 비장에 천천히 주입하고 누출이 관찰되지 않도록 주의합니다. 필요에 따라 모든 쥐에게 주사 및 봉합을 한 후 동물을 집 우리로 되돌리고 종양 세포 분만 후 하루 후에 봉합사 누출 및 생존 능력을 확인합니다. 캘리퍼스를 사용하여 매주 종양을 측정하고 원발성 종양 및 관련 조직을 적절한 실험 종점까지 채취합니다.

절개된 종양과 장기를 얼음 위의 10cm 페트리 접시에 담아 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 옮기고, 실체 형광 현미경으로 절개된 조직을 관찰하여 GFP 발현을 평가합니다. GFP 렌티바이러스에 의한 CRC 오가노이드 감염은 거의 모든 오가노이드가 매우 밝은 GFP를 발현하는 결과를 낳습니다. 2차 수용자 NOG 마우스에 GFP 표지된 오가노이드를 주사하면 주사 후 2.5개월에 검사한 대다수의 마우스의 폐뿐만 아니라 정소부위에서 GFP 양성 원발성 종양이 형성됨을 알 수 있습니다.

또한, 간 전이는 비장내 주사 후 1개월에 수용 NOG 동물에서 관찰됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 GFP 표지된 인간 결장직장암 세포 오가노이드가 수용 마우스에 도입된 후 미세 전이를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 마우스에서 인간 대장암 세포 오가노이드의 종양 및 전이 유도 효율은 원래 종양 세포의 환자 간 변동성에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.