마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

이 절차의 전반적인 목표는 정제 단계가 필요하지 않은 모듈식 단백질 어레이를 만들어 모든 단백질 라이브러리와 호환되도록 하는 것입니다. 이것은 먼저 어셈블리 PCR을 통해 합성 유전자를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 합성 유전자를 에폭시 슬라이드에 배열합니다.

microfluidic 장치를 제조하기 위하여 이용하십시오 실리콘 통제와 교류 형과 함께 PDMS. 그런 다음 미세유체 장치는 점박이 DNA 어레이에 정렬됩니다. 마지막으로, 토끼 망상적혈구 용해물이 미세유체 장치로 흘러 들어가고 단백질이 발현됩니다.

궁극적으로 형광 항체 라벨링을 통해 수천 개의 단백질 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 단백질 마이크로어레이와 같은 기존 방법에 비해 미세유체 기반 기술을 사용하는 데 몇 가지 이점이 있습니다. DNA를 마이크로어레이한 다음 첼리스를 사용하여 장치에서 단백질을 만듭니다.

따라서 단백질 정제가 필요하지 않으며 단백질이 절대 건조되지 않습니다. 실험 내내 신선함을 유지합니다. 미세유체 기술은 또한 더 높은 감도를 제공합니다.미세유체 장치를 제조하기 위해 실리콘 제어 및 흐름 금형을 클로로 트리메틸 실렌 증기에 10분 동안 노출시켜 엘라스토머 방출을 촉진합니다.

베이킹 단계 후, 제어 및 흐름 금형에 대해 각각 5 대 1 및 20 대 1의 두 가지 다른 비율로 실리콘 기반 엘라스토머와 경화제의 혼합물을 준비합니다. 5:1 PDMS를 제어 계층에 붓습니다. 제어 층의 가스를 제거하고 섭씨 30도에서 80분 동안 굽습니다.

다음으로 2, 600RPM에서 60초 동안 유동층에 20:1 PDMS 혼합물을 스핀 코팅한 다음 섭씨 80도에서 30분 동안 굽습니다. SU 8 패턴이 벗겨지지 않도록 주의하면서 금형에서 제어 층을 천천히 분리합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 장치 둘레를 자르고 뭉툭한 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어 현미경으로 제어 채널에 액세스합니다.

왼쪽 상단 모서리부터 시작하여 흐름 및 제어 층을 수동으로 정렬하고 반응 챔버 중앙의 제어 층에 버튼 밸브를 배치합니다. 그런 다음 첫 번째 행을 정렬하고 제어 레이어를 행별로 부드럽게 해제합니다. 모든 버튼 밸브가 반응 챔버의 중앙에 있고 어드레스 밸브와 입력 밸브가 올바른 위치에서 흐름 채널을 교차하는지 확인하십시오.

모든 행이 정렬될 때까지 로컬에서 프로세스를 반복합니다. 완전히 정렬되면 측면과 모서리에서 PDMS를 조심스럽게 들어 올려 PDMS의 장력을 해제합니다. 그런 다음 구운 후 섭씨 80도에서 2시간 동안 장치를 굽습니다.

주변을 절단하고 플로우 몰드 펀치 홀에서 2층 소자를 벗겨내어 유동 채널에 접근하여 소자에 대한 DNA 구조를 생성합니다. PCR을 수행하여 T seven promoter, ribosome binding site, 양쪽 끝에 다른 epitope 태그가 있는 open reading frame 및 T seven terminator로 구성된 합성 유전자를 생성합니다. 배열을 위해 합성 유전자를 준비하려면 폴리에틸렌 글리콜과 D 트리오스 이수화물의 혼합물을 만들고 반응당 2마이크로리터를 384의 웰에 분배합니다.

웰 플레이트. 합성 유전자를 384웰 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 증류수를 최종 부피 20마이크로리터에 추가합니다.

다음으로, 마이크로어레이 스폿을 사용하여 일련의 합성 유전자를 에폭시로 코팅된 유리 기판에 주입합니다. 입체경 아래에서 DNA 챔버 중앙에 위치한 DNA 반점이 있는 유전자 어레이에 미세유체 장치를 수동으로 정렬합니다. 그런 다음 나머지 행을 정렬합니다.

PDMS에 대한 스트레스를 완화하고 마이크로어레이에 잘 결합되도록 전체 장치를 미세 조정하여 마무리합니다. 현지에서 들어 올리십시오. 마지막으로, 섭씨 80도의 핫 플레이트에서 밤새 배양하여 장치를 유리 슬라이드에 접착합니다.

이 섹션에서는 시각화를 위해 식용 염료를 사용합니다. 제어 계층의 밸브는 랩 뷰를 사용하여 컴퓨터에서 작동됩니다. lab view 스크립트는 전자 제어 상자를 통해 일련의 솔레노이드 마이크로 밸브를 제어합니다.

솔레노이드 밸브 매니폴드는 압축 공기에 연결되어 장치의 제어 밸브로 들어가는 공기 흐름과 압력을 제어합니다. 내부 직경이 0.02인치인 유연한 플라스틱 튜브와 스테인리스 스틸 핀을 사용하여 장치를 솔레노이드 밸브 매니폴드에 연결합니다. 튜브에 이중 증류수를 채우고 핀을 제어 층의 액세스 구멍에 삽입합니다.

각 튜브가 해당 제어 채널에 연결되어 있는지 확인하십시오. 제어 채널을 활성화하려면 랩 뷰 애플리케이션을 실행하고 공기 압력을 5PS로 설정합니다. 그런 다음 랩 뷰 스크립트에서 밸브를 활성화하여 공기압을 적용합니다. 이렇게 하면 PDMS 제어 채널로 물이 유입되어 결함이 있는 장치의 제어 채널 간의 잠재적인 누화를 식별할 수 있습니다.

샌드위치와 주소 밸브를 먼저 채웁니다. 결국, 제어 채널과 밸브는 물로 가득 차 있으므로 밸브를 프라이밍하여 그 아래의 흐름 채널을 차단하십시오. 먼저 공기 압력을 15PSI로 높인 다음 개별 솔레노이드 밸브에 연결된 일련의 온 오프 스위치를 통해 실험실 보기 프로그램에서 볼 수 있습니다.

모든 밸브가 열려 있는지 확인하기 위해 모든 스위치 버튼을 켜서 모든 밸브를 활성화하십시오. 튜브를 유량 입력 중 하나에 연결하고 4-5PSI에서 공기 흐름을 장치로 연결합니다. 이렇게 하면 유리 슬라이드에서 끈적한 밸브가 해제됩니다.

이제 장치가 준비되었으며 시각화를 위한 준비가 되었습니다. 이 섹션의 시약을 시각화하기 위해 노란색 식품 염료가 사용되며 무색 용액은 히피를 나타내어 표면에서 단백질 어레이의 자체 조립을 촉진하고 미세유체 장치 내에서 비특이적 흡수를 방지하고, 먼저 필요한 용액이 있는 새 튜브를 장치의 흐름 채널 중 하나에 연결하여 표면을 화학적으로 수정합니다. 그런 다음 튜브의 다른 쪽을 수동 매니폴드에 연결하고 공기 압력 흐름을 엽니다.

새 튜브에 40마이크로리터의 비오틴 엘레이트 BSA를 넣고 약 절반을 20분 동안 장치를 통해 흐르게 합니다. 50밀리몰 히피를 사용하여 각 단계 사이에 반응하지 않는 기질을 씻어냅니다. 다음으로, 25마이크로리터의 스트렙타비딘을 20분 동안 흘립니다.

비오틴 의기양섬유를 첨가한 BSA 위에 5분 동안 히스로 세척하여 버튼을 둘러싼 표면을 먹고, 버튼 밸브를 닫고 나머지 비오틴화된 BSA를 흘려보낸 다음, 다시 5분 동안 완두콩으로 세척합니다. 마지막으로, 버튼 아래에 쉿 소리 방지 태그 어레이를 만들려면 버튼 밸브를 풀고 30마이크로리터의 펜타 히스 비오틴을 20분 동안 흐르게 하여 장치에 단백질 어레이를 생성합니다. 넥 밸브를 열고 토끼 망상적혈구를 흐릅니다.

장치를 통해 DNA 챔버로 들어가는 빠른 결합 전사 및 번역 반응 용액. 다음으로, 샌드위치 밸브를 닫아 각 유전자를 환경과 분리하고 장치를 섭씨 30도에서 2.5시간 동안 핫 플레이트에서 배양합니다. 그런 다음 단백질의 말단 부위를 C mix SI 3 항체로 표시합니다.

마지막으로, 532 나노미터 레이저와 575 나노미터 방출 필터가 있는 마이크로어레이 스캐너를 사용합니다. 단백질 수치를 측정합니다. 이 그림은 단백질 어레이에서 다양한 수준의 단백질 발현을 보여줍니다.

일반적으로 유전자 라이브러리의 20%가 검출 가능한 수준으로 발현되지 않습니다. 배경 수준은 DNA로 발견되지 않은 챔버를 사용하여 결정되었습니다. 따라서, 해당 단백질 챔버로부터의 신호는 표지 항체의 잡음 또는 비특이적 흡수에 기인합니다.

제대로 수행되면 해당 장치 검증에는 4시간이 걸리고 칩 실험에는 5시간이 걸립니다.