Name: 마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 마이크로유체 플랫폼을 활용한 고처리량 단백질 표현 기술로 정제 없이 단백질 어레이를 생성하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 단백질 라이브러리와 호환되어 연구 효율성을 높입니다.

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이 작품은 마리 퀴리 국제 재 통합 보조금에 의해 지원되었다.

1. 장치 제작 <ol><li> 스탠포드 Microfluidics 주조 (에서 DTPA-D SU-8 제어 금형 및 SPR220-7 흐름 금형 구입 <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / 그룹 / 주물을</a> ). </li><li> 베이킹 단계 9시 엘라스토머 자료를 홍보하기 위해 10 분 동안 chlorotrimethylsilane (TMCS) 증기로 실리콘 금형을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 두 개의 서로 다른 비율 각각 5시 1분과 제어 및 흐름 금형에 대한 20시 1분에 실리콘 기반의 탄성 중합체 및 경화 에이전트 (잘 혼합)의 혼합물을 준비한다. 다른 비율은 여러 층의 적절한 결합을 위해 필요합니다. </li><li> 제어 계층 (약 5mm의 높이)에 5시 1분 PDMS를 부어. 80에서 제어 레이어와 30 분 동안 빵을 구워 가스를 제거하다 ° C. 그런 다음 스핀 코트 (Laurell, USA) 60 초 동안 2,600 rpm으로 흐름 층에있는 20시 1분 PDMS 혼합하고 30 분에 80 ° C에서 빵을 구워. 스핀 coater 속도는 압력 밸브 작동에 최적화되어 있습니다15 psi의. 빠른 회전은 낮은 활성화 압력과 반대의와 얇은 층에 발생합니다. 우리가 사용하는 장치는 기판에서 분리가 발생할 수있는 위의 흐름에 제어 25 PSI 10 psi의 제한이 있습니다. </li><li> 금형에서 제어 레이어를 분리합니다. 그것은 천천히하지 않도록 SU8 패턴 껍질을 조심하게. 그런 다음 제어 채널에 액세스하기 위해 주변과 펀치 구멍 주변 장치를 끄도록. </li><li> 수동으로 입체경 아래의 흐름과 제어 레이어를 맞 춥니 다. 왼쪽 상단 모서리를 정렬하여 시작하고, 버튼 밸브 (제어 계층)는 반응 챔버 (흐름 층)의 중간에 있어야합니다. 다음, 첫 번째 행을 정렬하고 부드럽게 행에 의해 제어 계층 행을 놓습니다. 모든 버튼 밸브는 반응 챔버의 중앙에 있으며, 주소와 입력 밸브가 올바른 위치에서 유동 채널을 넘어 있는지 확인하십시오. 모든 행이 정렬 될 때까지 프로세스는 로컬 반복 할 수 있습니다. 말에 PDMS B의 모든 긴장을 풀어y는 측면과 모서리에서 조심스럽게 들어 올렸다. 너무 많이 들지 마십시오 또는 misalignment가 발생할 수 있습니다. </li><li> 80 2 시간을 위해 굽 ° C. </li><li> 장치의 주위에과 유동 몰드에서 두 개의 계층 장치 (칩) 껍질을 잘라. 흐름 채널을 (그림 1)에 액세스 할 구멍을 펀치. </li></ol> 2. DNA의 Arraying 및 장치 정렬 <ol><li> 조립 PCR에 의해 합성 유전자를 생산하고 있습니다. 합성 유전자는 T7 프로모터, ribosome 구속력이 사이트 (RBS), 두 에피토프 태그와 ORF (각 끝 부분에 하나), 그리고 T7 종결 4 구성되어 있습니다. 유전자는 적어도 최대 100 BP의 길이 5,000 BP를 다를 수 있습니다. </li><li> arraying의 합성 유전자를 준비 : 폴리 에틸렌 glycole (1.25 %) 및 ​​D-trehalose 이수화 (125 MG / ML)의 혼합물을 준비하고 384 우물 판에 반응 당 2 μl을 투여. 이 솔루션은 정렬 10시 시각화를 위해뿐만 아니라 유리에 DNA의 돌이킬 수없는 바인딩을 줄일 수 있습니다. </lI&gt; <li> 384 우물 판에 합성 유전자를 전송합니다. 보통 DNA 농도는 10 ~ μl / NG 100 NG / μl 최종 농도 범위 수 있습니다. 20 μl (microarrayer 및 핀 종류에 따라 다름)의 최종 볼륨에 DH 2 O를 추가합니다. </li><li> microarrayer를 사용하여 에폭시 코팅 유리 기판 위에 합성 유전자의 시리즈를 정확 해요. 우리는 SMT-S75 실​​리콘 핀 (병렬 합성, USA)와 MicroGrid 610 (바이오 로보틱스)을 사용합니다. 이러한 특정 핀으로, DNA의 인쇄에 문의 유리 표면에 약 100 μm의 직경이 곳에서 발생합니다. 각 핀로드는 약 100 곳에 충분하다. 열 및 행 경기장에 사용 된 특정 장치에 해당해야합니다. 우리가 사용하는 장치는 16 열 각각 320 μm에 의해 680 μm의 피치 40 행이 포함되어 있습니다. </li><li> 수동으로 입체경에서 유전자 배열에 마이크로 유체 장치를 맞 춥니 다. DNA 명소는 DNA 챔버의 중앙에 있어야합니다. 장소 B의 첫 번째 행을 찾아 정렬을 시작합니다DNA 챔버의 첫 번째 행을 elow. 그런 다음 행의 나머지는 전체 장치의 미세 조정을 마무리 라인에 가져. 배열이 정렬되면 치료가 로컬을 올려서, PDMS에 모든 스트레스를 완화하기 위해주의해야한다. 는 microarray에 잘 결합 할 수 없습니다 PDMS에 남아 긴장이있는 경우. </li><li> 마지막으로, 80에서 핫 플레이트에서 하룻밤 배양하여 유리 슬라이드에 결합 장치를 ° C. </li></ol> 3. 프라이밍 및 장치를 활성화 <ol><li> 제어 계층의 밸브는 LabVIEW를 사용하여 컴퓨터에서 구동됩니다. LabVIEW 스크립트는 전자 제어 상자 (스탠포드 Microfluidics 주조에서 구입)를 통해 솔레노이드 밸브 마이크로 일련의를 제어합니다. 솔레노이드 밸브 매니 폴드는 장치의 제어 밸브에 공기 흐름과 압력을 제어 압축 공기에 연결되어 있습니다. </li><li> (Tygon &quot;0.02의 내부 직경 유연한 플라스틱 튜브를 사용하여 솔레노이드 밸브 매니 폴드에 장치를 연결)과 스테인레스 스틸 핀 (뉴 잉글랜드 작은 튜브 주식회사). </li><li> DDW로 튜브를 기입하여 제어 계층의 액세스 구멍에 핀을 삽입합니다. 각 튜브는 해당 제어 채널에 연결되어 있는지 확인합니다. </li><li> 제어 채널을 활성화하기 위해 컴퓨터에 LabVIEW 응용 프로그램을 실행합니다. LabVIEW 스크립트에서 밸브를 활성화함으로써, 우리는 결과적으로 PDMS 제어 채널로 물을 밀어 것입니다 공기 압력을 적용 할 수 있습니다. 공기 압력 5 PSI으로 설정합니다. 그것은 결함이있는 장치의 제어 채널 사이의 교차 대화를 식별하기 위해 먼저 &#39;샌드위치&#39;와 주소 밸브를 작성하는 것이 좋습니다. 간 회담 경우에는 &#39;샌드위치&#39;제어 라인의 작동은 목이나 버튼 제어 라인 중 하나의 작동으로 이어질 것입니다. 이 전기 회로의 짧은 비슷합니다. 크로스 토크와 장치에 결함이 있으며 사용할 수 없습니다. </li><li> 모든 제어 채널과 밸브 DDW 가득 후, 밸브는 중이오 정말이에요 아르그 아래에있는 흐름 채널을 차단하는 다이. 공기 압력 15 PSI로 늘립니다. 밸브 활성화는 개별 솔레노이드 밸브에 연결에 온 / 오프 스위치의 집합을 통해 LabVIEW 프로그램에서 제어됩니다. 각 스위치는 해당 솔레노이드 밸브를 통해 특정 제어 라인을 제어합니다. 스위치 버튼 (스크립트)를 사용하면 해당 관에 공기 압력을 적용합니다. 공기 압력은 제어 라인에 DDW 밀어되며, 아래의 채널을 차단, 마이크로 유체 밸브 확장 될 것입니다. 제어 밸브를 사용하지 않도록 설정하면, 공기 압력을 출시하고 이후 각각의 흐름 채널의 차단을 해제합니다. </li><li> 모든 밸브가 열려 있는지 확인하기 위해, 유동 입력 및 4-5 PSI에서 장치로 유동 공기 중 하나에 튜브를 연결합니다. 이 유리 슬라이드로부터 끈적 밸브를 출시 할 예정이다. </li><li> 마지막으로, 장치가 준비되어 대기 중이오. 표면 화학을 시작하기위한 모든 입력과 &#39;목&#39;밸브를 닫습니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 표면 화학 <ol><li> 표면에 단백질 배열의 자기 조립을 용이하게하고 마이크로 유체 장치에서 비 특정 흡착을 방지하기 위해 표면은 화학적으로 수정됩니다 </li><li> 장치를 통해 구성 요소를 흘러하려면 장치의 유동 채널 중 하나 필요한 솔루션으로 새로운 튜브를 연결합니다. 수동 매니 폴드에 튜브의 무료 쪽을 연결하고 공기 압력 흐름 (5 PSI)을 엽니 다. </li><li> 장치를 통해 20 분을위한 그것의 약 절반 새로운 튜브 및 흐름에 Biotinylated-BSA (1 μg / μl) 40 μl를로드, BSA는 에폭시 표면에 바인딩됩니다. </li><li> 다른 표면 화학 각 단계 사이에 unreacted 기판 세척을위한 Hepes (50 MM)를 사용합니다. </li><li> biotinylated-BSA의 꼭대기에서 20 분에 흐름 25 μl Strepavidin (0.5 μg / μl). </li><li> 5 분에 Hepes을 씻으십시오. </li><li> &#39;버튼&#39;밸브를 닫고 biotinylated-BSA의 나머지 부분을 (descri으로 흘러버튼을 둘러싸고있는 표면을 부동화 위 침대). </li><li> 5 분에 Hepes을 씻으십시오. </li><li> 20 분에 펜타 - 그의 - 비오틴의 &#39;버튼&#39;밸브 및 유량 30 μl (0.16 μg / μl)를 놓습니다. 항체는 노출 strepavidin에 바인딩되며 특별히 안티 그의 태그 배열을 만드는 &#39;버튼&#39;아래의 지역. </li></ol> 5. 단백질 표현 <ol><li> 토끼 망상 적혈구 빠른 커플 링 전사 및 번역 반응을 사용하여 장치에서 단백질을 표현한다. 장치의 무늬 합성 유전자에서 단백질 표현은 사용할 준비가 단백질의 배열을 만듭니다. 예를 들어, 하나의 사용은 단백질 구속력 화면입니다. </li><li> &#39;목&#39;밸브 및 유량 토끼 망상 적혈구 빠른 커플 링 전사와 DNA 챔버에 장치를 통해 번역 반응을 엽니 다. 다음으로 &#39;샌드위치&#39;밸브를 닫고 그 환경에서 각각의 유전자를 분리합니다. 30에 2.5 시간을위한 핫 플레이트에 장치를 품다 ° C. 표현 PRoteins는 C-말단 태그를 통해 단백질을 immobilizing &#39;버튼을&#39;밸브 아래에있는 반 그 항체에 DNA 챔버에서 반응 챔버 저절로 (목 밸브가 열려있는)과 바인드로 확산됩니다. </li><li> C-myc Cy3 항체와 단백질을 붙입니다. 항체는 단백질 N-말단에 위치한 해당 에피토프에 바인딩됩니다. </li><li> 532 nm의 레이저와 575 nm의 방출 필터를 사용하여 microarray 스캐너 (LS가 다시로드, Tecan)와 단백질 표현 수준을 결정합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 1. 장치 제작 장치에 대한 그래픽 디자인은 우리의 실험 필요에 따라 AutoCAD를에 의해 만들어졌습니다. 디자인은 고해상도 이미지 세터에 의해 투명 필름에 인쇄되었습니다. 이 투명성 연락처 석판 술의 photomask 역할을합니다. 표면 micromachining 기술은 t에 새겨 져있는 패턴에 의해 결정 실리콘 웨이퍼에 3-D 템플릿을 생성하는 데 사용 된그는 마스크가 사용됩니다. 마이크로 유체 장치는 실리콘 탄성체 polydimethylsiloxane (PDMS, SYLGARD 184, 다우 코닝, USA) (그림 1) 주조 실리콘 몰드에 가공했습니다. 각 장치는 2 개의 정렬 된 PDMS 층, 흐름과 제어 계층으로 구성되어 있습니다. 곰팡이가 처음 베이킹 단계 이후 엘라스토머 자료를 홍보하기 위해 10 분 동안 chlorotrimethylsilane (TMCS, 올드리치) 증기에 노출되었다. 실리콘 기반의 탄성과 경화 에이전트의 혼합물은 두 개의 서로 다른 비율 각각 5시 1분과 제어 및 흐름 금형에 대한 20시 1분에 준비되었습니다. 제어 계층은 80 ° C.에 degassed 30 분 동안 구운되었습니다 흐름 층은 처음 60 초에 2,600 rpm으로 (Laurell, USA) 코팅 돌리고 ° C 30 분에 80에서 구운되었습니다. 제어 계층은 그 곰팡이에서 분리되었으며, 제어 채널 액세스 구멍 천공되었습니다. 다음으로 흐름과 제어 층은 입체경에서 수동 정렬 80에서 2 시간에 구운 된 ° C. 두 레이어 장치는 F를 벗겨되었습니다ROM은 흐름 금형 및 유동 채널 액세스 구멍 천공되었습니다. 2. 장치 설명 장치 용량은 500에서 10,000 단위 세포 (그림 2)로 다양 할 수 있습니다. 이 장치는 두 레이어로 구성되어, 흐름 층 (회색)과 제어 계층 (컬러). 제어 계층은 서로 다른 기능을 밸브의 다양한 포함되어 있습니다. 흐름 층의 각 단위 세포는 하나의 DNA 한 반응 챔버로 구성되어 있으며 micromechanical 밸브의 세 가지 유형에 의해 제어됩니다, &#39;목&#39;, &#39;버튼&#39;및 &#39;샌드위치&#39;(그림 2A). DNA 챔버 내에서 증착 무늬 &#39;합성 유전자&#39;는 &#39;목&#39;밸브 (녹색)에 의해 반응 챔버로부터 차단됩니다. 반응 챔버의 표면에 바인딩 단백질의 트래핑 및 기계적 세척는 &#39;버튼&#39;밸브 (파란색)에 의해 수행됩니다. &#39;샌드위치&#39;밸브는 자체 단위 세포 (빨간색)에서 발생하는 각 반응을 할 수 있습니다. 주소 밸브는 differe에 대해, 8 독립적 인 섹션에 장치를 분할 할 수 있습니다NT 상태 분석. 또한, 제어 계층은 흐름 층에 선택된 유체의 흐름을 활성화 입력 밸브가 포함되어 있습니다. PDMS 제어 채널은 DDW로 가득 찼습니다. PDMS의 확대에 밸브가 압력 증가를 구동합니다 (15 PSI) 결과입니다. 막이 충분히 얇은 곳에서 (즉, 제어 및 흐름 라인의 교차점)이 완전히 흐름 라인을 차단하기에 충분합니다. 평균 단위 세포의 높이가 10 μm이며, 평균 단위 세포 볼륨 미만 NL입니다. 3. 단백질 표현 및 검색 단백질은 토끼 망상 적혈구 빠른 커플 링 전사 및 번역 반응 (Promega)를 사용하여 장치에 표현했다. 단백질의 표현은 구속력이 화면에서 사용할 준비가 단백질 (그림 3)의 배열을 만들었습니다. 표현 믹스 (12.5 μl)이 장치에로드 한 후 &#39;목&#39;밸브를 열어 DNA 챔버로 침수되었습니다. 다음으로 &#39;샌드위치&#39;밸브였다그 주변 세포와 장치에서 분리 각 단위 세포가 30에서 2.5 시간에 대한 뜨거운 접시에 incubated되었습니다 떠나는 ° C. 폐쇄 자신의 C-말단 그의 태그는 반 그의 항체 (Qiagen)은 표면에 단백질을 immobilizing &#39;버튼을&#39;밸브에서 지역화 구속 수있는 반응 챔버로 유전자 챔버를 통해 확산 표현 단백질. 단백질은 단백질 N-말단에 위치한 해당 에피토프에 바인딩하여 표시 C-myc Cy3 (시그마)로 표시했다. 단백질의 발현 수준은 532 nm의 레이저와 575 nm의 필터를 사용하여 microarray 스캐너 (LS가 다시로드, Tecan)로 결정됩니다. 그 결과 단백질 배열은 단백질 표현의 수준을 다양한 구성되어 있습니다. 일반적으로 유전자 라이브러리의 약 20 %가 감지 수준으로 표현하는 실패합니다. 단백질 크기가 상관 관계 3을 관찰 없습니다. 배경 수준은 DNA를 발견되지 않은 방을 사용하여 결정됩니다. 따라서, 해당 단백질 챔버에서 신호는 N 중로 인해우아즈 또는 라벨 항체의 비 특정 흡착. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 칩 제조. (A) 사상균은 10 분에 TMCS 증기로 치료했다. (B) PDMS는 제어 및 흐름 실리콘 금형에 주조되어 있습니다. (C) 모두 제어 및 흐름 금형는 80 ° C 30 분에 구운 있습니다. (D) 형의 껍질을 벗겨 제어 계층은 크기로 절단 및 제어 유입구가 천공되어 있습니다. (E) 제어 층 입체경 아래 유동 레이어에 정렬 한 후 80에서 구운되어 2 시간에 ° C.주세요 PDMS 장치 제조에 평행으로 합성 유전자의 시리즈는 에폭시 코팅 유리 기판 (CEL 제휴)에 microarrayed 있습니다. (F) 장치는 다음 DNA 챔버 내에서 &#39;합성 유전자&#39;를 막고 DNA의 microarray으로 정렬되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. PING 장치의 사진입니다. (A) 장치 consi2 개의 정렬 된 PDMS 층 (제어 및 흐름)의 ST. 흐름 층은 컨트롤 레이어에 micromechanical 밸브 ( &quot;버튼&quot;, &quot;샌드위치&quot;와 &quot;목&quot;)에 의해 제어 병렬 DNA와 반응 챔버 (회색)가 포함되어 있습니다. (B) 레이어가 인쇄 된 microarray, 단일 지점 각 DNA 챔버 프로그램에 정렬된다. 이 잠재적 인 오염을 제거합니다. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 마이크로 유체 칩으로 만든 단백질 배열의 형광 이미지. 인쇄 현장 유전자는 장치 내의 단백질 (DNA 챔버)로 표현 된 그들의 통해 (반응 챔버의 &quot;버튼&quot;밸브 아래) 표면에 내려 오게되었습니다 C-말단 그의 태그입니다. 단백질 표현들은 C-myc N-말단 태그와 특정 형광 항체를 사용하여 감지되었습니다. 다른 신호 강도는 다른 단백질 표현 수준을 나타냅니다. 취소 제의 방 배경 르에 대한 컨트롤로 제공vels.

<ol><li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+Microfluidic+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li>
<li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanoliter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li>
<li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li>
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<li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428(2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 논문에서 우리는 마이크로 유체 플랫폼을 사용 높은 처리량의 생성 단백질 배열을위한 방법을 제시한다. 배열 생성은 DNA 템플릿 microarray 인쇄와 마이크로 유체 장치 내의 DNA에서 체외 단백질 발현에 기반을두고 있습니다. 우리 소설 마이크로 유체 플랫폼은 단백질 체학을위한 유망 및 일반 툴을 만들 현재 사용 방법을 통해 몇 가지 중요한 장점을 가지고 있습니다. 하나의 장점은 막에 바인딩 단백질이다. microsomal 멤브레인 (11)의 존재에 포유류의 망상 적혈구 lysates를 사용하여에서 체외 단백질 합성은 막 단백질에 필요한 조건 &quot;같은 자연&quot;제공합니다. 또한, microfluidics이 매우 낮은 볼륨에서 단백질 표현 가능하며 단백질 정화가 필요하지 않습니다. 이러한 종래의 방법에서 가장 일반적인 병목 현상입니다. 사실, 단백질의 추가 최적화 체외 cel에 일치 의해 달...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> 다우 코닝 USA </td><td> 섹스-DC </td></tr><tr><td> Chlorotrimethylsilane (TMCS </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> 에폭시 코팅 유리 기판 </td><td> CEL 제휴 USA </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> 폴리 에틸렌 glycole (PEG) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 81,260 </td></tr><tr><td> D-trehalose 이수화 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinylated-BSA </td><td> 찌르다 </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidin </td><td> 찌르다 </td><td> 31,050 </td></tr><tr><td> 펜타 - 그의 - 비오틴 </td><td> Qiagen </TD&gt; <td> 34,440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">생물 산업</a> </td><td> 03-025 - 1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc Cy3 항체 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td></td></tr><tr><td> 컨트롤 박스 </td><td> 스탠포드 Microfluidics 주조 </td><td></td></tr><tr><td> 곰팡이 </td><td> 스탠포드 Microfluidics 주조 </td><td></td></tr><tr><td> 핀 </td><td> 뉴 잉글랜드 작은 튜브 주식회사 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore 관 </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> 바이오 로봇 </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> 실리콘 핀 </td><td> 병렬 SYN명제 </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

이러한 시스템 생물학 등 급속도로 증가 분야는 대규모 시스템의 높은 처리량 및 고 충실도 측정을 가능하게하는 새로운 기술의 개발과 구현을 필요로합니다. Microfluidics는 생화학 biophysical 및 셀 기반 assays에게 1 포괄 같은 칩에 높은 처리량 검사 실험을 수행으로 이러한 요구 사항의 많은 부분을 수행하기 위해 약속드립니다. microfluidics 장치의 초기부터,이 필드는 크게 마이크로 대규모 통합 2,3의 개발로 이어지는, 발전하고 있습니다. 이 기술은 우표 크기의 풋 프린트 (그림 1) 단일 장치에 micromechanical 밸브의 수천의 통합 할 수 있습니다. 우리는 PING (단백질 상호 작용 네트워크 생성기)이라는 단백질 어레이 (그림 2)의 체외 식에 생성하기위한 높은 처리량 마이크로 유체 플랫폼을 개발했습니다. 이러한 배열은 많은 실험을위한 템플릿으로 제공 할 수같은 단백질 단백질 4, 단백질 RNA 5 단백질 DNA 상호 작용 6. 이 장치는 개별적으로 microarrayer를 사용하여 프로그램되어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 표준 microarray 야생 기술을 사용하여 microarrays를 생성, 또한 잠재적 인 오염 또는 교차 반응성을 제거 하나의 장소로 microfluidics 장치 프로그램에 이러한 인쇄 microarrays의 각 방을 정렬하면, 단백질 7, DNA 8, 작은 분자의 arraying을 허용하는, 매우 모듈입니다 심지어 콜로이드 현탁액. 생물 과학에 microfluidics의 잠재적 인 영향은 중요하다. microfluidics 기반 assays의 수는 이미 생물학적 시스템의 구조와 기능에 새로운 통찰력을 제공하고, microfluidics 분야는 생물에 영향을 할 것입니다.

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

시스템 생물학과 같이 급격히 성장하는 분야에서는 고속 대량 분석 및 ...을 가능하게 하는 새로운 기술의 개발과 구현이 필요합니다.

본 실험 절차의 전반적인 목표는 정제 단계가 필요 없는 모듈식 단백질 어레이를 제작하여 모든 단백질 라이브러리와 호환 가능하도록 하는 것입니다. 이는 먼저 어셈블리 PCR(assembly PCR)을 통해 합성 유전자를 생성함으로써 달성됩니다. 그다음, 합성 유전자들을 에폭시 슬라이드에 어레이 형태로 배치합니다.실리콘 제어 몰드와 유동 몰드를 사용하여 PDMS로 미세유체 장치를 제작합니다. 그다음, 미세유체 장치를 스폿팅된 DNA 어레이에 맞게 정렬합니다. 마지막으로, 토끼 망상적혈구 용해물을 미세유체 장치 내로 흐르게 하여 단백질을 발현시킵니다.최종적으로, 형광 항체 표지를 통해 수천 개의 단백질 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 마이크로유체 기반 기술을 사용하면 단백질 마이크로어레이와 같은 기존 방법보다 몇 가지 장점이 있습니다. DNA를 마이크로어레이로 제작한 다음, cellis를 사용하여 장치 내에서 단백질을 생성합니다.따라서 단백질 정제가 필요하지 않으며 단백질이 건조되지 않습니다. 단백질은 실험 전반에 걸쳐 신선하게 유지됩니다. 또한 미세유체 기술은 더 높은 민감도를 제공합니다. 미세유체 장치를 제작하려면, 엘라스토머 분리를 촉진하기 위해 실리콘 제어 및 흐름 몰드를 chloro trimethyl silene 증기에 10분 동안 노출시키십시오.베이킹 단계 후, 대조군 몰드와 유동 몰드용으로 각각 5:1과 20:1의 두 가지 다른 비율로 실리콘 기반 엘라스토머와 경화제 혼합물을 준비합니다. 5:1 비율의 PDMS를 대조군 층 위에 붓습니다. 대조군 층의 기포를 제거한 후 80 °C에서 30분 동안 베이킹합니다.다음으로 20:1 비율의 PDMS 혼합물을 유체층 위에 2,600 RPM으로 60초 동안 스핀 코팅한 후, 80 °C에서 30분 동안 굽습니다. SU-8 패턴이 벗겨지지 않도록 주의하며 몰드에서 제어층을 천천히 분리합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 장치의 외곽선을 따라 절단하고, 현미경 하에서 뭉툭한 바늘을 사용하여 제어 채널에 접근하기 위한 구멍을 뚫습니다.왼쪽 상단 모서리부터 시작하여 흐름 층과 제어 층을 수동으로 정렬하고, 제어 층의 버튼 밸브를 반응 챔버 중앙에 배치하십시오. 다음으로 첫 번째 행을 정렬한 후, 제어 층을 한 행씩 조심스럽게 놓습니다. 모든 버튼 밸브가 반응 챔버 중앙에 위치하고, 어드레스 밸브와 입력 밸브가 흐름 채널의 정확한 위치와 교차하는지 확인하십시오.모든 행이 정렬될 때까지 이 과정을 국소적으로 반복합니다. 완전히 정렬되면, 측면과 모서리부터 조심스럽게 들어 올려 PDMS의 장력을 제거합니다. 그 후, 장치를 80 °C에서 2시간 동안 베이킹합니다.주변부를 따라 절단하고 flow mold 펀치 구멍에서 2층 구조의 장치를 벗겨내어, 장치용 DNA 컨스트럭트 생성을 위한 유로(flow channel)에 접근합니다. T7 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome binding site), 양 끝단에 서로 다른 에피토프 태그가 포함된 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 그리고 T7 터미네이터로 구성된 합성 유전자를 생성하기 위해 PCR을 수행합니다. 합성 유전자를 어레이하기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 D-트리오스 이수화물 혼합물을 제조합니다. 384 웰 플레이트의 각 웰에 반응당 2 µL씩 분주합니다.웰 플레이트. 합성 유전자를 384-웰 플레이트에 넣습니다. 그 다음 증류수를 가하여 최종 부피를 20 µL로 맞춥니다.다음으로, 마이크로어레이 스폿을 사용하여 에폭시 코팅된 유리 기판 위에 일련의 합성 유전자를 배치합니다. 실체 현미경 하에서 마이크로유체 장치를 유전자 어레이에 수동으로 정렬하여, DNA 스폿이 DNA 챔버의 중앙에 위치하도록 합니다. 그런 다음 나머지 행들을 일직선으로 맞춥니다.PDMS의 응력을 완화하고 마이크로어레이에 잘 결합되도록 장치 전체를 미세 조정하여 마무리합니다. 국소적으로 들어 올립니다. 마지막으로, 80 °C의 핫플레이트 위에서 하룻밤 동안 배양하여 장치를 유리 슬라이드에 결합합니다.이 섹션에서는 시각화를 위해 식용 색소를 사용합니다. 제어층의 밸브는 LabVIEW를 사용하여 컴퓨터로 작동시킵니다. LabVIEW 스크립트는 전자 제어 박스를 통해 일련의 솔레노이드 마이크로 밸브를 제어합니다.솔레노이드 밸브 매니폴드는 압축 공기에 연결되어 장치 내 제어 밸브로 들어가는 공기 흐름과 압력을 조절합니다. 내경 0.02 inches의 유연한 플라스틱 튜브와 스테인리스 스틸 핀을 사용하여 장치를 솔레노이드 밸브 매니폴드에 연결하십시오. 튜브를 2중 증류수로 채우고 제어층의 액세스 홀에 핀을 삽입하십시오.각 튜브가 해당 제어 채널에 연결되었는지 확인하십시오. 제어 채널을 활성화하려면 LabVIEW 애플리케이션을 실행하고 공기압을 5 PSI로 설정한 후, LabVIEW 스크립트에서 밸브를 활성화하여 공기압을 가합니다. 이렇게 하면 물이 PDMS 제어 채널로 밀려 들어가 결함이 있는 장치의 제어 채널 간에 잠재적인 크로스토크(crosstalk)가 있는지 확인할 수 있습니다.먼저 샌드위치 밸브와 어드레스 밸브를 채웁니다. 제어 채널과 밸브에 물이 모두 채워지면, 밸브를 프라이밍하여 그 아래의 유체 채널을 차단합니다. 우선 공기압을 15 PSI로 높인 다음, 개별 솔레노이드 밸브에 연결된 LabVIEW 프로그램의 온/오프 스위치 세트를 통해 수행합니다.모든 스위치 버튼을 켜서 밸브를 모두 활성화하여 모든 밸브가 열려 있는지 확인합니다. 튜브를 유체 입력구 중 하나에 연결하고, 4~5 PSI의 압력으로 장치에 공기를 흘려보냅니다. 이렇게 하면 유리 슬라이드에 붙어 있던 밸브들이 떨어지게 됩니다.이제 장치의 프라이밍이 완료되어 시각화 준비가 되었습니다. 이 섹션에서는 시약의 흐름을 시각화하기 위해 황색 식용 색소를 사용하며, 무색 용액은 이를 나타냅니다. 표면에서 단백질 어레이의 자가 조립을 촉진하고 미세유체 장치 내의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 표면을 화학적으로 수식하려면, 먼저 필요한 용액이 담긴 새 튜브를 장치의 유로 중 하나에 연결하십시오. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝을 수동 매니폴드에 연결하고 공기압 흐름을 열어주십시오.새 튜브에 biotin elated BSA 40 µL를 넣고, 그 중 약 절반을 장치에 20분 동안 흘려줍니다. 각 단계 사이에 50 mM hippies를 사용하여 반응하지 않은 기질을 씻어냅니다. 다음으로, streptavidin 25 µL를 20분 동안 흘려줍니다.비오틴화 BSA를 처리한 후, 버튼 주변 표면을 처리하기 위해 5분 동안 HEPES로 세척합니다. 버튼 밸브를 닫고 나머지 비오틴화 BSA를 흘려준 다음, 다시 5분 동안 HEPES로 세척합니다. 마지막으로, 버튼 아래에 anti-His tag 어레이를 생성하기 위해 버튼 밸브를 열고 30 µL의 Penta-His biotin을 20분 동안 흘려 장치 위에 단백질 어레이를 형성합니다. 넥 밸브를 열고 rabbit reticulocyte를 흘려줍니다.장치를 통해 DNA 챔버로 빠르게 결합된 전사 및 번역 반응 용액을 주입합니다. 다음으로, 샌드위치 밸브를 닫아 각 유전자를 주변 환경으로부터 분리하고, 핫플레이트 위에서 30 °C로 2.5시간 동안 장치를 배양합니다. 그런 다음 C mix SI three 항체로 단백질의 말단 부위를 표지합니다.마지막으로, 532 nanometer 레이저와 575 nanometer 방출 필터가 장착된 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 단백질 수준을 측정합니다. 이 그림은 단백질 어레이에서 단백질 발현 수준이 다양하게 나타나는 것을 보여줍니다.일반적으로 유전자 라이브러리의 20%는 검출 가능한 수준으로 발현되지 않습니다. 배경 수준은 DNA가 점적되지 않은 챔버를 사용하여 결정되었습니다. 따라서 해당 단백질 챔버에서 나타나는 신호는 노이즈 또는 표지 항체의 비특이적 흡착에 의한 것입니다.적절하게 수행될 경우, 해당 장치 검증에는 4시간이 소요되며 칩 실험에는 5시간이 소요됩니다.

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연구

JoVE Journal

Bioengineering

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