그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내에서 근접 의존성 단백질 비오틴화(proximity dependent protein biotinylation)를 유도하는 단백질 단편 보완 분석법인 split-BioID를 사용하여 관심 있는 한 쌍의 상호 작용 단백질 주위로 특이적으로 조립되는 단백질 복합체의 구성을 조사하는 것입니다. 이 방법은 단백질 복합체가 다양한 세포 기능을 조절하기 위해 동적으로 리모델링하는 방법과 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 네이티브 세포 환경에서 매우 높은 해상도로 상황에 맞는 단백질 복합체를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다.

최종 질량 분석 분석을 위해 다음 단계는 케라틴이 없는 조건에서 수행해야 하며 모든 재료와 시약은 가능한 한 케라틴이 없어야 합니다. 관심 단백질 2개의 ORF를 split-BioID 플라스미드에 클로닝한 후, 일시적인 형질주입을 수행한 후 텍스트 프로토콜에 따라 비오틴 보충 배지를 첨가하고 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 각 플레이트에 1.5 밀리리터의 PBS를 추가하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확 한 다음 각 조건에 대한 세포를 별도의 15 밀리리터 튜브로 옮기고 5 분 동안 1, 200 배 중력 및 섭씨 4도에서 튜브를 회전시킵니다.

상등액을 제거하고 펠릿을 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 그런 다음 추가 처리가 될 때까지 튜브를 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오. 세포 용해물을 준비하려면 1ml의 RT 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 25게이지 바늘에 세포를 10-20회 통과시킵니다. 다음으로 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 2 %의 최종 농도를 위해 회수 된 초음파 용해물 900 마이크로 리터 당 20 % Triton X-100 100 마이크로 리터를 추가합니다.용해물 밀리리터당 50 밀리 몰 트리스 2.3 밀리리터, pH 7.4를 추가하여 NaCl 농도를 150 밀리 몰로 조정하여 streptavidin 비드에 결합합니다.

다음 조정한 lysatates를 1.5 밀리리터 관으로 배부하고 10 분 동안 16의, 000 시간 중력 및 4 섭씨 온도에 그(것)들을 분리기. 상등액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 50 - 100 마이크로리터를 입력 물질로 유지합니다. 스트렙타비딘 풀다운을 수행하려면 각 조건에 대해 200마이크로리터의 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드 현탁액을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.

튜브를 마그네틱 랙에 놓고 보관 버퍼를 제거하기 전에 약 1분 정도 기다립니다. 1ml의 평형 완충액으로 부드럽게 혼합하여 비드를 세척합니다. 그런 다음 평형을 이룬 비드를 필요한 수의 튜브에 고르게 분배하고 마그네틱 랙에 다시 놓습니다.

평형 완충액을 제거한 후, 각 bead set를 동일한 양의 해당 cell lysates로 재현탁합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 온도에서 밤새 회전하는 바퀴에서 샘플을 배양합니다. 다음날 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.

비드가 튜브 측면에 붙을 때까지 기다렸다가 상등액을 flow through라고 표시된 15ml 튜브로 옮깁니다. 200마이크로리터의 세척 버퍼 1을 사용하여 각 튜브에 비드를 재현탁하고 1.5ml 튜브에 한 가지 조건에 해당하는 각 재현탁 비드 세트를 결합합니다. 세척 버퍼 1ml를 사용하여 8분 동안 회전 휠에서 구슬을 두 번 세척합니다.

그런 다음 세척 버퍼 2, 3 및 4에 대해 각각 두 번 세척을 수행합니다. 마지막 세척 단계 후에 세척 버퍼가 완전히 제거되었는지 확인하려면 대부분의 상등액을 제거한 후 샘플을 스핀다운합니다. 그런 다음 마그네틱 랙에 다시 넣고 나머지 버퍼를 제거합니다.

비드에 30마이크로리터의 용리 완충액을 첨가한 다음 섭씨 98도에서 15분 동안 샘플을 배양한 후 즉시 튜브를 마그네틱 랙으로 이동합니다. 용출된 샘플을 새 튜브로 옮기고 추가 처리가 있을 때까지 튜브를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 각 입력 샘플에 대해 총 28마이크로리터 용량의 3X SDS 로딩 버퍼와 동일한 양의 단백질을 적절한 부피로 혼합하여 PAGE 샘플을 준비합니다.

그런 다음 각 용리 시료 5마이크로리터와 3X SDS 로딩 버퍼 2.5마이크로리터를 혼합하여 PAGE 시료를 준비합니다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 샘플을 로드합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 전기영동과 웨스턴 블로팅을 진행합니다.

MS 분석을 위한 SDS-PAGE를 수행하려면 각 용리 시료 18.75마이크로리터에 6.25마이크로리터의 4X 샘플 버퍼를 추가하고 겔 내부로 2-3cm로 이동할 때까지 4-20% 프리캐스트 SDS 겔에서 샘플을 실행합니다. 15cm 페트리 접시에 콜로이드 Coomassie Brilliant Blue G250 염색으로 젤을 염색합니다. 깨끗한 메스를 사용하여 스트렙타비딘 밴드를 제외한 각 샘플의 전체 레인을 절제하고 MS 분석을 위해 절제된 밴드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

BioID, split-BioID 실험에서 확인된 내인성 비오틴화 단백질 외에도, 웨스턴 블롯에 의해 관찰된 추가적인 주요 띠는 자가 비오틴화된 융합 단백질이며, 이는 테스트된 두 단백질, 이 예에서 Ago2 및 TNRC6C 또는 Ago2와 Dicer가 세포에서 상호 작용했음을 나타냅니다. 또한, 웨스턴 블롯의 결과는 NBirA*Ago2 융합 단백질을 TNRC6C 또는 Dicer에 대한 CBirA*융합과 쌍을 이루는 것이 CBirA*Ago2가 다른 두 단백질의 NBirA*융합과 쌍을 이루는 반대 조합보다 더 효율적임을 나타냅니다. 더욱이, CBirA*융합체 중 어느 것도 NBirA*GFP 대조군 융합 단백질을 상당한 수준으로 활성화할 수 없었기 때문에 활성화는 특이적이었습니다.

처음으로 분리를 수행할 때 정제의 모든 단계를 웨스턴 블로팅으로 분석해야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이, 비드에 대한 결합은 거의 정량적이어야 하며 세척 시 누출이 거의 관찰되지 않아야 합니다. 단백질 발현 및 유도된 비오틴닐화 후 용리된 물질을 Coomassie 염색 겔에서 실행할 때 관찰된 가장 강력한 띠는 약 17킬로달톤에서 실행되며 단량체 스트렙타비딘에 해당합니다.

로딩 웰 위의 스트렙타비딘 밴드 위의 샘플 레인 영역은 일반적으로 MS 분석을 위해 절제됩니다. 이 절차를 주어진 두 단백질에 적용하는 동안 융합 단백질의 서로 다른 조합을 테스트하는 것이 중요합니다. 실제로, 전반적인 비오틴화(biotinylation) 효율은 N 또는 C 말단 BirA 단편에 어떤 단백질이 추가되는지에 따라 밀접하게 달라질 수 있다는 것을 종종 관찰했습니다.

적어도 하나의 negative control split-BioID 실험을 추가하는 것도 마찬가지로 중요합니다. 예를 들어, 관심 있는 단백질 쌍과 관련이 없는 상호 작용하는 단백질 쌍에 있습니다. 이 절차와 질량 분석법에 따라 컴퓨터 분석을 적용하여 음성 대조군 실험에 대해 식별된 펩타이드의 점수를 매겨야 합니다.

예를 들어, 우리는 독일 뮌헨에 있는 Cox와 Mann 연구소에서 개발한 MaxQuant 및 Perseus 소프트웨어를 사용합니다.