Name: 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 생세포 내 단백질 복합물을 고해상도로 분석하는 split-BioID 근접 라벨링 기법. 이 방법은 단백질 상호작용을 정확히 식별하여 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 독일 우수 이니셔티브 (CellNetworks DFG 실 81)와 공동 연구 센터 SFB638 부분 회계를 통해 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 융자 되었다.

<ol><li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules%2C+big+targets%3A+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li>
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<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
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<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li>
<li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li>
<li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li>
<li>Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50(2009).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
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<li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
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<li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962(2017).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSITe%3A+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li>
<li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li>
<li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID%3A+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039(2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

개요 절차 플라스 미드, biotinylation 상호 작용 유도 대 한 테스트 하는 방법 및 질량 분석 분석에 대 한 biotinylated 단백질을 분리 하는 방법 분할 BioID에 관심사의 유전자를 복제 하는 방법을 설명 합니다. 여기 과도 transfection에 따라 절차를 설명 합니다. 융해 단백질의 표정은 dox 매체에 추가 금액에 의해 조정 될 수 있다, 그러나 과도 transfection 조잡 한 overexpress 융합 단백질은 내 생에 비교 될 때 일부 셀과 비 균질 단백질 식으로 이어질 수 있습니다. 대조 물입니다. 이 해당 interactomes의 왜곡 하 고 충실 하 게 내 인 성 단백질을 포함 하는 상호 작용을 반영 하지 않는 PPI로 이어질 수 있습니다. 그것은 따라서 일반적으로 분할 BioID 과도 시스템으로 설정 된 후 안정 된 세포를 구성 하는 것이 좋습니다. 플라스 미드 Flp 중재 재결합 시스템과 호환 되며 동일한 tet 응답 요소의 규정의 두 유전자 장소. 필요한 경우, 그리고 호환 포유류 세포와 함께 사용 하는 경우, 안정적인 유도할 수 있는 세포의 쉽게 만들을 수 있습니다. 예를 들어 우리 rtTA 항생물질 활성화 녹음 방송 활성 제와 항생물질 중재 하는 유전자 발현 단단히 규제12수 있는 독특한 대상 게놈 소재 시를 표현 하는 헬러-EM2-11 줄을 사용 합니다. 이 세포 선 및 재결합 Flp 중재를 사용 하 여, 2-3 주 이내는 transgene의 복사본을 하나만 포함 하는 안정적인 셀 라인을 얻을 수 있습니다. 또는, 하나 또한 관심사의 유전자의 네이티브 게놈 loci에 BirA * 조각 소개 현재 게놈 편집 기술을 사용할 수 있습니다.
태그는 단백질에 의존 하는 모든 분석 결과에서 하나 결과 융해 단백질 기능 인지 고려 해야 합니다. 사용할 수 있는 데이터는 관심사의 단백질 (GFP 이미징 연구에 대 한)와 예 태그 기능 테스트는 유용 BirA * 조각 한다 결정을 복제 상류 또는 하류 관심의 유전자. 이러한 데이터를 사용할 수 있는 하나 N 말기 테스트 해야 또는 C 말기 단백질 기능 분석 결과에 태그. 예를 들어 있는 생 단백질 노크 아웃 되었고 야생 타입 상황에 비해 셀 라인에서 융해 단백질의 활동을 테스트할 수 있습니다. 관심사의 단백질 모두 N 및 C 터미널 태그 경우, 둘 다 시험 되어야 한다. 실제로, BioID 실험, 융해 단백질의 방향22라벨의 효율성을 좌우할 수 있다. 또한, 우리는 관찰 그 때 분할 BioID 단백질의 쌍에 적용, 두 단백질의는 추가 중 하나는 NBirA * CBirA * 조각 또한 영향9라벨의 효율성. 분할-BioID 플라스 미드에는 16 아미노산 긴 글리신/떠들고 풍부한 링커 BirA * 조각에 관심사의 단백질을 결합 했다 다른 PCA23 에서 촬영 하 고 모든 상호 작용 단백질에 대 한 우리를 위해 일했다 테스트 했습니다 지금까지. 그러나, 하나는 일부 단백질 쌍 짧은 지 또는 긴지를 링커 함께 잘 작동 수 있습니다 고려해 야 합니다. 최종적인 노트의 또 다른 분석 결과 Bollen 그룹24에 의해 설명 되었다. 이 분석 결과에 BirA * 우리 (E256/G257) 보다 다른 사이트 (E140/Q141)에서 분할 됩니다. 우리 모두 분할 BioID 맛 측면-의해-측면 테스트 한 E256/G257,이 프로토콜에 설명 된 두 개의 상호 작용 단백질에 결합 될 때 더 강한 재 활성화를 이끌어 발견9.
이 방법의 1 개의 일반적인 결점은 라벨의 느린 속도. 일반적으로 6 ~ 24 h 보육 시간 biotin 감지할 수 biotinylation6, 단백질 복합물의 동적 개장 공부에 대 한이 기술의 사용을 제외를 얻을 필요가 있다. 이 분석 결과 부분적으로 상호 작용 하는 두 단백질 활성화만이 경고를 해결, 하는 동안 라벨의 저속 응답 매우 동적 프로세스 또는 짧은 단백질 분석 공부에 대 한 그것의 사용을 배제. 설계 된 과산화 효소 APEX2 1 분3이내 근 단백질의 효율적인 라벨 홍보로 알려져 있다. APEX2에 따라 PCA BioID 파생 분석 실험의 느린 표시 속도 한계를 주소 따라서 수 있습니다. 증거의 원리 연구 같은는 분할 APEX2 분석 결과25설명. 그러나, homodimerizing 단백질은 성공적으로 biotinylated, 증명 남아 여부 분석 결과 또한 사용할 수 있습니다 레이블 및 단백질 단백질 상호 작용의 한 쌍의 주위에 조립 확인 하. 최근 감독된 진화 했다 TurboID 그리고 miniTurbo, 10 분26으로 훨씬 짧은 표시 시간 창을 허용 하는 향상 된 활동의 BirA * 2 개의 이체를 만드는 데 사용 됩니다. 분할-BioID이 새로운 변종에 적응 추가 애플 리 케이 션의 광범위 한 분야에이 기술의 사용을 확장할 것입니다.

대부분 세포 기능 동적으로 조립 고분자 복합물 단백질에 의해 수행 됩니다, 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 식별 생물 의학 연구에서 주요 노력 이다. 실제로, PPI 자주 질병에 폐지 하 고 치료제1에 대 한 잠재적인 목표를 나타냅니다. 가장 널리 사용 되는 메서드 PPI의 식별, 친 화력 정화 (AP) 접근을 위한 세포 세포의 용 해, 관심사의 단백질은 특히 행렬에 정화 하 고 관련된 단백질 질량 분석에 의해 확인 이후에 (MS)입니다. AP-MS는 강력한 접근, 그것은 일반적으로 수행 하지 않습니다 가난 하 게 녹는 단백질 복합물, 아주 일시적인 상호 작용 또는 subcellular 구조를 필요로 하는 PPI에 잘. 또한, 데이터의 해석 단일 단백질은 종종 여러 가지 단백질 복합물의 부분으로 PPI 네트워크의 동적 특성에 의해 복잡 될 수 있습니다.
BioID2 APEX23,4 등 근접 라벨 기술은 최근 AP MS 접근의 제한 사항 중 일부를 해결 하기 위해 개발 되었다. BioID에서 효소 BirA * (에 해당 하는 야생 타입 대장균 효소의 G115R 이체) catalyzes 정한 biotinyl-앰프 (바이오-앰프) 주 아민과 반응의 형성. 야생 타입 효소, 바이오-앰프의 활성 중심에 유지, 반대로 BirA * 해제 바이오 앰프 주변 환경에의 확산을 허용 합니다. 그러므로, 관심사의 단백질을 융합 하 고 셀에 표현, 근 단백질 biotinylated 10 nm5의 예상된 범위 내에서 될 수 있습니다. 이러한 근 위 표시는 다음 streptavidin 풀 다운에 의해 고립 된 단백질과 MS로 식별. AP-MS, 반대로 BioID 융합 단백질의 식이 필요합니다. 그것은 따라서만 적용할 수 있습니다 단백질 누구의 기능 태그 방해 하지. 또한, 라벨의 속도 느린, 일반적으로 6-24 h2,6, 도전 짧은 단백질의 탐지를 만들기. 아직, AP-MS에 비해, BioID MS 제공 합니다 여러 주요 장점: 첫 번째, 그 캡처 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상호 작용 두 번째, 레이블이 단백질 보다는 조립된 단지 세포 세포의 용 해; 다음 격리 됩니다. 셋째, streptavidin pulldowns 변성 버퍼 및 거친 세척 상태를 사용 하 여 허용 합니다. 따라서, 방법은 더 과도 또는 약한 상호 작용7 또는 특정에서 발생 하는 상호 작용에 민감하고 subcellular 구조8을 하드입니다.
그러나, 대부분의 단백질 보통 세포 신호 또는 수행 해야 하는 함수에 개장 수 큰 단지의 일부입니다. 따라서, 단일 단백질은 일반적으로 여러 단지, 뚜렷한 기능 단위에 대응, 고유 포함 및 PPI 중복의 부분 이다. 두 방법 모두 게 주어진된 단백질이 있을 수 있습니다, 모든 협회의 개요를 제공 하지만 그들은 개별 PPI의 상황을 해결 하기 위해 실패 합니다. 후자의 해상도 높이기 위해 설계 된 단백질 조각을 보완성 분석 결과 (PCA)는 2 개의 비활성 파편 BirA * (촉매 도메인에 포함 된 NBirA *, 그리고 CBirA * 재 활성화 도메인으로 볼 수 있는)의 수에 재어셈블 때 가까이에 두는 활성 효소로 단백질9상호 작용. 결과 분할 BioID 분석 결과는 단백질 상호 작용 단백질의 쌍의 주위에 조립 및 따라서 컨텍스트 식별 종속 단백질 어셈블리에 근접 종속 biotinylation을 집중 한다. 우리는 최근 중재 하는 miRNA 유전자 침묵 통로9에 관련 된 두 가지 단백질 복합물을 해결 하 여 분할-BioID의 뛰어난 해상도 파워를 시연.
전부, 단일 및 간단한 분석 결과, 분할 BioID 수 있습니다 발견 하 고 구체적으로 정의 된 기능 단위는 주어진된 단백질 관련, 해당 단백질 복잡 한의 추가 상호 작용 단백질 알려져 제공에 PPI를 할당.

<table><tbody><tr><td>아세트산 (빙하)</td> <td>VWR</td><td>20104.298</td><td>TAE 완충액을 만들려면</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>DNA 분석 및 추출을 위해 TAE- 아가로 오스 젤을 사용하십시오</td></tr><tr><td>암모니아 용액 25 % NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>비오틴을 용해하려면</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>형질전환 된 박테리아를 선택하십시오</td></tr>. <tr><td>Bioruptor plus 초음파 처리 장치</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>다른 초음파 처리 장치도 괜찮습니다</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>효율적인 비오티닐화를 자극하기 위해 성장 배지에 첨가</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V</td><td>Carl Roth</td><td>8076</td><td>Western blot buffers 및 Bradford 분석의 단백질 표준에 사용 Bradford</td></tr><tr><td>Ultra 시약</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>단백질 측정을 위한 다른 방법/키트도 괜찮으며, 이 특정 시약은 다른 Bradford 시약보다 세제에 더 내성이 있습니다</td></tr>. <tr><td>Cell scrappers</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>다른 모델도 괜찮습니다</td></tr>. <tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>다른 세포주를 사용하는 경우 해당 최적 성장 배지</td></tr><tr><td>DNA miniprep kit</td><td>Sigma</td><td>PLN350</td>을 사용하십시오. <td>다른 키트도 괜찮습니다</td></tr>. <tr><td>Doxycycline</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>Dox는 빛에 민감합니다</td></tr>. <tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A2948</td><td>1M 재고 용액 만들기, -20 &deg에서 보관; C 및 항상 새로운</td></tr><tr><td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td><td>Thermo scientific</td><td>21848</td><td>을 사용하여 LiCor 웨스턴 블롯 스캐닝 장치와 함께 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>C1 비드는 BSA로 코팅되어 있지 않아 다운스트림 MS 응용 분야에 선호됩니다(최종 용출 시 BSA 누출 없음)EDTA</td></tr> <tr><td></td><td>Applichem</td><td>A5097</td><td>500 mM 스톡을 만들고 EDTA 분말을 용해시키면서 pH를 8로 조정</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마</td><td>32205</td><td>독시사이클린을 10 mg.mL-1</td></tr> <tr><td>Fastgene Gel/PCR DNA 추출 키트</td>에서 용해할 수 있는 70% 스톡 용액 만들기 <td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>다른 키트도 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>비오틴 스톡 용액 HEPES</td></tr><tr><td></td><td>의 pH를 조정하려면Carl Roth</td><td>6763</td><td>500 mM 스톡 용액을 만들고, pH를 7.4</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF 막, 0.45&nbsp로 조정하십시오; &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>이 멤브레인은 LiCor 웨스턴 블롯 스캐닝 장치 LiCl Gr&uuml과 함께 사용할 때 최소한의 자가형광을 보여줍니다</td></tr><tr><td></td><td>. ssing GmbH</td><td>12083</td><td>Make a 5M stock solution</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 이미징 시스템</td><td>LI-COR</td><td>N/</td><td>A 형광단 표지 항체로 장식된 웨스턴 블롯 멤브레인</td></tr><tr><td>선형 폴리에틸렌민(PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>다른 모든 트랜스펙션 시약도 미세합니다</td></tr><tr><td>분유</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>웨스턴 블롯 멤브레인 MluI-HF</td></tr><tr><td></td><td>를 차단하려면New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>분할 BioID 플라스미드 (NBirA* 융합)로 클로닝을 위한 제한 효소Na</td></tr><tr><td>-데옥시콜레이트</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>10%(w/v) 원액 만들기</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>5M 원액</td></tr><tr><td>NP-40(Nonidet P40 대체)</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td>20%(v/v) 원액 만들기</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>분할 BioID 플라스미드로 복제하기 위한 제한 효소(CBirA* 융합)</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>시그마</td><td>806552</td> PmeI를 <td>폐기하기 전에 세포를 세척하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>분할 BioID 플라스미드(CBirA* 융합)로 복제하기 위한 제한 효소</td></tr>프로<tr><td>테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>단백질을 방지하기 위해 용해 완충액에 첨가 분해</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>Split-BioID 플라스미드는 NBirA*-FKBP 및 CBirA*-FRB의 동시 발현을 매개하며, FKBP 및 FRB는 두 개의 다른 ORF로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>Split-BioID 플라스미드는 FKBP-NBirA* 및 CBirA*-FRB, FKBP 및 FRB는 두 개의 다른 ORF</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_로 대체할 수 있습니다. Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>Split-BioID 플라스미드는 NBirA*-FKBP 및 FRB-CBirA*의 동시 발현을 매개하며, FKBP 및 FRB는 두 개의 다른 ORF로 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Split-BioID 플라스미드는 FKBP-NBirA* 및 FRB-CBirA*의 동시 발현을 매개하며, FKBP 및 FRB는 두 개의 다른 ORF로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity PCR 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>시험될 단백질을 위한 ORF 코딩을 증폭하기 위하여. 다른 모든 열안정성 DNA 중합효소는 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>퀵 ligation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>DNA 단편을 split-BioID 플라스미드로 접합하려면 다른 DNA 결찰 시스템도 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>RunBlue 4-20% SDS 프리캐스트 겔</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>MS 분석을 위한 샘플 실행 시 사용</td></tr><tr><td>RunBlue LDS 샘플 버퍼</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>RunBlue 프리캐스트 겔용 러닝 버퍼</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>20% 재고 용액으로 제공</td></tr><tr><td>무텟 혈청</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>융합 단백질의 기저 발현을 최소화하기 위해 무텟 혈청을 사용합니다.</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td>고속 웨스턴 블로팅 전사 시스템, 다른 모든 전사 시스템도 괜찮습니다</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>적절한 pH(7.4 및 8)로 1M 원액 만들기</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>20%(v/v) 원액 만들기</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>웨스턴 블롯 버퍼에 사용되는 Tween 20은 높은 배경 형광을 유발하므로 블로킹 및 마지막 세척 단계에서 생략해야 합니다.</td></tr></tbody></table>

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-bioid-proteomic 분석

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

기존 친 화력 정화 (AP)를 보완 하기 위해 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 식별에 대 한 접근, 효소는 살아있는 세포에 있는 단백질의 근접-종속 라벨 수 있도록 도입 되었습니다. 하나 같은 효소, BirA * (BioID 접근에서 사용), 중재 약 10의 범위 내에서 단백질의 biotinylation nm. 그러므로, 관심사의 단백질을 융합 하 고 셀에 표현, 그것은 그들의 네이티브 환경에서 근 단백질의 라벨 수 있습니다. 조립된 단백질 복합물의 정화에 의존 하는 AP, 반대로 BioID 아무리 여부 그들은 여전히와 상호 작용 하 관심사의 단백질 들은 고립 된 세포 내에서 표시 된 단백질을 감지 합니다. 이후 biotinylates 근 단백질, 하나 그들을 매우 효율적으로 biotin에 streptavidin의 뛰어난 선호도에 투자 또한 수 있습니다. BioID 식별 과도 또는 약한 상호 작용에 대 한 AP 보다 더 나은 수행 하는 동안 두 AP 및 BioID 질량 분석 방법 주어진된 단백질이 있을 수 있습니다 모든 가능한 상호 작용에 대 한 개요를 제공 합니다. 그러나, 그들은 각 확인 된 PPI의 맥락에서 정보를 제공 하지 않습니다. 실제로, 대부분의 단백질 일반적으로 뚜렷한 성숙 단계 나 다른 기능 단위에 해당 하는 여러 단지의 일부입니다. 두 방법의 일반적인 제한이를 해결 하기 위해 우리 BirA * 효소에 따라 단백질 조각 보완성 분석 결과 설계 했습니다. 이 분석 결과에 BirA *의 2 개의 비활성 파편 수 때 가까운 근접에서 있는 그들은 융합 하는 두 개의 상호 작용 단백질에 의해 활성 효소로 재조 립. 결과 분할 BioID 분석 결과 따라서 단백질 단백질 상호 작용의 한 쌍의 주위에 조립의 라벨 수 있습니다. 이 두 가지는 주어진 컨텍스트에서 상호, 제공 분할 BioID 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 특정 컨텍스트에 종속 기능 단위 분석을 다음 수 있습니다. 여기, 우리는 테스트 하 고 분할-BioID 상호 작용 단백질의 쌍에 적용 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다.

어떻게이 방법은, Ago2, 단백질의 열려있는 독서 프레임 (ORFs) 설명 하기 위해 TNRC6C 및 Dicer (모든 통로 입을 미르 중재 하는 유전자에 관련 된) 분할 BioID 플라스 미드에 복제 되었다. Ago2는 미르 유도 입을 단지 내 (miRISC)를 번역 명과 TNRC6C 상호 작용 및 대상 mRNAs14의 자극으로 알려져 있다. MiRISC, Ago2를 조립 하기 전에 Dicer, 성숙한 miRNAs는 그것 미르15로드 받을 수 있습니다 단지 내를 생성 하는 효소와 상호 작용. 따라서 분할 BioID Ago2/Dicer 쌍 또는 Ago2/TNRC6C 쌍에 적용 되었습니다. 테스트 단백질의 각 쌍에 대 한 Ago2 중 NBirA * 또는 CBirA * 우리의 분할 BioID 플라스 미드 (그림 2)를 사용 하 여 융합 Dicer와 TNRC6C는 해당 동족 BirA *를 조각 했다. 또한, 각 단백질에 CBirA * 융합 되었고와 NBirA *-부정적인 컨트롤로 GFP 융해. 이 테스트 단백질 (표 1)의 각 쌍에 대 한 4 개의 반복 테스트 결과.
분할 BioID 테스트 단백질의 쌍의 상호 작용에 따라 활성화 되어 있는지 여부를 테스트 하려면 우리는 그림 1에 표시 된 구성표를 따 랐 다. 플라스 미드는 tet 시스템 호환 HeLa 세포 라인에 페 뚜렷이 했다. 융해 단백질의 표정 doxycycline (dox)와 유도 되었다 그리고 biotinylation 성장 매체를 초과 biotin을 추가 하 여 자극 했다. Dox와 biotin 20 h 보육 시간, 다음 셀 lysed 되었고 서 부 럽 활용된 streptavidin를 사용 하 여 biotinylated 단백질을 검출 하 여 분석. 포유류 세포에서 두 주요 밴드 활용된 streptavidin untransfected 샘플 (그림 3, 별)에 의해 일반적으로 검색 하 고 endogenously biotinylated 단백질 (대부분의 아마 미토 콘 드 리아 carboxylases)에 해당. 이 두 밴드가 모든 샘플에는 내부 로드 컨트롤으로 편리 하 게 사용할 수 있습니다, 그리고 따라서, 동일한 단백질의 로딩을 제어 하는 가사 단백질의 검출은 불필요. BioID/분할-BioID 실험에 대 한 일반적인, 관찰 될 수 있다 추가 주요 밴드는 자체 biotinylated 있어 융해 단백질. 다른 biotinylated 단백질을 볼 경우에 이미이 단계에서 융합 단백질의 biotinylation를 감지 두 테스트 단백질 세포에 상호 작용을 나타냅니다. 그림 3에 표시 하는 실험에서 그것은 NBirA *는 데 분명-CBirA * TNRC6C 또는 Dicer 융해와 Ago2 융합 단백질에는 CBirA * 반대 조합 보다 더 효율적입니다-Ago2 NBirA * 다른 2의 융해를 결합 하 여 단백질 (그림 3, 위쪽 패널, 차선 2-3 차선 6-7의 농도 비교). 또한, 활성화 했다 특정 CBirA * 융해의 없음 활성화 수 NBirA *-GFP 제어 융합 단백질 감지할 수 수준 (그림 3, 비교 레인 1, 4-5 untransfected 세포에 해당 하는 8 레인). 와 있기 때문에 우리의 플라스 미드 NBirA * myc 태그 CBirA * 플래그 태그 (그림 2)는, 이러한 두 태그 (그림 3, 하단 패널)에 대 한 항 체와 각 융해 단백질의 표정 수준은 분석할 수 있습니다.
상호 작용 유도 biotinylation, 관찰 실험, 조정 될 수 있다 고 biotinylated 단백질 프로토콜 (그림 4)의 제 4에에서 표시 된 대로 streptavidin 결합 된 구슬에 격리. 처음으로 격리를 수행할 때 서쪽 더 럽 히 (그림 5) 정화의 모든 단계를 분석할 수 있습니다. 일반적으로, 바인딩 구슬에는 거의 양적 고 거의 통해 아무 누출은 세척 관찰 한다. 이전 질량 분석을 위한 샘플 처리, 유도-biotinylation 예상 대로 작동 하 고 융합 단백질 표현 되었다 서쪽 오 점 실행 권장 합니다. 표현의 융해 단백질의 부족 가난한 transfection 효율 또는 결함이 dox 유도 중 하나 이다. 융해 단백질 표현 되었다 그러나 아무 biotinylation 관찰, 경우 초과 biotin (50 μ M) 매체에 실제로 추가 했다 하 고 주식 biotin 여전히 활성 상태 인지 확인 합니다. Eluted 소재 Coomassie 스테인드 단백질 젤 (그림 6)에 일반적으로 분석은, 관찰 될 강한 밴드 약 17 kDa에 실행 하 고 해당 단위체 streptavidin 하. 밴드 내 생 biotinylated 단백질 및 융합 단백질에 해당 하는 또한 관찰 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 streptavidin 밴드 잘 로딩 (그림 6)까지 위의 샘플 레인의 영역을 삭제할. 삭제 밴드 1.5 mL 튜브에 저장 하 고 질량 분석 시설에 보낼 수 있습니다. 또는 바운드 단백질 결합 하는 streptavidin 구슬에 트립 신 소화 수도 있습니다 하 고 열을 형성 하는 eluted 소화 펩 티 드. 우리가 일상적으로 MaxQuant 소프트웨어16 (주로 기본 매개 변수를 사용 하 여 및 참조 9 및 일반적인 MS 결과 대 한 자세한 내용은 참조 가능한 포스트 번역 상 수정 추가 리 biotinylation,)를 사용 하 여 MS 원시 데이터를 분석 하 고 페르세우스 스위트17 후속 통계 분석을 위해 모두 자유 소프트웨어. 샘플 3 개의 생물 복제에 일반적으로 실행 됩니다. 레이블 없는 정량화를 사용 하 여, 특히 농축된 단백질 제어 상태에 확인할 수 있습니다. Endogenously biotinylated 단백질 및 단백질 비 특히 BirA * 효소에 의해 표시를 필터링 하려면 우리만 크게 6 없는 단백질 생성 된 6 개의 데이터 집합에서 히트 이상의 농축 단백질을 고려 하십시오. 또한, 우리는 NBirA * 퓨전 단백질 대체 되었다 NBirA * 분할 BioID 데이터 집합을 통해 풍성 하 게 안타 고려-GFP. 특히 세포 배양 (SILAC) 양이 많은 proteomics18아미노산 안정 동위 원소 라벨을 사용 하 여 다른 데이터 분석 전략 제안 되었습니다. 또한, 다양 한 전략의 biotinylated 펩 티 드를 사용 하 여 streptavidin 변종 약화 선호도 biotin18, 유기 용 제19 또는 biotin을 사용 하 여 특별 한 차입 조건을 직접 격리에 대 한 설명 되었습니다. 항 체20,21. 반드시 더 많은 단백질의 발견에 지도, 하는 동안 안타의 특이성으로 더 많은 자신감을 추가 하는 biotinylation 사이트의 식별 하 고 유용 때 상호 작용의 토폴로지를 주소입니다.
<img alt="단백질체 분석 워크플로우: Split-BioID, 클로닝, 형질감염, 비오티닐화, MS, 웨스턴 블롯." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 분할 BioID 절차의 개요. 단백질 1 상호 작용 단백질 2 복잡 한 A의 한 부분으로 또는 복잡 한 b.의 한 부분으로 단백질 3 특별히 복잡 한 A의 구성, 분할 BioID 단백질 1와 2에 적용할 수 있습니다. 질량 분석기의 사진 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시-공유 모두 3.0 Unported 라이센스 이며 https://commons.wikimedia.org ThermoScientificOrbitrapElite.JPG의 파일 이름에서 다운로드 한. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="제한 부위 BamHI, MluI, ClaI가 있는 유전자 편집 플라스미드 맵; 복제 설정을 위한 다이어그램입니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 분할 BioID 플라스 미드의 식 카세트. 4 개의 플라스 미드 NBirA * 및 CBirA * 융해 단백질의 모든 조합을 테스트할 수 있도록 제공 합니다. 플라스 미드 및 완전 한 지도 표시 번호 addgene.org에서 사용할 수 있습니다. 플라스 미드 tet 응답 요소 (7 x tetO) 및 tet 식 시스템과 호환 되는 셀 라인에 사용 해야. 또한 모든 플라스 미드에 ORFs의 FKBP와 FRB는 융합 NBirA * 및 CBirA * 조각 각각 note. Rapamycin의 존재만이 두 가지 단백질 작용 하 고 따라서 신속 하 게이 화학9의 유무에 시스템을 테스트 하는 플라스 미드를 사용할 수 있습니다. 표시 제한 사이트 독특합니다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="단백질 전기영동 결과; 항체를 사용한 Dicer, TNRC6C, Ago2의 웨스턴 블롯 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 분할 BioID 실험에 대 한 전형적인 서쪽 오 점. 상단 패널: 붙일 레이블된 streptavidin와 biotinylated 단백질의 검출. 하단 패널: 안티 Myc 및 반대로 플래그 항 체 융합 단백질의 검출. 단백질의 2 개 쌍에서 시험 되었다: Ago2/TNRC6C 및 Ago2/Dicer. 2 &amp; 3 차선에서 Ago2 CBirA * 조각에 추가 했다. 레인 6 &amp; 7, Ago2 NBirA * 조각에 추가 했다. 중요 한 신호 때 세 가지 단백질의 결합 했다 NBirA * 관찰 되었다-GFP (레인 1, 4-5). 별 내부 로드 컨트롤로 사용할 수 있는 endogenously biotinylated 단백질에 해당 하는 밴드를 나타냅니다. 이 그림은 그림 5B Schopp 외 의에서 적응 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시 4.0 국제 라이센스 하에서 9 . <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="마그네틱 비드를 사용한 세포 정제 워크플로; SDS-PAGE 결과; 단백질 분석 방법." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: streptavidin 풀 다운 절차의 개요. 질량 분석 분석에 대 한 biotinylated 단백질의 격리에 대 한 주요 단계 묘사 된다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="SDS-PAGE 단백질 정제 결과, 접합-스트렙타비딘 상호작용, 전기영동 젤." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: streptavidin 풀 다운 실험에 대 한 전형적인 서쪽 오 점. 표시 된 각 샘플의 볼륨을 동등 했다 SDS polyacrylamide 젤에 로드 된. 부 럽, 다음 biotinylated 단백질 결합 하는 HRP streptavidin과 감지 했다. NBirA *에 해당 하는 밴드-TNRC6C 및 CBirA *-Ago2 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="SDS-PAGE 겔, 단백질 밴드 분리, Split-BioID, 스트렙타비딘, 분자량 마커." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 질량 분석 분석에 대 한 일반적인 Coomassie 스테인드 단백질 젤. 결합 하는 streptavidin 구슬에서 eluted 샘플 캐스트 단백질 젤에 로드 하 고 샘플 2-3 cm를 마이그레이션할 때까지 실행 했다. 약 17 kDa에서 본 주요 밴드 streptavidin 이다. 바로 그 밴드 위에 지역 excised 이며 질량 분석 시설에 보낸. NBirA *에 해당 하는 밴드-TNRC6C 및 CBirA *-Ago2 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transfection 샘플</td>
			<td colspan="3">테스트 조건</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">아니 transfection</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 일반적으로 2 개의 단백질에 분할-BioID를 적용할 때 조건을 테스트.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시퀀싱 뇌관</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>카세트 1 역 뇌관 (CBirA * 퓨전)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>카세트 2 역 뇌관 (NBirA * 퓨전)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 시퀀싱 분할 BioID 플라스 미드를 위한 뇌관.

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내에서 근접 의존성 단백질 비오틴화(proximity dependent protein biotinylation)를 유도하는 단백질 단편 보완 분석법인 split-BioID를 사용하여 관심 있는 한 쌍의 상호 작용 단백질 주위로 특이적으로 조립되는 단백질 복합체의 구성을 조사하는 것입니다. 이 방법은 단백질 복합체가 다양한 세포 기능을 조절하기 위해 동적으로 리모델링하는 방법과 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 네이티브 세포 환경에서 매우 높은 해상도로 상황에 맞는 단백질 복합체를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다.최종 질량 분석 분석을 위해 다음 단계는 케라틴이 없는 조건에서 수행해야 하며 모든 재료와 시약은 가능한 한 케라틴이 없어야 합니다. 관심 단백질 2개의 ORF를 split-BioID 플라스미드에 클로닝한 후, 일시적인 형질주입을 수행한 후 텍스트 프로토콜에 따라 비오틴 보충 배지를 첨가하고 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 각 플레이트에 1.5 밀리리터의 PBS를 추가하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확 한 다음 각 조건에 대한 세포를 별도의 15 밀리리터 튜브로 옮기고 5 분 동안 1, 200 배 중력 및 섭씨 4도에서 튜브를 회전시킵니다.상등액을 제거하고 펠릿을 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 그런 다음 추가 처리가 될 때까지 튜브를 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오. 세포 용해물을 준비하려면 1ml의 RT 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 25게이지 바늘에 세포를 10-20회 통과시킵니다. 다음으로 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 2 %의 최종 농도를 위해 회수 된 초음파 용해물 900 마이크로 리터 당 20 % Triton X-100 100 마이크로 리터를 추가합니다.용해물 밀리리터당 50 밀리 몰 트리스 2.3 밀리리터, pH 7.4를 추가하여 NaCl 농도를 150 밀리 몰로 조정하여 streptavidin 비드에 결합합니다.다음 조정한 lysatates를 1.5 밀리리터 관으로 배부하고 10 분 동안 16의, 000 시간 중력 및 4 섭씨 온도에 그(것)들을 분리기. 상등액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 50 - 100 마이크로리터를 입력 물질로 유지합니다. 스트렙타비딘 풀다운을 수행하려면 각 조건에 대해 200마이크로리터의 스트렙타비딘 결합 마그네틱 비드 현탁액을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.튜브를 마그네틱 랙에 놓고 보관 버퍼를 제거하기 전에 약 1분 정도 기다립니다. 1ml의 평형 완충액으로 부드럽게 혼합하여 비드를 세척합니다. 그런 다음 평형을 이룬 비드를 필요한 수의 튜브에 고르게 분배하고 마그네틱 랙에 다시 놓습니다.평형 완충액을 제거한 후, 각 bead set를 동일한 양의 해당 cell lysates로 재현탁합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 온도에서 밤새 회전하는 바퀴에서 샘플을 배양합니다. 다음날 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.비드가 튜브 측면에 붙을 때까지 기다렸다가 상등액을 flow through라고 표시된 15ml 튜브로 옮깁니다. 200마이크로리터의 세척 버퍼 1을 사용하여 각 튜브에 비드를 재현탁하고 1.5ml 튜브에 한 가지 조건에 해당하는 각 재현탁 비드 세트를 결합합니다. 세척 버퍼 1ml를 사용하여 8분 동안 회전 휠에서 구슬을 두 번 세척합니다.그런 다음 세척 버퍼 2, 3 및 4에 대해 각각 두 번 세척을 수행합니다. 마지막 세척 단계 후에 세척 버퍼가 완전히 제거되었는지 확인하려면 대부분의 상등액을 제거한 후 샘플을 스핀다운합니다. 그런 다음 마그네틱 랙에 다시 넣고 나머지 버퍼를 제거합니다.비드에 30마이크로리터의 용리 완충액을 첨가한 다음 섭씨 98도에서 15분 동안 샘플을 배양한 후 즉시 튜브를 마그네틱 랙으로 이동합니다. 용출된 샘플을 새 튜브로 옮기고 추가 처리가 있을 때까지 튜브를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 각 입력 샘플에 대해 총 28마이크로리터 용량의 3X SDS 로딩 버퍼와 동일한 양의 단백질을 적절한 부피로 혼합하여 PAGE 샘플을 준비합니다.그런 다음 각 용리 시료 5마이크로리터와 3X SDS 로딩 버퍼 2.5마이크로리터를 혼합하여 PAGE 시료를 준비합니다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 샘플을 로드합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 전기영동과 웨스턴 블로팅을 진행합니다.MS 분석을 위한 SDS-PAGE를 수행하려면 각 용리 시료 18.75마이크로리터에 6.25마이크로리터의 4X 샘플 버퍼를 추가하고 겔 내부로 2-3cm로 이동할 때까지 4-20% 프리캐스트 SDS 겔에서 샘플을 실행합니다. 15cm 페트리 접시에 콜로이드 Coomassie Brilliant Blue G250 염색으로 젤을 염색합니다. 깨끗한 메스를 사용하여 스트렙타비딘 밴드를 제외한 각 샘플의 전체 레인을 절제하고 MS 분석을 위해 절제된 밴드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다.BioID, split-BioID 실험에서 확인된 내인성 비오틴화 단백질 외에도, 웨스턴 블롯에 의해 관찰된 추가적인 주요 띠는 자가 비오틴화된 융합 단백질이며, 이는 테스트된 두 단백질, 이 예에서 Ago2 및 TNRC6C 또는 Ago2와 Dicer가 세포에서 상호 작용했음을 나타냅니다. 또한, 웨스턴 블롯의 결과는 NBirA*Ago2 융합 단백질을 TNRC6C 또는 Dicer에 대한 CBirA*융합과 쌍을 이루는 것이 CBirA*Ago2가 다른 두 단백질의 NBirA*융합과 쌍을 이루는 반대 조합보다 더 효율적임을 나타냅니다. 더욱이, CBirA*융합체 중 어느 것도 NBirA*GFP 대조군 융합 단백질을 상당한 수준으로 활성화할 수 없었기 때문에 활성화는 특이적이었습니다.처음으로 분리를 수행할 때 정제의 모든 단계를 웨스턴 블로팅으로 분석해야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이, 비드에 대한 결합은 거의 정량적이어야 하며 세척 시 누출이 거의 관찰되지 않아야 합니다. 단백질 발현 및 유도된 비오틴닐화 후 용리된 물질을 Coomassie 염색 겔에서 실행할 때 관찰된 가장 강력한 띠는 약 17킬로달톤에서 실행되며 단량체 스트렙타비딘에 해당합니다.로딩 웰 위의 스트렙타비딘 밴드 위의 샘플 레인 영역은 일반적으로 MS 분석을 위해 절제됩니다. 이 절차를 주어진 두 단백질에 적용하는 동안 융합 단백질의 서로 다른 조합을 테스트하는 것이 중요합니다. 실제로, 전반적인 비오틴화(biotinylation) 효율은 N 또는 C 말단 BirA 단편에 어떤 단백질이 추가되는지에 따라 밀접하게 달라질 수 있다는 것을 종종 관찰했습니다.적어도 하나의 negative control split-BioID 실험을 추가하는 것도 마찬가지로 중요합니다. 예를 들어, 관심 있는 단백질 쌍과 관련이 없는 상호 작용하는 단백질 쌍에 있습니다. 이 절차와 질량 분석법에 따라 컴퓨터 분석을 적용하여 음성 대조군 실험에 대해 식별된 펩타이드의 점수를 매겨야 합니다.예를 들어, 우리는 독일 뮌헨에 있는 Cox와 Mann 연구소에서 개발한 MaxQuant 및 Perseus 소프트웨어를 사용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 생세포 내 단백질 복합물을 고해상도로 분석하는 split-BioID 근접 라벨링 기법. 이 방법은 단백질 상호작용을 정확히 식별하여 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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