의 단백질 단지의 식별 대장균 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 실험의 목적은 단백질, 단백질 상호 작용 및 대장균의 네이티브 MultiPro 복합체의 소단위 구성을 식별하는 것입니다. 이는 염기서열 특이적 선형 PCR 산물을 증폭하고, SPA 태그 및 선택 가능한 마커를 인코딩하여 달성되며, 이는 박테리아 Fage lambda 재조합 시스템을 사용하여 ddy 3, 3 0 배경에서 카르복시 말단 융합으로 프레임에 통합되고 표현되며, 2단계 2단계 정제는 암소 모들린 및 Anti-Flag 친화성 비드를 사용하여 수행되어 저농도 단백질 복합체를 효율적으로 회수합니다. 다음으로, cow modlin, elution buffer 또는 CEB로 암시된 결합된 단백질을 trypsin으로 분해하고 단백질 식별을 위해 질량 분석법으로 처리합니다.

얻어진 결과는 전사 종결을 포함한 코어 RNA 중합효소의 여러 소단위체가 태그가 지정된 RNA 중합효소 소단위 D 단백질로 효율적으로 정제되었음을 보여주며, 이는 이 접근 방식을 사용하여 새로 연결된 구성 요소를 효율적으로 밝힐 수 있음을 나타냅니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 대규모 배양에서 저농도 및 고농도 부담 복합체의 효율적인 회수를 보장하기 위해 적절한 완충 용액으로 세포 용해물을 신중하게 처리하는 것이 절대적으로 필요한 두 가지 라운드 친화성 정제에 어려움을 겪을 수 있습니다. 친화성 정제 및 질량 분석 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 두 기술자인 Olga Kagan과 HBO guo가 될 것입니다. 이 프로토콜은 서면 프로토콜에 설명된 대로 Lambda red 재조합 기계가 발현되는 DDY 30 균주에 대한 특정 증폭된 서열을 표적화하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 섭씨 32도의 Luria bati 2밀리리터 또는 LB 배지에서 밤새 균주를 발현하는 박테리아 파지 람다 재조합 시스템이 다음날 180RPM으로 진탕하는 경우, 500밀리리터 원뿔형 플라스크에서 70밀리리터의 신선한 LB 배지에 1밀리리터의 하룻밤 배양을 접종합니다. OD 32가 약 180에 도달할 때까지 600RPM으로 흔들어 섭씨 32도에서 접종물을 성장시킵니다. 섭씨 42도의 수조에서 180RPM으로 15분 동안 부드럽게 흔들어 플라스크를 배양하여 세포를 유도합니다.

유도 직후, 플라스크를 얼음물 슬러리 욕조에서 최소 30분 동안 흔들면서 배양합니다. 서면 절차에 설명된 대로 세포를 수확하고 세척한 후 Reese는 세포 펠릿을 700마이크로리터의 얼음, 차갑고 멸균된 물에 현탁시켜 전기천공을 통해 전기 적격 세포를 만듭니다. 1마이크로리터의 정제된 앰플리콘을 40마이크로리터의 전기 적격 세포에 주입합니다.

세포는 상동 재조합 및 통합 후에 전기천공됩니다. 태그 슬래시 카세트를 염색체로 성공적으로 재결합한 형질전환체는 캔 마이신에 대한 내성을 기반으로 선택되며, SPA 태그의 플래그 에피토프에 대해 선택적인 Anti-Flag M 2개의 항체를 가진 SPA 태그 융합 단백질의 올바른 생성을 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 위한 다중 트랜스포머를 선택하고, 10ml의 하룻밤 배양을 990ml의 신선한 결핵으로 옮깁니다. 4리터 플라스크에 캔 마이신(mycin) 밀리리터당 25마이크로그램이 보충

OD 600이 2-3에 도달할 때까지 5-6시간 동안 250RPM에서 지속적으로 흔들면서 섭씨 32도에서 배양물을 배양합니다. 1리터 e coli SPA 태그 배양액을 원심분리 병을 세척하고 섭씨 4도에서 15분 동안 3, 993회 G로 세포를 회전시킵니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포를 현탁시킨 후.

초음파 처리를 위해 얼음 위에 놓인 멸균 스테인리스 스틸 컵으로 샘플을 옮깁니다. 프로브를 샘플에 담그고 3분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 초음파 용해물의 원심 분리 후 과열로부터 샘플을 냉각시키기 위해 추가로 2 분 동안 기다립니다.

원심분리 튜브의 S 상등액을 50ml 폴리프로필렌 팔콘 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결하고 나중에 사용할 수 있도록 초음파 처리된 냉동 세포 추출물을 섭씨 영하 80도에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 튜브를 찬물에 넣어 냉동 초음파 처리 세포 추출물에 대한 친화성 정제를 시작하려면 TH 세포 추출물을 섭씨 4도에서 30분 동안 뉴클레아제인 벤조(benzo) 3마이크로리터로 배양합니다.

이 혼합물에 비이온 세제 Triton X 100 및 Anti-Flag M 두 개의 농업 비드의 200 마이크로 리터 현탁액을 첨가하십시오. 3 시간의 교체 후에 4 섭씨 온도에 3 시간 동안 관을 자전해서 내용을 온화하게 섞고, 6 분 동안 1, 700 시간 G에 관을 원심 분리하십시오. 원심분리 후 느슨한 속도의 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 세이트를 조심스럽게 제거합니다.

나머지 SNA에 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 폴리프로필렌 분취 컬럼으로 옮깁니다. 용출액이 중력에 의해 배출될 수 있도록 컬럼의 하단 배출구 플러그를 제거합니다. 흐름. 다음으로, 200마이크로리터의 1회 FC 완충액으로 컬럼을 5회 세척하고 서면 프로토콜에 설명된 대로 TEV로 Cleve를 진행합니다.

기둥의 위쪽과 아래쪽 모두에서 빠르게 분열을 단단히 따릅니다. 하룻밤 회전 후 섭씨 4도에서 밤새 회전하여 컬럼의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 상단 캡과 하단 플러그를 새 컬럼에 제거하여 용리액을 배출합니다.

400마이크로리터의 1 x cal Modlin 결합 버퍼와 150마이크로리터의 Cal Modlin 결합 비드 현탁액으로 기존 컬럼을 세척합니다. 결합된 단백질을 50 마이크로리터의 4개 분획으로 새로운 eend orph tube에서 용리시킵니다. 1개의 x cal Modlin 용리 완충액 사용.

용리된 분획을 동일한 부피로 두 개의 깨끗한 eend orph 튜브에 분배합니다. 그런 다음 속도 진공 청소기를 사용하여 두 튜브의 내용물을 건조시킵니다. 한 튜브에서 건조된 용출액은 텍스트에 설명된 대로 은 염색 젤을 실행하는 데 사용되며 다른 튜브는 섭씨 영하 80도에서 보관됩니다.

향후 질량 분석법에 사용하기 위해 건조된 샘플에 50마이크로리터의 분해 완충액과 0.9마이크로리터의 100밀리몰 트리스 포스핀 염산을 첨가하여 혼합물을 환원 단계를 위해 실온에서 45분 동안 배양합니다.다음으로, 1마이크로리터의 500밀리몰 IDO 아세트아미드를 추가하고 어둠 속에서 40분 더 배양합니다. 샘플 알킬화를 허용하려면 두 번째 배양 후 혼합물에 1마이크로그램의 트립을 추가합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 5시간 동안 또는 배양 후 실온에서 밤새 배양합니다.

1마이크로리터의 아세트산을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 그런 다음 펩타이드를 팁 파이프 펩에 효율적으로 결합하기 위해 텍스트에 설명된 대로 Millipore 지퍼 팁, 피펫 팁을 준비합니다. 펩타이드 혼합물을 20 번 혼합하고 세척 용액을 흡입하고 분배하여 팁에 한 펩타이드 혼합물을 씻어 내십시오.

결합된 펩타이드가 포함된 팁이 있는 팁에 펩타이드 혼합물이 효율적으로 결합되도록 이 절차를 두 번 반복합니다. 10마이크로리터의 습윤 및 평형 용액을 흡입하고 깨끗한 eend orph 튜브에 분배합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.

용출된 시료를 진공 상태에서 건조시킨 후 시료를 질량 분석법으로 즉시 분석하거나 사용하기 전에 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 이 절차에 사용된 마이크로 컬럼은 약 10cm의 3미크론 달 C 18 수지로 충전되어 있으며 orbitrap 기기와 일직선상에 배치된 프로 Zion 나노 전기분무 이온 소스에 인터페이스됩니다. 프로 Zion 나노 플로우 바이너리 HPLC 펌프는 펩타이드 분리 중에 분당 약 300나노리터의 안정적인 팁 유속을 제공하는 데 사용되어 펩타이드 희석을 달성하고 시료 복잡성에 따라 유기 완충액 구배를 설정합니다.

이 대장균 SPA 샘플의 경우, 이동상 용매 A는 95%HPLC 구배수와 0.1%포름산이 포함된 5%아세토 니트릴을 갖는 반면, 용매 B는 5%HPLC 구배수와 0.1%포름산이 포함된 95%아세토 니트릴을 가지고 있습니다. 질량 분석법 후 대장균 단백질 염기서열 데이터베이스에 대해 Seaquest와 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용하여 스펙트럼을 검색합니다. 알파 베타 및 베타 프라임 서브유닛을 포함한 핵심 RNA 중합효소와 RNA 중합효소 재활용 인자로 특이적으로 정제된 SPA 태그 RNA 중합효소 시그마 인자와 알 수 없는 기능의 야크 LA 단백질을 모두 낮은 거짓 발견률을 보장하기 위해 star quest와 같은 확률 알고리즘을 사용하여 결과를 통계적으로 필터링합니다. 태그가 지정된 RNA 중합효소 시그마 인자와 대조적으로, yak L은 필수 전사 종결 결정 방지 인자에 추가로 결합되어 전사의 특수 기능을 시사합니다.

RNA 중합효소 Omega subunit 및 전사, 종결 및 결정 인자, USA 및 NUSD를 포함하여 겔에서 명백하지 않은 몇 가지 다른 더 작은 co purifying 단백질도 LCMS에 의해 검출되었습니다. 반대로, 유황 기계의 동원이라는 태그를 붙인 독립적인 실험에서 S-U-F-B-S-U-F-C 및 SUFD는 서로 함께 정제되어 철 유황 클러스터 생합성에 단일 비계 복합체로 공동 참여함을 나타냅니다. 이 대표적인 예는 이전에 잘 연구되고 필수 생물학적 과정에 참여하는 고도로 주석이 달린 박테리아 MultiPro 복합체가 종종 효율적으로 식별할 수 있는 새로운 관련 구성 요소를 가지고 있다는 사실을 강조합니다.

이 접근법을 사용하여, SUFB 단백질의 낮은 복제 수는 안정적인 다중 단위 단백질 복합체의 조성을 정의하기 위해 SUFC 및 SUFD 풀다운 실험에서 관찰된 강한 강도에 비해 약한 신호 강도를 초래할 수 있으며, co-purification 점수는 미끼 먹이의 고유성을 고려하여 높은 신뢰도 상호 작용에 할당되었습니다. 미끼 미끼와 먹이 먹이 관계. 그런 다음 markoff 클러스터링 알고리즘과 같은 그래프 클러스터링 절차를 사용합니다. 이산 단백질 클러스터는 분할된 확률적 PPI 네트워크에서 식별됩니다.

추정 상호 작용 네트워크는 cyto scape를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 단백질체학 데이터와 유전체학 방법으로 추론된 추가 기능적 연관 증거를 결합하여 이전에 주석이 달린 대장균 단백질의 새로운 기계론적 역할을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 더 넓은 기능적 이웃으로 참여하는 단백질 복합체와 기능 모듈의 서브넷이 대장균으로 정의되었습니다.

주요 계층적 클러스터인 Graham은 기능적으로 고아 유전자와 특성화된 대장균 유전자에 대한 기능적 예측 및 기존 주석의 패턴을 보여주며, 노란색 및 파란색은 각각 기존 함수와 추론된 기능을 나타내고 음영 강도는 신뢰 점수를 반영합니다. 다양한 이웃과 관련된 생물학적 과정은 오른쪽에 표시되며, 삽입물은 통합된 물리적 및 기능적 상호 작용 네트워크 유사성 점수를 기반으로 대표 이웃의 개별 구성 요소를 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 질량 분석법과 결합된 친화성 정제를 사용하여 estia Coli의 안정적인 단백질 복합체를 분리할 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

원칙적으로, 이 기술은 가능한 한 재결합하기 위해 다른 종의 막 단백질 복합체 또는 단백질 복합체를 특성화하는 데 적용할 수 있습니다.