Name: 의 단백질 단지의 식별 대장균 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 배우세요 Escherichia coli에서 순차적 펩타이드 친화성 질량 분석법을 사용하여 저발현 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 방법을. 이 기법은 단백질 상호작용과 다중 단백질 복합체의 구성을 효율적으로 밝혀줍니다.

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이 작품은 혁신 게놈 캐나다, 온타리오 유전체학 연구소, 혁신의 온타리오 교육부, 그리고 JG에 건강 연구 기금의 캐나다 연구소와 AE 적목 표현 E.에 대한 캐나다 재단에서 기금에 의해 지원되었다 대장균은 변형 DY330는 도널드 L. 법원 (국립 암 연구소, 프레데릭, MD)에서 일종의 선물이었다.

1. E.의 유전자 별 SPA 태그 추가 구축 대장균 DY330 변형 <ol><li> 플라스미드 pJL148은 SPA-태그 DNA 시퀀스와 kanamycin 항생제 저항 아이콘 카세트 (관 R)를 포함한는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 7의 템플릿으로 사용됩니다. 27 BP (5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 &#39;) 태그 특정 앞으로 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈 즉시 상류에 위치한 45 NT 유전자 특정 앞으로 프라이머, 그리고 45 NT 유전자 특정 역방향 프라이머, 즉시 위치 94 : 27 BP (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT의 -3 &#39;) 태그 특정 역 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈의 하류는 다음과 PCR 사이클 조건을 사용하여 pJL148에서 SPA-태그와 칸 R 카세트를 증폭하는 데 사용됩니다 5 분에 대한 ° C, 1 분, 68 1 분, 55 ° C ° 10 분에 68 ° C에 이어 2 분 10 초에 C에 대해 94 ° C의 30주기. 이 증폭 시퀀스는 서비스를 제공ectopically 소개 λ - 레드 상동 재조합 기계를위한 S 기판 (아래). </li><li> PCR 제품은 electroporation을 방해 할 수 염을 제거하는 Qiaquick PCR 정화 키트를 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 PCR 제품은 이후 λ - 레드 재조합 기기는 10 표현되는 DY330 변형에서 특정 유전자의 3 &#39;끝 (기본 정지 코돈의 바로 상류)에 통합하는 타겟팅됩니다. </li><li> DY330 λ - 레드 표현 스트레인는 180 rpm으로 흔들어하여 32 ° C에서 2 ML Luria-Bertani (LB) 매체에 밤새 성장하고 있습니다. 밤 문화의 한 ML은 이후 500 ML 원뿔 플라스크에 70 ML 신선한 LB 매체에 주사합니다. inoculum는 OD 600 ~ 0.8에 도달 할 때까지 180 rpm으로 흔들어하여 32 ° C에서 성장하고 있습니다. </li><li> 문화는 세포 ° C 부드럽게에 흔들림에 의해 42에 물 목욕에 휴대용 술병을 잠복기에 의해 유도되는 신선한 250 ML 원뿔 플라스크로 전송됩니다15 분 180 RPM. 즉시 유도 후 병이 흔들리고있는 최소 30 분 동안 얼음 물 슬러리 욕조에 incubated 수 있습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 문화는 바로 사전 차가운 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 옮겨와 4에서 6 분에 3,993 XG에서 원심 분리를 받게 ° C.합니다 셀 펠렛은 50 ML 얼음처럼 차가운 멸균 물에 resuspended과 4 ° C.에서 6 분에 3,993 XG 다시 한 번 centrifuged 수 있습니다 셀 펠렛 그런 다음 차가운 물 1 ML에 resuspended와 1.5 ML Effendorf 튜브로 옮겨, 4 ° C.에 20 초에 최대 속도로 centrifuged합니다 얼음 냉수 두 개 또는 세 세척 단계 후, 세포 펠렛은 전기 관할 세포의 결과로, 얼음처럼 차가운 멸균 물 700 μl에 마지막으로 resuspended 있습니다. </li><li> electroporation을 통해 정화의 amplicon 중 하나 μl은 전기 관할 세포의 40 μl로 소개되어 있습니다. 2.5 KV, 펄스 25 μF : 세포는 다음과 같이 설정 바이오 RAD GenePulser II에 electroporated 아르200 Ω의 컨트롤러입니다. 상동 재조합과 통합 한 후 성공적으로 염색체에 태그 / 카세트를 재결합 transformants는 관 (그림 1A)에 대한 저항에 따라 선택됩니다. 여러 transformants는 서양의 SPA 태그의 국기 epitopes에 대한 선택입니다 안티 - 플래그 M2 항체와 SPA 태그 융합 단백질의 정확한 생성 (즉, 긍정적 신호)를 확인하는 blotting에 대해 선택됩니다. </li><li> 확인 카르복시 말단 SPA 태그 융합 스트레인은 ​​SPA 정화 프로토콜을 사용하여 수확 세포 용해 단백질 복합체를 분리 할 수​​있는 대규모의 배양입니다. 연관성 태그 정화 절차에 관여 단계의 개요는 그림 1B에 표시됩니다. </li></ol> 2. 배양 및 Sonication <ol><li> SPA 태그 E. 100 μl의 예방 50 ML 훌륭한 국물 (TB)로 대장균의 글리세롤 주식은 액체 매체는 25 μg / ML O의 50 μl로 보충250 ML 원뿔 플라스크에 F 칸 솔루션입니다. 32 ° C.에서 밤 문화를 성장 참고 : 변형 DY330의 온도 inducible의 λ 레드 카세트가 온도에 민감한 억제 (10)의 통제하에 있기 때문에 SPA 태그 대장균의 변종은 32 ° C.에 성장하고 있습니다 </li><li> 4리터 플라스크에 관의 25 μg / ML로 보충 990 ML 신선한 TB로 밤 문화의 10 ML을 전송합니다. OD 600 ~ 2-3에 도달 할 때까지 문화는, 32의 ° C 상수는 5-6 시간에, 250 rpm으로 흔들어와 함께 성장하고 있습니다. </li><li> 1리터 E.를 전송 대장균은 SPA 태그 문화 원심 분리 병을 청소하고 15 분에 Beckman의 ° C J6-HC의 원심 분리기 @ 3,993 XG 4에서 셀을 회전합니다. </li><li> 표면에 뜨는는 원심 분리 병에서 제거됩니다. E.를 Resuspend sonication 버퍼의 25 ML과 대장균 세포 펠릿. 항상 얼음에 원심 분리 병을 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> resuspended 펠렛은50 ML 폴리 프로필렌 팔콘 튜브로 옮겨와 액체 질소를 사용하여 냉동. 냉동 세포는 -80 ° C에서 장기 사용을 위해 저장됩니다. </li><li> 이전 sonication에, 얼음에 알약을 유지하여 완전히 냉동 세포를 해동. 해동 샘플은 sonication을 위해 얼음에 위치 멸균 스테인레스 스틸 컵으로 전송됩니다. 프로브가 샘플로 잠수 3 분 동안 sonicated 수 있습니다. 추가 2 분은 과열에서 샘플을 냉각 할 수 있습니다. </li><li> sonicated 세포 lysate은 사전 차가운 멸균 원심 분리 관에 전송하고, 두 번 15 분을 위해 JA-17 로터 @ 35,267 XG (16,000 RPM)를 사용하여 Beckman의 원심 분리기에서 4 ° C에서 원심 분리를 받게됩니다. 참고 : 우리는 막 단백질이있는 소수의 모르기 때문에 막 단백질 정화의 경우, sonicated 세포 lysate는 15 분에 한 번만 centrifuged 있으며, 그 펠렛이나 표면에 뜨는 분수의 하나입니다. 따라서 가상을 초과하는 손실을 방지하기brane 단백질, 우리는 15 고속 원심 분리의 분, 1 %의 세제가 막 단백질을 solubilize하는 데 사용되는 표면에 뜨는가 이후 (아래 단계 참조) 정화에 대한 처리의 세포를 스핀. </li><li> 원심 분리 관에서 표면에 뜨는는 신중하게 50 ML 폴리 프로필렌 팔콘 튜브로 옮겨와 액체 질소를 사용하여 냉동하고 있습니다. sonicated 냉동 세포 추출물은 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 6 개월 최대 기간 동안 저장됩니다. </li></ol> 3. 친 화성 정제 <ol><li> 사용하기 전에, 안티 - 플래그 M2 구슬의 100 μl은 AFC 버퍼의 10 권 (30 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 0.1 %의 세제, 그리고 0.1-0.5 MM TCEP [트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine에 의해 씻겨 있습니다 - 세제없이 염산])와 환원제 TCEP (트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine). </li><li> 냉동, sonicated 세포 추출물은 차가운 물에 튜브를 삽입하여 해동합니다. 해동 세포 추출물은 benzo 3 μl와 incubated 수 있습니다4 ° C.에 30 분을위한 nase nuclease 이 혼합물에, 비 이온 세제를 추가 트리톤 X-100 (세제의 최종 농도가 0.1 %이어야 함) 및 안티 플래그 M2 아가로 오스 비즈 200 μl 중지.주세요 참고 : 모든 수용성 단백질 purifications를 들어, 0.1 %는 트라이 튼 X-100가 아닌 특정 흡착을 최소화하기 위해 사용되는 곳으로 막 단백질 등 C12E8 (Octaethylene 글리콜 dodecyl 에테르) 등 다양한 온난 한 비 이온 세제, DDM을 (정화를위한 N-Dodecyl β-D-maltoside)와 말토오스 - neopentyl 글리콜 (MNG)는 solubilization을 향상시키기 위해 1 %의 세제 농도에서 사용할 수 있습니다. 다른 세제는 막 단백질의 solubilization 효율을 변화 때문에, 그것은 하나 이상의 세제를 사용하여 독립적 인 단백질 purifications을 수행하는 것이 좋습니다. </li><li> 내용은 부드럽게 ° C가 LabQuake 흔드는을 사용하여 4에서 3 시간 동안 튜브를 회전하여 혼합합니다. 회전 3 시간 후, 관은 6 분에 1,700 XG에서 centrifuged 있습니다. 표면에 뜨는는 r이된다느슨한 구슬 펠렛을 방해하지 않고, 최대한 신중하게 emoved. </li><li> 펠렛은 남아있는 표면에 뜨는에 resuspended 후 0.8 X 4cm 바이오 RAD 폴리 프로필렌 사립 칼럼으로 전송됩니다. eluates 중력 흐름에 의해 배출 할 수 있도록, 컬럼의 하단 콘센트 플러그를 제거하려면 확인하십시오. TEV 절단 단계로 열 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 세척 eluates을 빨아 후, 열 하단의 출구가 닫힙니다. 같은 열까지 절단은 열에 TEV 단백 분해 효소와 1X AFC 버퍼 400 μl의 ~​​ 5-10 μl (50 단위)를 추가하여 수행됩니다. 캡 열 상단을 닫습니다 있는지 확인하십시오. 구슬을 포함하는 열은 LabQuake 흔드는을 사용하여 ° C 박 4에서 하루 아침에 부드럽게 회전합니다. </li><li> 열 하단에있는 상단 및 콘센트 플러그에 뚜껑을 제거하고, (10)에 의해 쓸려 calmodulin-세 파로스 비즈 200 μl 정지를 포함한 새로운 칼럼으로 TEV 절단 한 후 복구 eluates을 배수calmodulin 바인딩 버퍼의 권. </li><li> 상단과 열 하단의 모두 단단히 고정되며, 열에서 내용은 ° C LabQuake 흔드는을 사용하여 4에서 3 시간에 돌려 부드럽게 혼합되어 있습니다. </li><li> 회전 3 시간 후, eluate은 열 상단 캡과 하단에 플러그를 제거하여 배수입니다. 열은 calmodulin 세척 버퍼 400 μl과 하나가 엄격한 세척 한 다음 1X calmodulin 바인딩 버퍼 200 μl를 네 번 세탁하고 있습니다. </li><li> 바인딩 단백질은 1X calmodulin의 용출 버퍼를 사용하여 새로운 Eppendorf 튜브에 50 μl 네 개의 분수에 용출되어 있습니다. 용출 분획은 동일한 볼륨에 두 개의 깨끗한 Eppendorf 튜브에 배포됩니다. 튜브 모두 이후 속도 진공을 사용하여 건조합니다. </li><li> 다른이 사전에 질량 분광법을 사용하여, -80 ° C에 저장되는 동안 관에서 건조 eluate은 실버 착색 젤을 실행하는 데 사용됩니다. </li></ol> 4. 실버 얼룩 <ol><li> 실버 staini에 대한NG, 3 배 SDS (나트륨 dodecyl 황산) 샘플 버퍼의 절반 볼륨이 건조 eluate의 50 μl에 추가됩니다. 5 분의 혼합물을 끓고 후, 샘플은 SDS의 polyacrylamide 젤에로드됩니다. </li><li> 젤이 실행 완료 후, 조심스럽게 고정 솔루션에 배치 (50 % 메탄올와 10 % 아세트산)와 20 분의 회전 흔드는을 부드럽게 교반하고 있습니다. 젤 그 다음 10 분 20 % 에탄올에 헹구어 있습니다. </li><li> 고정 젤은 낮은 균일 한 배경을 보장하기 위해 10 분에 두 번 증류수 500 ML에 두 번 철저하게 세척합니다. </li><li> 젤 그런 다음 20 초에 증류수 두 세척 단계에 이어 1 분, 500 ML 나트륨-thiosulfate에 부드럽게 교반하고 있습니다. </li><li> 물은 폐기되고, 젤은 30 분에 0.1 % 실버 질산염 200 ML에 incubated 수 있습니다. 그 이후에는 실버 질산염이 제거되고 젤이 초과 실버 질산염을 제거하는 20 초에 증류수로 세척합니다. </li><li> 젤은 결국 75 ML에 흥분 손으로개발 솔루션의. 원하는 강도가 달성되면, 개발 솔루션은 삭제되며 아세트산의 80 ML는 반응을 중지에 추가됩니다. 겔 밴드의 적절한 시각화를위한 20 분의 최소 아세트산의 젤을 배양 할 수 있는지 확인합니다. </li></ol> 5. 질량 분석법에 대한 Proteolysis 및 샘플 준비 <ol><li> 말린 샘플에, 소화 버퍼 50 μl 100 MM TCEP-HCL (트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine - 염산)의 0.9 μl를 추가하고 실온에서 45 분의 혼합물을 품다 감소 단계. 다음, 500 밀리미터 iodoacetamide 1 μl를 추가 및 샘플 알킬화 할 수 있도록하는 또 다른 40 분 어둠 속에서 incubated입니다. </li><li> 부화의 두 번째 라운드 후, 혼합물에 고정 트립신의 1 μg을 추가로 5 시간 또는 실온에서 하룻밤에 37 ° C에서 중 품다. 아세트산 1 μl를 추가하여 반응을 중지 확인합니다. </li><li> 사전 젖은 Millipo으러 및 평균 솔루션 10 μl를 aspirating하여 다시 우편 - 팁 피펫 팁. 낭비 할 수있는 솔루션을 투여. 이후에 세척 용액 10 μl를 기음과 낭비 할 수있는 솔루션을 투여. 이 단계를 두 번 반복합니다. </li><li> 끝으로 펩타이드 혼합물의 효율적인 바인딩, 피펫은 펩타이드 혼합물을 20 번 섞는다. 끝을 준수하는 펩타이드 혼합물은 aspirating 및 세척 용액을 조제하여 씻어 수 있습니다. 끝으로 펩타이드 혼합물의 효율적인 결합에 대해 두 번이 절차를 반복합니다. </li><li> 바인딩 펩타이드를 포함하는 팁과 함께 으러 및 평균 솔루션 10 μl를 대기음, 그리고 깨끗한 eppendorf 튜브에 조제. 이 단계를 두 번 반복합니다. 사용하기 ° C 사전을 속도 진공에서 용출 샘플을 건조 후, 샘플은 질량 분광법에 의해 즉시 분석 할 수 또는 -80에 저장됩니다. </li></ol> 6. LTQ Velos Orbitrap 질량 분광계에 의한 단백질 식별 일고립 된 단지의 전자 폴리펩티드 구성 요소 LTQ Velos의 Orbitrap 하이브리드 탠덤 질량 분석기를 사용하여 식별됩니다. Orbitrap은 뛰어난 해결 능력 (&gt; 60,000 전체 너비 하프 최대, 또는 FWHM) 및 제어 purifications에서 감지 관련이없는 비 특정 배경 오염 물질의 MS / MS 샘플링을 최소화 대량의 정확도를 (&lt;2 PPM)가 고속 Velos 이온 트랩 동안 구성 요소가 감지 할 수 있습니다 전자 전달 분리와 충돌 유발 분해 모드를 사용하여 조각 낮은 풍요의 펩티드. 결과 MS / MS 스펙트럼 사이에서 높은 신뢰 일치는 참조 E.에 매핑됩니다 대장균 단백질 시퀀스는 SEQUEST와 STATQUEST 11 같은 확률 알고리즘 동안 평가를 각각의 일치 시퀀스 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용합니다. 총 스펙트럼 번호, 펩타이드 시퀀스 고유 대조군 (예. 모의) purifications에서 감지 일반적인 배경 오염 물질은 낮은 경험적 허위 - 비밀입니다 달성하기 위해 간주됩니다covery 속도. 다음 단계는 단백질 식별을 위해 수행됩니다 : <ol><li> 마이크로 열은 3 μm 루나-C 18 수지의 ~ 10cm로 포장하고 Orbitrap 악기와 라인에 배치되어있는 Proxeon nanoelectrospray 이온 소스에 연결할 있습니다. </li><li> Proxeon 나노 흐름 바이너리 HPLC 펌프는 펩타이드 분리시 ~ 300 NL 분 -1의 안정 팁 유량을 제공하는 데 사용됩니다. </li><li> 펩타이드 용출을 달성하기 위해, 유기 버퍼 기울기는 샘플의 복잡성에 따라 설정됩니다. 예를 들어, 다음과 같은 그라디언트는 일반적으로 E.에 설정되어 대장균의 SPA 샘플 : 용매 B는 1 분에 100 % 개최 옆에 4 분에서 100 %로, 38 분에서 24 %로, 1 분에 2퍼센트 6 %에서 증가 한 다음, 1 분에서 2 %로 감소 15 분에서 2 %로 개최 최종. 모바일 상 용매 용매 B는 0.1 % 개미의 ACI와 5% HPLC 기울기 물과 95 % ACN가있을 때, 0.1 % 개미의 산성과 95% HPLC 기울기 물과 5 % ACN이D. 바늘의 끝의 유량은 60 분 300 NL 분 -1로 설정되어 있습니다. </li><li> 질량 분광계주기는 60,000 해상도에 하나의 전체 질량 검사를 통해 실행으로, 10 수반하는 협동 조각 질량 검사는 가장 강렬한 전구체 이온에 대한 수집하고 있습니다. 동적 제외, monoisotopic 대량 선택, 실시간으로 데이터에 의존 수집 악기 기능을 사용할 수 있습니다. </li><li> 스펙트럼은 E.의 데이터베이스에 대해 이러한 SEQUEST 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용하여 검색됩니다 대장균 단백질 시퀀스, 그리고 결과는 통계적으로 낮은 잘못된 검색 속도를 보장하기 위해 이러한 STAQUEST 11과 같은 확률 알고리즘을 사용하여 필터링하고 있습니다. 일치하는 이론적 펩티드 질량에 비해 10 개 이상의 PPM 질량 오류를 보여주는 더 고려에서 제거하는 동안 만 높은 신뢰 (99 % 확률) 후보자가 선택됩니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 SPA 기반 APMS 방식의 핵심 부분은 태그가함으로써 정상적인 유전자 조절을 보장하는 것은 유지 (예. 기본 미끼업자의 앞 표현 수준이 어리둥절하지 않습니다, 보존) 및 안정적-관련 기본입니다, 자연 염색체 컨텍스트 내에서 수행되는 것입니다 단백질 단지는 거의 내생 수준에서 회수하고 있습니다. 오페론 극성 문제도 선택 마커의 외측 중심의 발기인을 포함하여 피할 수 있습니다. 이 SPA 태그 추가 방법은 subunits는 세균 세포 당 몇 분자으로 표현 된 경우에도 막 관련 어셈블리를 포함한 근처의 동질성에 대한 낮은 풍부한 단지,​​의 구성 요소를 정화 할 수있을만큼 효과적입니다. 전반적으로,이 프로토콜은 E.에 태그 가용성 단백질의 대형 세트를 정화에 쉽게 스케일 업 할 수 있습니다 대장균이나 원칙적으로 recombineering를 통해 태그이 가능하는 다른 박테리아 종, 또는 사람이 소유하고 자연스럽게 높은 transformaAcinetobacter, 타겟 ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. 항생제</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Terrific-Broth medium</td></tr><tr><td>Bio-Tryptone</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. 박테리아 균주 및 플라스미드</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. PCR 및 전기영동 시약</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>발효#</td> <td>EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X PCR 완충액</td><td>발효</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Bioshop</td> <td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td> <td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5입니다. 플라스미드 분리 및 클린업 키트</td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. PCR 및 변환 장비</td></tr><tr><td>thermal cycler</td>, <td>BioRad</td><td>iCycler,</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 젤, 전기영동,</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Electroporator,</td><td>Bio-Rad</td>, <td>GenePulser II</td><td></td></tr>, <tr><td>0.2 cm electroporation cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; C 수조 쉐이커</td><td></td><td>Innova 3100</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>TS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C 셰이커</td><td>뉴브런즈윅 사이언티픽, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C 대형 셰이커</td><td>뉴 브런 즈윅 사이언티픽, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C 플레이트 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td colspan ="4">7. 전기영동 및 웨스턴 블로팅</강></td></tr><tr><td>아크릴아미드 단량체, N,N'-메틸렌비스-아크릴아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-부탄올</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman No. 1 여과지</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini protean 3 cell</td><td>Bio-Rad</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>iBlot gel transfer device</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Flag M2 항체</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Pre-stained 단백질 분자량 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 시약</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography film</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>Quick Draw blotting paper</td><td>Sigma</td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>C2 platform rocking shaker</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><강한>8. 초음파 처리 장비 및 시약</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">9. 친화성 정제 시약 및 장비</td></tr><tr><td>0.8 x 4 cm Bio-Rad 폴리프로필렌 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin-sepharose beads</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake Shaker</td><td>Thermolyne</td><td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10. 은 염색 시약</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-티오설페이트</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>탄산</td><td>나트륨바이오샵</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. 단백질 식별용 시약 및 장비 </td></tr><tr><td>Trypsin Gold, 질량 분석 등급</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>포믹 산성</td><td>시그마</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>시그마</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>요오드아세트아미드</td><td>시그마</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>밀리포어 집팁</td><td>밀리포어</td><td># ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>~10cm of 3 &mu; m Luna-C18 수지</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano HPLC 펌프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos 질량 분석기</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">12. 실험기구</강력></td></tr><tr><td>4리터 원뿔형 플라스크</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 팔콘 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250ml 원추형 플레이크</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15ml 멸균 배양 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C freezer</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>스피드 진공 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 버퍼 및 솔루션 1. 1리터 훌륭한 국물(TB) 미디어 11g Bio-Tryptone 22g 효모 추출물 2% 글리세롤 50ml 칼륨 염 스톡 해결책 2. 칼륨 염 원료 용액 1.5 M K 2 HPO 4 0.35 M KH 2PO4 3. 초음파 처리 완충액 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA < > 10 % 글리세롤 < > 사용하기 전에 프로테아제 억제제 (PI)와 0.1-0.5 mM TCEP를 첨가하십시오 4. AFC 버퍼 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) < / > 150 mM NaCl < > 0.1 % 세제 < > 사용하기 전에 PI 및 0.1-0.5 mM TCEP를 추가하십시오 5. TEV 절단 완충액 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 세제 사용하기 전에 PI와 0.1-0.5 mM TCEP를 추가하십시오 6. 칼모듈린 결합 완충액 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 세제 사용하기 전에 PI와 0.1-0.5 mM TCEP를 첨가하십시오 7. 칼모듈린 세척 버퍼 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. 칼모듈린 용출 완충액 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. 현상액 (1L) 37% 포름알데히드 탄산나트륨 30g 증류수 1000ml 10. 소화 완충액 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. 습윤 및 평형 용액 0.1 % 포름산 중 70 % 아세토 니트릴 (ACN) 12. 세척 용액 100 % H2O 0.1 % 포름산</td></tr></tbody></table>

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

대부분의 세포 프로세스 macromolecular 어셈블리, 단백질 - 단백질 상호 작용의 체계적인 식별 (PPI)와 단지는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공하고 생물 시스템 1, 2의 이해를 향상시킬 수 있습니다 다중 단백질의 subunit 구성의 식별에 의해 중재되기 때문입니다. 물리적 상호 작용 대량 분석법 (APMS)와 함께 chromosomally 태그 단백질의 친 화성 정화에 따라 거의 생리적 조건 하에서 내생 단백질 단지의 높은 신뢰 vialarge 규모의 절연 및 특성에 매핑 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 효모, 파리, 웜, 포유류의 세포 및 박테리아 1-6 등의 evolutionarily 다양한 생물에 적용되었습니다. 특히, 우리는 GE를 사용하여 양식 그람 음성 대장균에서 선호도 - 정화 기본 단백질 단지의 카르복시 - 터미널 순차적 펩타이드 선호도 (SPA) 듀얼 태그 시스템을 생성 한기본 생물학, prokaryotes 1, 2, 7 보존 프로세스의 게놈 전체의 조사에 적합 아르 netically - 다루기 쉬운 호스트 실험실 변종. 우리 SPA 태그 시스템은 효모 8, 9 원래 개발 된 직렬 선호도 정화 방법 유사하며, calmodulin 바인딩 구체적인 담배 에칭 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소의 절단 사이트에서 다음 펩타이드 (CBP) 및 사본 3 부를 구성되어 있습니다 연관성 농축의 연속 2 발을 허용 플래그 에피토프 (3 배 플래그)의. 카세트 증폭 후, SPA-태그와 선택 마커를 인코딩 순서 특정 선형 PCR 제품은 통합되어 transiently 고효율 heterologous 박테리오파지 람다 재결합 시스템 (10)을 표현하도록 유도하는 DY330 배경으로 카르복시 - 터미널 fusions와 같은 프레임으로 표현. calmodulin 및 안티 플래그 연관성 구슬을 사용하여 후속 듀얼 단계 정화는 높은 선택을 가능하게대규모 문화도 낮은 풍부한 단백질 단지의 효율적인 복구. 직렬 질량 분석법 그 다음 높은 감도 (낮은 nanogram 검출 한계)를 안정적으로 공동 정화 단백질을 식별하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 우리가 일반적으로 체계적인 단백질 태그, 정화 및 대량 E.에서 수용성 단백질 단지의 분석법 기반의 분석을 위해 사용하는 자세한 단계별 절차를 설명 까지 확장 될 가능성이 recombineering 의무가있는 특정 기회 병원균 등 다른 세균 종에 맞게 할 수 있습니다 대장균. 그 결과 물리적 상호 작용은 종종 재미있는 예상치 못한 구성 요소와 소설 기계론의 링크를 제안 연결을 공개 할 수 있습니다. 이러한 유전자 (유전자 유전자) 상호 작용과 예측은 이중에서 다중 단백질 단지의 글로벌 분자 조직의 해설을 촉진 할 수 게놈 - 컨텍스트 (GC)와 같은 다른 분자 협회 데이터와 PPI 데이터의 통합ological 경로. E.에 대해 생성 된 네트워크 대장균은 기능 주석이 현재 부족하는 다른 미생물의 orthologous 유전자 제품의 기능 구조에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

내인성 수준으로 발현된 태그 부착 미끼 단백질을 로그 성장기 배양액에서 친화성 정제한 후, 분리된 안정적 복합체의 개별 폴리펩타이드 성분을 시각화하기 위해 샘플을 은 염색 겔에서 전기영동하였습니다. 또한, 친화성 정제된 단백질 샘플의 두 번째 부분을 겔-프리 텐덤 질량 분석법(LCMS)으로 분석하여 해당 폴리펩타이드 서열을 확인하였습니다. 이러한 APMS 절차의 효율성은 E. coli에서 친화성 정제된 RNA 중합효소(RNAP) 및 SufBCD 철-황(Fe-S) 단백질 복합체 성분의 대표적인 SDS-PAGE 분석 결과로 확인할 수 있습니다 (Figure 1C and D). SPA 태그가 부착된 RNAP σ70 (RpoD)와 기능이 알려지지 않은 단백질인 YacL 모두 핵심 RNAP 효소 e.g., α (RpoA), β (RpoB), β' (RpoC) 하위 단위 및 RNAP 재활용 인자(HepA)와 특이적으로 공동 정제되었습니다. 태그가 부착된 Rp...

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명<em&gt; 대장균</em&gt;도 셀 당 낮은 사본 번호부터 근처의 동질성에 안정적인 멀티 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수있는.

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

본 실험의 목적은 E. coli 유래 천연 MultiPro 복합체의 단백질, 단백질 상호작용 및 하위 단위 구성을 확인하는 것입니다. 이를 위해 SPA 태그와 선택 마커를 인코딩하는 서열 특이적 선형 PCR 생성물을 증폭하며, 이는 박테리아 Fage lambda 재조합 시스템을 이용하여 ddy 3, 3 0 배경의 carboxy 말단 융합 형태로 통합 및 발현됩니다. 두 번째 단계로, 저농도 단백질 복합체를 효율적으로 회수하기 위해 cow modlin 및 Anti-Flag 친화성 비즈를 사용하여 2단계 정제를 수행합니다. 다음으로, cow modlin, 용출 버퍼 또는 CEB로 용출된 결합 단백질을 trypsin으로 소화시킨 후 질량 분석법으로 처리하여 단백질을 식별합니다.결과에 따르면, 전사 종결 및 항결정 인자를 포함한 핵심 RNA 중합효소 효소의 여러 하위 단위들이 태그가 부착된 RNA 중합효소 하위 단위 D 단백질과 효율적으로 공동 정제되었으며, 이는 이 접근 방식을 통해 새로 연관된 구성 성분들을 효율적으로 찾아낼 수 있음을 나타냅니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 2회 반복 친화성 정제 과정에서 어려움을 겪을 수 있는데, 대규모 배양액으로부터 저발현 및 고발현 복합체를 효율적으로 회수하기 위해서는 적절한 완충 용액을 사용하여 세포 용해물을 세심하게 처리하는 것이 절대적으로 필요합니다. 친화성 정제 및 질량 분석 절차는 본 실험실의 기술자인 Olga Kagan과 HBO guo가 시연할 예정입니다. 이 프로토콜은 서면 프로토콜에 기술된 바와 같이 Lambda red 재조합 기작이 발현되는 DDY three 30 균주에 특정 증폭 서열을 표적화하는 것으로 시작합니다.다음으로, 박테리오파지 Lambda 재조합 시스템 발현 균주를 2 mL의 Luria bati 또는 LB 배지에서 32 °C, 180 RPM으로 흔들어 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 500 mL 삼각 플라스크에 담긴 70 mL의 신선한 LB 배지에 접종합니다. 접종물을 32 °C에서 180 RPM으로 흔들어 OD 600이 약 0.8에 도달할 때까지 배양합니다. 플라스크를 42 °C 항온 수조에서 180 RPM으로 부드럽게 흔들며 15분 동안 배양하여 세포를 유도합니다.유도 직후, 플라스크를 얼음물 슬러리 배스에 넣고 흔들어 주며 최소 30분 동안 배양합니다. 서면 절차에 기술된 대로 세포를 수확

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

배우세요 Escherichia coli에서 순차적 펩타이드 친화성 질량 분석법을 사용하여 저발현 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 방법을. 이 기법은 단백질 상호작용과 다중 단백질 복합체의 구성을 효율적으로 밝혀줍니다.

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