Name: 간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 배우세요 성어 Danio rerio의 신장 주사를 통한 미세입자 순환계 도입 및 아가미 활체영상 기법. 이 방법은 형광 프로브를 이용한 반복적인 혈액 pH 측정에 활용됩니다.

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저자는 크게 비디오 프로토콜의 준비에 Bogdan Osadchiy 및 Evgenii Protasov (이르쿠츠크 주립 대학, 러시아)의 도움을 인정합니다. 이 연구는 기초 연구 (#15-29-01003)에 대 한 러시아 과학 재단 (#15-14-10008) 및 러시아 재단에 의해 지원 되었다.

모든 실험 절차는 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 실시 했다 하 고는 동물 주제 연구 위원회 연구소의 생물학의 이르쿠츠크 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. Microcapsules의 제조
참고: Microcapsules 형광 염료를 들고 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 모든 절차는 실 온에서 수행 했다.
<ol><li>형광 염료를 포함 하는 다공성 CaCO3 microcores 합성, 혼합 SNARF-1-dextran 솔루션 (FITC BSA 등 대부분 폴리머 바인딩된 형광 염료를 사용할 수 있습니다.)의 2 개 mL ~ 2 mg/mL의 농도에서 0.6 mL CaCl2의 1 mol/L 솔루션 와 나2CO3 빠른 교 아래. 참고: photobleaching;에 형광 염료의 다른 감도에 관심을 지불 (SNARF-1) 같은 빛에 민감한 형광 프로브를 사용 하는 경우는 미의 저장 하 고 조작 해야 합니다 수행할 수 가능한 작은 빛으로.</li>
	<li>동요의 5-10 s, 후 전송 현 탁 액 2 mL microcentrifuge 튜브와 15에 대 한 원심 분리기 CaCO3 microcores 펠 렛에 10000-12000 g에서 s.</li>
	<li>삭제는 상쾌한, 이온된 수, ~ 2 mL와 코어를 세척 하 고 떨고 하 여 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>세 번 총에에서 원심 분리 세척 절차를 반복 합니다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어. 주의: 헤드폰으로 귀를 보호 하기 위해 잊지 마세요.</li>
	<li>서식 파일에서 첫 번째 폴리머 레이어를 입금, 1 mol/L NaCl에에서 poly(allylamine hydrochloride) (PAH)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL에 코어를 resuspend.<ol>
<li>일정 한 동요와 ~ 5 분에 대 한 솔루션에는 microcores를 유지.</li>
		<li>15 후 원심 분리의 s 삭제 언바운드 PAH와 상쾌한. 3 번 이상 여러 원심 분리 및 세척 단계를 통해 이온을 제거 된 물으로 덮여 microcores 세척. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어. 참고: 폴 리 (나트륨 4-styrenesulfonate)에서 시작 하는 경우 적용 된 형광 성 염료는 양이온, (PSS) 1 mol/L NaCl에에서 (단계 1.7 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>서식 파일에 두 번째 폴리머 레이어를 입금 PSS (또한 1 mol/L NaCl을 포함 하는)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL와 1.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>1.6 및 1.7 6 번 입금 12 폴리머 레이어를 단계를 반복 합니다. 참고: 권장 되지 않습니다 (~ 12 h 이상) 긴 휴식 ~ 3-5까지 절차에 레이어 입금 되었습니다 때문에 보험 없이 CaCO3 microcores recrystallize 하는 경향이 있습니다. Note PSS 범위는 microcores의 더 높은 집계 원인과 긴 일시 중지는 (PLL-g-PEG) outmost 레이어는 PAH 또는 폴 리-L-리 신 폴 리 에틸렌 글리콜으로 투입 하는 경우에 좋습니다.</li>
	<li>2 mg/ml PLL-g-말뚝 (microtube 당 ~ 1 mL) 적어도 2 시간에 대 한 커버 microcores를 품 어.<ol>
<li>Microcores 연속 원심 분리 및 물의 resuspension 단계를 통해 물으로 씻는 다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>빈 microcapsules를 하려면 대상된 microcores를 사용 0.1 mol/L ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (NaOH로 pH 7.1 조정)의 2 개 mL를 추가 하 여 CaCO3 서식 파일을 분해.<ol>
<li>외피의 ~ 5 분, 후 원심 45 s 및 삭제에 대 한 microcapsules EDTA와 상쾌한.</li>
		<li>1.10 1.10.1 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.9 %NaCl 여러 원심 분리를 통해 세 번 45 내 단계 microcapsules 세척 세척 단계 뒤에 s. 원심 분리의 마지막 단계, 후에 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 주입에 대 한 최종 microcapsule 솔루션 유지 되어야 한다 살 균 (예를 들어 추가 하 여 암 피 실린, 0.1 mg/mL), 그리고 미디어 생체 조사 (isotonic 미디어 중립 ph) 대상이 되어야 합니다.</li>
	<li>형광 현미경 hemocytometer에 준비 된 microcapsules의 농도 견적 한다. microcapsules의 그림의 일련, 한 백 microcapsules ImageJ9 또는 해당 소프트웨어를 사용 하 여에 대 한의 직경을 측정 하 고 히스토그램을 사용 하 여 크기 분포를 조사.</li>
	<li>저장소는 획득된 캡슐화 프로브 어둠 속에서. 참고: 살 균 0.9%에서 여러 빨 래 후 NaCl, microcapsules는 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있다 저장 동안에 microcapsules의 완전 한 건조 하는 것은 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>2. 준비의 광학 설치 및 Microencapsulated SNARF-1의 교정
참고: microencapsulated SNARF-1 거친 pH 측정 형광 현미경7의 두 채널의 이미지를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하지만 섬유 분석기에 연결 된 한 개 채널 형광 현미경이이 프로토콜에 적용 했다.
<ol><li>필요한 일련의 형광 필터 적용 된 형광 염료의 특성에 따라 형광 현미경에 놓고 형광 램프를 켭니다.<ol>
<li>접 안경에 레버를 당겨. 주의: 초과 빛 분석기 매트릭스를 손상 수 있습니다. 따라서, 레버는 "아이피" 모드는 분석기를 사용 하지 않을 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>분석기와는 다른 쪽 끝을는 겨냥 틀을 광섬유의 한쪽 끝을 연결 합니다. 어댑터를 사용 하 여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 다른 사용 가능한 포트에는 겨냥 틀을 배치 합니다.</li>
		<li>분석기를 켭니다. 분 광 계 제어 프로그램을 실행 하 고는 분석기 측정을 위한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microcapsule 배치의 교정에 대 한 microcapsule 정지 (이온된 수 µ L 당 10 ~ 000 microcapsules)의 ~ 5 µ L 현미경 슬라이드에 놓고 건조 (35 ° C에서 온도)에서 예를 들어 어두운 장소에 드롭.<ol>
<li>Microencapsulated SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정 하려면 다른 pH 값 범위 ~ 6-9에에서 버퍼의 시리즈를 사용 합니다. ~ 10 µ L SNARF-1-dextran와 말린된 microcapsules에 버퍼를 삭제 하 고는 coverslip로 그것을 커버.</li>
		<li>현미경 단계에 유리 슬라이드를 놓습니다. Microcapsules를 × 40 목표를 사용 하 여 찾습니다.</li>
		<li>카메라 포트를 현미경 레버를 설정. 그들의 형광 분석기를 등록 합니다. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다. 참고: 배경 수준 보다 훨씬 스펙트럼 신호는 다는 것을 확인 하 고 보기의 필드에 microcapsules는 거품에서 (로 전환 하 여 낮은 확대 필요한 경우) 확인 합니다. 동일한 microcapsules의 장시간된 조명을 하지 마십시오. SNARF-1은 photobleaching에 민감합니다.</li>
		<li>10-15 회 다른 microcapsules에 대 한 단계 2.2.3을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 등록 된 스펙트럼에 대 한 형광 피크 비율 (예: R 또는 Scilab 사용)을 계산 하 고 회귀선 (각 버퍼)에 대 한 평균 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 중간 pH 사이 결정: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> 참고: SNARF-1 스펙트럼 protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리 있으며 봉우리 사이의 비율 매체의 pH에 반응입니다. 이 연구에서 605, 660 nm의 형광 강도 사이 비율 사용 됩니다. 이 파장은 사용 하는 필터 설정에 따라 선택 됩니다. a 와 b 는 계수 비 선형 회귀 (예: R를 사용 하 여)에 의해 결정 됩니다. 0.15 및 1.1 값은, 각각,의 최소 및 최대 값 나605/I660 는 교정 중 관찰.</li>
	<li>약 5 성인 동물에서 물고기 혈액의 약 10 µ L를 수집 합니다. 장소 1 µ L/mL와 페 트리 접시에 마 취에 대 한 정 향 오일의 서 스 펜 션 물 생선과 동물의 측면에는 지 느 러 미의 pinches을 응답 하지 않습니다 때까지 기다렸다가 (보통 2 ~ 3 분). 유리 슬라이드에 물고기를 전송 합니다. 물고기 꼬리는 바소와에서 잘라내어 꼬리 정 맥에서 물고기 혈액의 약 2 µ L를 수집. 참고: 혈액 응고 방지 하기 위해, 헤 파 린 (5000 U/mL)와 절 개를 치료 하 고 heparinized 유리 모 세관 및 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 혈액을 수집.<ol>
<li>microelectrode의 끝에 피 펫과 혈액의 약 10 µ L 똑 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 결정 합니다.</li>
		<li>말린된 microcapsules와 함께 슬라이드에 혈액을 삭제 하 고 등록 교정 버퍼 (2.2-2.3 단계)에 대 한 설명으로 형광 강도의 비율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>곡선 (대 한 자세한 내용은 참조 Borvinskaya 외. 20175) 물고기 혈액 측정 일치 하도록 교정 곡선의 선형 계수를 조정 합니다.</li>
</ol>3입니다. 주입에 대 한 준비
<ol><li>날카로운 바소와 플라스틱을 제거 하 여 인슐린 펜 (또는 주사기)의 끝에서 강철 바늘을 놓습니다. 참고: 모든 얇은 바늘 (Ø0.33 m m 또는 더 적은) 또는 유리 모 세관 (일반적으로 Ø1 m m) microinjection10,11준비 될 수 있다.</li>
	<li>유리 microcapillary; 중간 바늘 삽입 신속 하 고 부드럽게 솔더 가스 토치를 사용 하 여.</li>
	<li>유리 microcapillary는 microinjector에 연결 하 고 세 번 살 균 물으로 플러시. 액체는 바늘에 흐르는 확인 하십시오.</li>
	<li>증류수로 시스템을 채우십시오. 참고: 시스템에 있는 아무 거품 다는 것을 확인 하십시오.</li>
</ol>4입니다. 주입
<ol><li>Microcapsules의 준비 된 현 탁 액 resuspend (살 균 0.9 %NaCl에서, 또는 어떤 다른 매체 든 지에 사용 microliter 당 0.5 6 백만 microcapsules의 농도 주사) 1 분 동안 초음파 목욕을 사용 하 여. 참고: 다음 주입 동안 침전 하는 microcapsules 경향이 있기 때문에 동요는 microcapsules와 유리병 기계적으로 (로 터를 사용 하 여) 또는 수동으로 수 분 마다 그들을 resuspend 하 고 그들의 집계를 방지.</li>
	<li>장소 마 (정 향 오일 물에 0.1 mL/L)와 페 트리 접시에 물고기 2 ~ 3 분 대기 물고기의 측면에는 지 느 러 미의 빛 핀치에 응답 하지 않습니다 때까지.</li>
	<li>숟가락을 사용 하 여, 마 취에서 생선을 전송 하 고 부드럽게 머리 (사람을 위해 오른 손잡이) 왼쪽으로 또는 오른쪽 (왼손잡이 사람)에 대 한 가로 위치에 젖은 스폰지에 두십시오.</li>
	<li>주사의 바로 전에 1-2 m m 유리 모 세관으로 공기의 microinjector와 연결 된 빨 아. 그런 다음, 분산 된 microcapsules의 약 2 µ L와 함께 로드 됩니다. 참고: 주입, 전에 microcapsule 솔루션 물고기 지켜진다 온도를 조정할 수 합니다.</li>
	<li>부드럽게 비 지배적인 손 가진 스폰지에 물고기의 시체를 안정화 합니다.<ol>
<li>물고기의 측면 라인을 찾아. 정신적으로 복 부 구멍의 끝에는 operculum에서 확장 하는 세그먼트를 선택 합니다. 이 세그먼트의 중간을 찾아. 더 낮은 복 부 방향으로 1 m m 바늘을 넣어.</li>
		<li>된다고 운동, 생선 비늘, 고 펑크 부드럽게 이동 합니다. 테이블 표면에 45 °의 각도에서 본문에 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>그것은 신중 하 게 그것에 대하여 휴식 때까지 척추 쪽으로 바늘을 밀어.</li>
		<li>신장에 microcapsules의 현 탁 액의 약 1 µ L를 놓고 천천히 바늘을 철회. 참고: 적절 한 바늘 사이트를 찾을 수 쉽게, 유용 그림 2A 와 2B와같이 아래 빛을 사용 하 여 물고기를 transilluminating 하 여 트렁크 신장을 찾는 연습을 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>씻어 주사 사이트에서 유출된 된 microcapsules를 제거 하는 물 스트림 꼬리에 머리에서 물고기.</li>
</ol>5. Vivo에서 시각화
<ol><li>해 부가 위를 사용 하 여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거 하 고 물고기 아가미를 발가 벗기다. 린스 물으로 아가미.</li>
	<li>숟가락을 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 물고기를 전송 하 고 형광 현미경의 스테이지에 배치. 참고: 연속 절차 동안 물고기의 아가미를 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 이 방지 하려면 정기적으로 축 축 하 게 그들 파스퇴르 피 펫 (1-2 분 마다 약)를 사용 하 여 물으로.</li>
	<li>방을 어둡게 하 고 형광 microcapsules 데 아가미 검사 낮은 배율 (x 10의 목표)를 사용 하 여. 참고: 물고기 순환 시스템에 몇 가지 형광 입자의 도입에 대 한 절차를 사용 하는 경우이 좋습니다 주사 하기 전에 예기치 않은 형광 입자에 대 한 몇 가지 개인의 아가미를 검사. 야생-타입 zebrafish의 아가미 autofluorescence, 필요가 없습니다 하지만 경우에 따라 (같은 음식 조각 또는 단 세포 symbionts) 산발적 형광 입자 아가미에 수 있습니다. 경우 필요한, 이러한 입자 인식 될 수 있다 그들의 특정 모양에 따라 (예를 들어 음식 조각을 구형 microcapsules 달리 불규칙 한 모양) 또는 형광 스펙트럼 (즉, 색상).<ol>
<li>더 높은 크기 (× 40 목표), 렌즈를 전환 하 고 한 microcapsule 또는 microcapsules의 그룹 보기의 필드의 중앙에 위치 합니다.</li>
		<li>연결된 분석기와 포트에 레버를 설정. 스펙트럼 신호를 기록 합니다.</li>
		<li>레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.</li>
		<li>여러 번 다른 microcapsules에 대 한 측정을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구에 대 한 적절 한 환기와 수족관에 물고기를 전송 합니다. 참고: 최소의 연습으로, 그것은 주입 및 물고기 마다 2-3 분의 대략적인 속도로 기록 하는 신호를 수행할 수 있습니다. 측정 반복된 낮은, 무해 한 복용량 마 취의 또는 고정의 또 다른 방법은 사용 하 여 하나의 개별 여러 번 반복할 수 있습니다. 장기 관찰에 대 한 지속적인 마 취12시스템을 사용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18 (그림 1A). 이 기술의 장점은 사용 가능한 실험실 장비로 수행 하기 쉽습니다. 조건 및 화합물 사용에 따라 조작된 microcapsules 0.5에서 나노미터 두께 전해질 셸15</sup...

동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품1, 맥 관 구조 시각화2, 유전자 변형 세포 이식3및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. 4 , 그러나 5., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.
Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입3 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.
여기, 우리 기술 순환 시스템으로 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 하는 방법 성인 zebrafish의 신장 조직에 직접 수동 주입는 모세 혈관과 신장 혈관이 풍부 하다. 이 기술은 세포 이식 zebrafish 신장6에 대 한 비디오 프로토콜에 기반 하지만 외상 및 시간이 걸리는 microsurgical 단계 탈락 했다. 제안된 된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다.
제안 된 프로토콜의 중요 한 부분이 이다는 이식된 미 (해당 되는 경우에 그들은 형광 또는 colorized) 아가미 모세 혈관에 주입 품질, 수의 거친 상대 평가의 확인에 대 한 수의 시각화 주입 된 입자, 그리고 순환 혈액에서 직접 생리 측정 스펙트럼 신호 감지. Vivo에서 zebrafish 혈액 pH microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1, 원래에 제안 된 Borvinskaya를 사용 하 여의 측정을 위한 프로토콜 설명 설명된 기술의 가능한 응용 프로그램의 예를 들어, 외. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>형광 프로브. 다른 적절한 폴리머 결합 형광 염료를 마이크로캡슐 필러로 사용할 수 있습니다:</td></tr><tr><td>알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 접합체(FITC-BSA)SIGMA</td><td></td> <td>A9771</td><td>형광 프로브</td></tr><tr><td>, 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란(RITC-덱스트란)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>형광 프로브</td></tr>, <tr><td>염화칼슘</td>, <td>SIGMA</td><td>C1016</td>, <td>CaCO3 템플릿 형성</td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO3 템플릿 형성</td></tr><tr><td>폴리(알릴아민 염산염), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>양이온 고분자</td></tr><tr><td>폴리(4-스티렌설포네이트나트륨), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>음이온 고분자</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신[20 kDa], 폴리에틸렌 글리콜[5 kDa]과 접목, g = 3.0 - 4.5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)</td><td>마이크로캡슐의 생체 적합성을 높이기 위한 최종 폴리머</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>적용된 폴리머를 용해시키기 위해</td></tr><tr><td>정수 시스템</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>탈이온수 제조</td></tr><tr><td>CaCO3 템플릿 형성</td><td></td><td></td>을 위한 자석 교반기 Stegler <td></td></tr><tr><td>에펜도르프&nbsp; 연구&nbsp; 플러스 피펫, 1000 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>투여 솔루션</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 연구&nbsp; 플러스 피펫, 10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>분주 솔루션</td></tr><tr><td>피펫 팁, 부피 범위 200 - 1000 &마이크로; L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>투여 솔루션</td></tr><tr><td>피펫 팁, 부피 범위 0.1-10&nbsp; &뮤; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>분주 솔루션</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed</td><td>BioSan</td><td></td><td>마이크로캡슐 원심분리 세척 절차용</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Microcapsule synthesis and storage</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>마이크로캡슐 응집을 줄이기 위해</td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td></td><td></td><td>마이크로캡슐 응집을 줄이기 위해</td></tr><tr><td>헤드폰&nbsp;</td><td></td><td></td><td>초음파로부터 귀를 보호하기 위해</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>CaCO3 템플릿을 용해하려면</td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>pH 완충액의 제조</td></tr><tr><td>인산이나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>pH 완충액의 제조</td></tr> 수<tr><td>산화나트륨</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>EDTA 용액 및 완충액의 pH를 조정하기 위해</td></tr><tr><td>온도 조절기 챔버</td><td></td><td></td><td>유리 슬라이드에서 마이크로캡슐을 건조시키기 위해</td></tr><tr><td>적혈구 분석기 혈구 계수 챔버</td><td></td><td></td><td>준비된 마이크로캡슐의 크기 분포 및 농도를 조사하기 위해</td></tr><tr><td>형광 현미경 Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>물고기 혈액</td></tr> <tr><td>내 마이크로캡슐의 생체 내 시각화SNARF-1용 형광 필터 세트(현미경 모델에 따라 선택해야 함, 예시 제공)Chroma</td><td></td> <td>79010</td><td>형광 프로브를 사용한 마이크로캡슐 시각화</td></tr><tr><td>Fiber spectrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>현미경 하에서 마이크로캡슐 보정</td></tr><tr><td>광섬유 QP400-2-VIS NIR, 400 &mu; m, 2m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>분광계를 현미경 포트와 연결하기 위해</td></tr><tr><td>콜리메이터 F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>분광계를 현미경 포트와 연결하기 위해</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>현미경 하에서 마이크로캡슐 보정</td></tr><tr><td>Coverslips, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td> 현미경 <td>하에서</td></tr> <tr><td>마이크로캡슐 보정유리 미세 모세관 Intra MARK, 10 &micro; L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>물고기 혈액</td></tr><tr><td>정향 오일</td>을 수집하려면 <td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>물고기 마</td></tr>취 <tr><td>란셋 No 11</td><td>Apexmed international BV</td><td>P00588</td><td>물고기 꼬리를 자르고 인슐린 자기주사기의 끝에서 강철 바늘을 풀기 위해</td></tr><tr><td>헤파린, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>물고기 혈액 채취 중 물고기 혈액과 접촉하는 모든 표면 처리용</td></tr><tr><td>미세 전극이 있는 Seven 2 Go Pro pH</td> 측정기 <td>Mettler Toledo</td><td></td><td>물고기 혈액 pH</td></tr><tr><td>인슐린 펜 바늘 Micro-Fine Plus를 측정하려면 0.25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>주입 절차용. 모든 얇은 바늘 (&Oslash; 0.33mm 이하)이 적합합니다</td></tr><tr><td>유리 모세혈관, 1 x 75mm</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co</td><td>9201075</td><td>주입 절차용</td></tr><tr><td>가스 토치</td><td></td><td></td><td>강철 바늘을 유리 모세관에 납땜하기 위해</td></tr><tr><td>마이크로인젝터 IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>마이크로캡슐 현탁액</td></tr><tr><td>페트리 접시, 60mm x 15mm, 폴리스티렌</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>마취 하에 물고기를 이용한 조작용</td></tr><tr><td>플라스틱 숟가락</td><td></td><td></td><td>마취 중인 물고기를 이용한 조작용</td></tr><tr><td>축축한 스폰지</td><td></td><td></td><td>마취 중인 물고기를 이용한 조작용</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거하기 위해</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 3.5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>물고기 아가미를 적시려면</td></tr></tbody></table>

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.

얻은 결과 제시 프로토콜의 세 가지 주요 범주 중 하나에서 온: 형광 염료 (그림 1)에 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입의 캡슐화에 의해 형광 미의 형성 모세 혈관 (그림 2 및 3) 아가미와, 마지막으로, vivo에서 스펙트럼의 녹음 SNARF 1 형광 모니터링 하 혈액 pH 수준 (그림 4).
반대로의 계층으로 염료를 포함 하는 템플릿 CaCO3 코어의 코팅을 사용 하 여 레이어, 레이어 접근 청구 (PAH와 PSS) 고분자 및 생체 고분자 (PLL-g-PEG)의 가장 바깥쪽 레이어는 간...

이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

이 절차의 전반적인 목표는 물고기 신장에 주입하여 성인 제브라피쉬의 순환계에 미세 입자를 도입하는 기술을 시연하는 것입니다. 도입된 미립자는 물고기 아가미에서 생체 내 이미징의 간단한 기술에 의해 혈관 구조에서 추가로 시각화됩니다. 이 절차는 예를 들어, pH에 대한 마이크로 캡슐화된 형광 프로브를 도입하여 생체 내에서 물고기 혈액 pH를 반복적으로 측정하는 데 사용할 수 있습니다.이를 위해 첫 번째 단계에서 덱스트란과 접합된 pH에 민감한 염료 SNARF-1을 층별 접근법을 사용하여 반투과성 고분자 전해질 쉘에 캡슐화합니다. 형광 염료는 다공성 탄산칼슘 마이크로코어에 동시 침전되고, 코어는 반대 전하를 띤 비생분해성 폴리머의 여러 층으로 코팅되고 폴리에틸렌 글리콜을 함유한 생체 적합성 폴리머로 상부 코팅됩니다. 다음으로, 탄산칼슘 코어를 분해하여 SNARF-1을 둘러싸는 전체 마이크로캡슐을 얻습니다.물고기 마취 및 고정의 두 번째 단계에서는 준비된 마이크로캡슐을 동물의 신장에 직접 주입하여 캡슐화된 염료를 물고기 순환계로 전달합니다. 다음으로, 물고기 아가미의 아가미 덮개와 모세 혈관을 제거하기 위해 최소한의 수술이 필요합니다. 그런 다음 혈액 내 마이크로캡슐의 시각화와 형광 스펙트럼의 기록은 생체 내 현미경 검사로 생체 내 현미경으로 생체 내에서 수행하여 혈액 pH를 모니터링할 수 있습니다.주사가 올바르게 수행되면 시술 직후 물고기 아가미에서 형광 마이크로캡슐을 관찰할 수 있습니다. 캡슐화된 프로브의 형광 스펙트럼은 형광 현미경에 연결된 분광계를 사용하여 기록할 수 있습니다. SNARF-1에는 두 개의 방출 피크가 있으며, 이러한 피크에 해당하는 두 파장 간의 비율을 사용하여 pH를 측정할 수 있습니다.제안된 절차를 통해 형광 마이크로캡슐을 어류 순환계로 전달하고 생체 내에서 물고기 혈액의 형광을 원격으로 모니터링할 수 있습니다. 생리학적 연구의 경우, 이 방법의 주요 장점은 일반적으로 수행하기 어려운 소규모 실험실 동물에서 혈액 매개변수를 반복적으로 측정한다는 것입니다. 빛에 민감한 형광 프로브를 사용하는 경우 감광실에서 전체 절차를 수행하는 것이 좋습니다.여기에 선택한 폴리머 결합 형광 염료 용액 2 밀리리터 인 SNARF-1-dextran을 0.6 밀리리터의 1 몰 염화칼슘 용액과 0.6 밀리리터의 1 몰 탄산 나트륨 용액과 함께 빠르게 교반하면서 혼합합니다. 이 단계에서 형광 염료를 둘러싸고 있는 다공성 탄산칼슘 마이크로코어가 합성됩니다. 5, 10초 동안 교반한 후 현탁액을 2밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 15초 동안 원심분리하여 탄산칼슘 마이크로코어를 펠릿화합니다.상층액을 버리고 약 2ml의 탈이온수로 코어를 세척한 다음 현탁액을 흔듭니다. 원심분리와 세척 절차를 3회 반복합니다. 마이크로코어의 응집을 줄이기 위해 초음파 수조에서 1분 동안 현탁액을 배양합니다.양이온성 폴리머 PAH의 밀리리터당 4마이크로그램 용액 약 2밀리리터에 탄산칼슘 마이크로코어를 재현탁시켜 템플릿에 첫 번째 폴리머 층을 증착합니다. 마이크로코어를 pH 용액에 약 5분 동안 유지하고 지속적으로 흔듭니다. 15초 원심분리 후 PAH가 결합되지 않은 상층액을 버리고 여러 원심분리 및 세척 단계를 통해 마이크로코어를 물로 3회 세척합니다.음이온 폴리머 PSS의 밀리리터당 4밀리그램 용액으로 동일한 절차를 반복하여 템플릿에 두 번째 폴리머 층을 증착합니다. 다음 층을 추가하기 직전에, 초음파 수조에서 1 분 배양을 적용하는 것이 좋습니다. 양이온성 및 음이온성 폴리머의 증착을 순차적으로 6회 반복하여 12층 마이크로캡슐 껍질을 얻습니다.다음으로, 폴리에틸렌 글리콜이 접목된 폴리-L-라이신의 껍질이 있는 마이크로코어를 최소 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 순차적인 원심분리와 재현탁액으로 덮인 마이크로코어를 물로 한 번 세척합니다. 마지막으로, pH 약 7.1로 조정된 2ml의 0.1몰 EDTA 용액에 탄산칼슘 템플릿을 용해시켜 속이 빈 마이크로캡슐을 얻습니다.45초 원심분리 후 상등액을 버리고 EDTA로 두 번 세척을 반복합니다. 45초 원심분리 후 상층액을 버리고 식염수 2ml를 첨가합니다. 식염수로 세척 원심분리 단계를 3회 반복합니다.형광 현미경으로 혈구계에서 준비된 마이크로캡슐의 크기 분포 및 농도를 조사합니다. ImageJ 또는 이와 동등한 소프트웨어를 사용하여 입자의 크기를 분석합니다. 얻은 캡슐화된 프로브를 어두운 곳에 보관하십시오.광학 시스템을 준비하려면 적용된 형광 염료의 특성에 따라 필요한 형광 필터 세트를 형광 현미경에 놓고 형광등을 켭니다. 레버를 접안렌즈로 당겨 빼냅니다. 광섬유의 한쪽 끝을 분광계에 연결하고 다른 쪽 끝을 시준기에 연결합니다.어댑터를 사용하여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 사용 가능한 다른 포트에서 시준기를 재생합니다. 준비된 마이크로캡슐의 보정을 위해 약 5마이크로리터의 마이크로캡슐 현탁액을 현미경 슬라이드에 놓고 어두운 곳에서 방울을 건조시킵니다. 분광계를 켭니다.분광계 제어 프로그램을 실행하고 측정을 위해 분광계를 준비합니다. 마이크로 캡슐화된 SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정하려면 pH가 다른 일련의 버퍼를 사용하십시오. SNARF-1이 함유된 건조된 마이크로캡슐에 약 10마이크로리터의 나트륨 완충액을 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다.현미경 스테이지에 유리 슬라이드를 놓습니다. 약 400 배율을 사용하여 마이크로캡슐을 찾습니다. 현미경 레버를 카메라 포트로 돌립니다.분광계에 형광을 등록합니다. 스펙트럼 신호가 배경 수준을 훨씬 벗어나 있는지 확인하고 마이크로캡슐이 기포 안에 있지 않은지 관찰합니다. SNARF-1이 광표백에 민감한 것과 동일한 마이크로캡슐의 장기간 조명을 피하십시오.레버를 접안렌즈로 다시 돌립니다. protonated 및 deprotonated dye의 emission peaks에 해당하는 파장에서 encapsulated SNARF-1의 형광 강도 비율을 계산합니다. 매체의 pH에 대한 비율 의존성의 검량선을 구축합니다.안락사된 물고기에서 약 10마이크로리터의 혈액을 수집합니다. 미세 전극을 사용하여 pH 측정기로 pH를 측정합니다. 그런 다음 건조된 마이크로캡슐이 있는 슬라이드에 혈액을 떨어뜨리고 보정 버퍼에 대해 설명된 대로 형광 강도의 비율을 등록합니다.캡슐화된 SNARF-1의 판독에 대한 혈액 성분의 영향을 고려해야 하므로 검량선의 선형 계수를 조정하여 곡선이 어류의 혈액 측정값과 일치하도록 합니다. 주사 바늘을 준비하려면 날카로운 란셋으로 플라스틱을 제거하여 인슐린 주사기 끝에서 강철 바늘을 풀어줍니다. 바늘을 유리 미세 모세관에 반쯤 삽입합니다.가스 토치로 빠르고 부드럽게 납땜하십시오. 유리 마이크로캐필러리를 마이크로인젝터에 연결하고 멸균수로 3회 세척합니다. 액체가 바늘을 통해 흐르는지 확인하십시오.시스템에 물을 채웁니다. 시스템에 기포가 없는지 확인하십시오. 실험 당일, 마이크로리터당 1/2에서 600만 개의 마이크로캡슐을 포함하는 멸균 식염수에 준비된 마이크로캡슐 현탁액을 취합니다.초음파 수조로 1 분 동안 다시 매달아 두십시오. 다음 주입 중에는 주기적으로 바이알을 흔들어 마이크로캡슐을 재현탁하고 응집을 방지합니다. 숟가락을 사용하여 생선을 마취제에서 꺼내고 젖은 스펀지에 부드럽게 올려 놓고 오른손잡이인 경우 머리를 왼쪽으로, 왼손잡이인 경우 오른쪽을 향하게 합니다.주사 직전에 마이크로 인젝터로 연결된 유리 모세관으로 1-2mm의 공기를 빨아들입니다. 그런 다음 약 2마이크로리터의 분산된 마이크로캡슐을 로드합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 스펀지에 물고기의 몸을 부드럽게 안정시킵니다.물고기 측선을 찾으십시오. 바늘을 측선의 복부 부분 중간 지점에서 1mm 아래에 놓습니다. 그런 다음 긁는 동작으로 물고기 비늘을 옆으로 옮기고 구멍을 뚫습니다.테이블 표면에 대해 45도 각도로 바늘을 본체에 삽입합니다. 바늘이 척추에 조심스럽게 닿을 때까지 바늘을 척추 쪽으로 밉니다. 그런 다음 약 1마이크로리터의 마이크로캡슐 현탁액을 신장으로 천천히 방출하고 바늘을 천천히 빼냅니다.주사 부위에 엎질러진 마이크로캡슐을 제거하기 위해 물줄기로 물고기를 머리부터 꼬리까지 헹굽니다. 해부 가위를 사용하여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거하고 물고기 아가미를 벗겨냅니다. 아가미를 물로 헹굽니다.숟가락을 사용하여 물고기를 현미경 슬라이드로 옮기고 형광 현미경의 무대에 놓습니다. 다음 절차를 수행할 때 물고기의 아가미가 마르지 않도록 하십시오. 이렇게하려면 파스퇴르 피펫을 사용하여 주기적으로 물을 적셔주세요.방을 어둡게 하고 저배율을 사용하여 아가미를 검사하여 형광 마이크로캡슐을 찾습니다. 렌즈를 찾으면 렌즈를 더 높은 크기로 전환하고 시야의 중앙에 배치합니다. 연결된 분광계가 있는 포트로 레버를 돌립니다.스펙트럼 신호를 기록합니다. 레버를 접안렌즈로 다시 돌립니다. 다른 마이크로캡슐에 대한 측정을 여러 번 반복합니다.회복을 위해 적절한 폭기로 물고기를 수족관으로 옮깁니다. 측정 절차는 반복 마취 또는 다른 고정 방법을 사용하여 한 개인에 대해 여러 번 반복 할 수 있습니다. 사진은 캡슐화된 형광 염료 SNARF-1에 의한 제브라피시 혈액과 하이퍼칼슘니아의 생체 내 측정의 대표적인 예를 보여줍니다.대조군 조건에서 혈액 pH는 마이크로캡슐 주입 후 4시간 동안 안정적으로 유지되는 반면, 높은 이산화탄소에 5분 노출되면 물고기 혈액의 산성화가 발생합니다. 시술을 진행하는 동안 취급 및 수술로 인한 동물의 스트레스를 최소화하는 것이 중요합니다. 약간의 연습을 통해 주입 및 신호 등록은 평균 약 2-3분이 걸리므로 이 프로토콜을 사용하면 물고기가 가벼운 마취에서 깨어나기 전에 조작을 완료할 수 있습니다.시술하는 동안 물고기의 아가미가 항상 촉촉한지 확인하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 작은 물고기의 순환계에 미세 입자를 간단하고 효과적으로 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 입증된 바와 같이, 이 기술은 형광 프로브로 채워진 마이크로캡슐을 사용하여 성인 제브라피시의 혈액 pH를 반복적으로 생체 내에서 기록하는 데 매우 편리합니다.

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 성인 zebrafish에서 역전사 궤도 주사를하는 방법을 보여줍니다.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

우리는 이일 이후 fetilization (DPF) 급성 신장 손상 (아키)를 유도하기 위해 zebrafish의 유충에 aminoglycoside, gentamicin을 microinjecting의 기술을 설명합니다. 우리는 또한 전체 탑재 immunohistochemistry하는 방법을 설명, 플라스틱 포함하고 아키 인한 손상을 시각화하기 위해 zebrafish 애벌레의 sectioning.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

화학 요법으로 항생제에 이르기까지 약물을 포함 nephrotoxins에서 발생하는 신장 손상은, 그 발병 기전 불완전하게 이해 남아 복잡한 질환이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라는 신장 보호 대책의 식별에 적용 할 수있는 이러한 조건의 질병 모델에 사용할 수있는 방법을 보여준다.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

이 프로토콜에는 신장에 특히 transgene 식 생산 하 신 골반을 통해 마우스 신장에 플라스 미드 DNA를 주입 하는 방법을 설명 합니다.

유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

선물이 2 광자 현미경은 micropipette 쥐, 보 먼의 요도 공간 배치의 사용의 신장 생리학의 2 기초 기술을 결합. 2 광자 현미경의 사용 micropuncture 신장 생리학 연구에 대 한 기존의 현미경의 중요 한 한계를 극복 한다.

보 먼의 공간 2 광자 현미경에 의해 촉진 생쥐에서의 Micropuncture

이 방법은 성인 zebrafish의 흉부에 용액의 0.5-3 μ l의 주입에 의존 한다. 이 절차는 장기를 손상 시 키 지 않고 제 브라 피쉬 심장의 근접으로 단백질과 화학 물질을 효율적으로 전달 합니다. 접근법은 심장의 다양 한 조직에 대 한 외 인 성 인자의 효과를 테스트 하는 데 적합 합니다.

성인 제 브라 피시 하트 연구를 위한 흉부 내 주사

성체 제브라피시에서 새로운 복강내(IP) 주사 방법에 대해 설명합니다. 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성 화합물을 취급할 때 이 절차는 이전에 보고된 두 가지 IP 방법보다 더 효과적입니다. 이 기술은 제브라피시 모델에 대한 경험이 제한된 연구원들이 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었습니다.

성체 제브라피시의 복강 내 주사 기법으로 신체 손상 및 관련 폐사율을 최소화합니다.

여기에서는 성체 제브라피쉬에 세포 또는 약리학적 제제를 정맥 주사하여 세포 생착을 강화하고 치료된 제브라피시의 생존율을 높이기 위한 최적화되고 효과적인 프로토콜을 제시합니다.

성체 제브라피쉬에 최적화된 정맥 주사

배우세요 성어 Danio rerio의 신장 주사를 통한 미세입자 순환계 도입 및 아가미 활체영상 기법. 이 방법은 형광 프로브를 이용한 반복적인 혈액 pH 측정에 활용됩니다.

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

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