간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 물고기 신장에 주입하여 성인 제브라피쉬의 순환계에 미세 입자를 도입하는 기술을 시연하는 것입니다. 도입된 미립자는 물고기 아가미에서 생체 내 이미징의 간단한 기술에 의해 혈관 구조에서 추가로 시각화됩니다. 이 절차는 예를 들어, pH에 대한 마이크로 캡슐화된 형광 프로브를 도입하여 생체 내에서 물고기 혈액 pH를 반복적으로 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

이를 위해 첫 번째 단계에서 덱스트란과 접합된 pH에 민감한 염료 SNARF-1을 층별 접근법을 사용하여 반투과성 고분자 전해질 쉘에 캡슐화합니다. 형광 염료는 다공성 탄산칼슘 마이크로코어에 동시 침전되고, 코어는 반대 전하를 띤 비생분해성 폴리머의 여러 층으로 코팅되고 폴리에틸렌 글리콜을 함유한 생체 적합성 폴리머로 상부 코팅됩니다. 다음으로, 탄산칼슘 코어를 분해하여 SNARF-1을 둘러싸는 전체 마이크로캡슐을 얻습니다.

물고기 마취 및 고정의 두 번째 단계에서는 준비된 마이크로캡슐을 동물의 신장에 직접 주입하여 캡슐화된 염료를 물고기 순환계로 전달합니다. 다음으로, 물고기 아가미의 아가미 덮개와 모세 혈관을 제거하기 위해 최소한의 수술이 필요합니다. 그런 다음 혈액 내 마이크로캡슐의 시각화와 형광 스펙트럼의 기록은 생체 내 현미경 검사로 생체 내 현미경으로 생체 내에서 수행하여 혈액 pH를 모니터링할 수 있습니다.

주사가 올바르게 수행되면 시술 직후 물고기 아가미에서 형광 마이크로캡슐을 관찰할 수 있습니다. 캡슐화된 프로브의 형광 스펙트럼은 형광 현미경에 연결된 분광계를 사용하여 기록할 수 있습니다. SNARF-1에는 두 개의 방출 피크가 있으며, 이러한 피크에 해당하는 두 파장 간의 비율을 사용하여 pH를 측정할 수 있습니다.

제안된 절차를 통해 형광 마이크로캡슐을 어류 순환계로 전달하고 생체 내에서 물고기 혈액의 형광을 원격으로 모니터링할 수 있습니다. 생리학적 연구의 경우, 이 방법의 주요 장점은 일반적으로 수행하기 어려운 소규모 실험실 동물에서 혈액 매개변수를 반복적으로 측정한다는 것입니다. 빛에 민감한 형광 프로브를 사용하는 경우 감광실에서 전체 절차를 수행하는 것이 좋습니다.

여기에 선택한 폴리머 결합 형광 염료 용액 2 밀리리터 인 SNARF-1-dextran을 0.6 밀리리터의 1 몰 염화칼슘 용액과 0.6 밀리리터의 1 몰 탄산 나트륨 용액과 함께 빠르게 교반하면서 혼합합니다. 이 단계에서 형광 염료를 둘러싸고 있는 다공성 탄산칼슘 마이크로코어가 합성됩니다. 5, 10초 동안 교반한 후 현탁액을 2밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 15초 동안 원심분리하여 탄산칼슘 마이크로코어를 펠릿화합니다.

상층액을 버리고 약 2ml의 탈이온수로 코어를 세척한 다음 현탁액을 흔듭니다. 원심분리와 세척 절차를 3회 반복합니다. 마이크로코어의 응집을 줄이기 위해 초음파 수조에서 1분 동안 현탁액을 배양합니다.

양이온성 폴리머 PAH의 밀리리터당 4마이크로그램 용액 약 2밀리리터에 탄산칼슘 마이크로코어를 재현탁시켜 템플릿에 첫 번째 폴리머 층을 증착합니다. 마이크로코어를 pH 용액에 약 5분 동안 유지하고 지속적으로 흔듭니다. 15초 원심분리 후 PAH가 결합되지 않은 상층액을 버리고 여러 원심분리 및 세척 단계를 통해 마이크로코어를 물로 3회 세척합니다.

음이온 폴리머 PSS의 밀리리터당 4밀리그램 용액으로 동일한 절차를 반복하여 템플릿에 두 번째 폴리머 층을 증착합니다. 다음 층을 추가하기 직전에, 초음파 수조에서 1 분 배양을 적용하는 것이 좋습니다. 양이온성 및 음이온성 폴리머의 증착을 순차적으로 6회 반복하여 12층 마이크로캡슐 껍질을 얻습니다.

다음으로, 폴리에틸렌 글리콜이 접목된 폴리-L-라이신의 껍질이 있는 마이크로코어를 최소 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 순차적인 원심분리와 재현탁액으로 덮인 마이크로코어를 물로 한 번 세척합니다. 마지막으로, pH 약 7.1로 조정된 2ml의 0.1몰 EDTA 용액에 탄산칼슘 템플릿을 용해시켜 속이 빈 마이크로캡슐을 얻습니다.

45초 원심분리 후 상등액을 버리고 EDTA로 두 번 세척을 반복합니다. 45초 원심분리 후 상층액을 버리고 식염수 2ml를 첨가합니다. 식염수로 세척 원심분리 단계를 3회 반복합니다.

형광 현미경으로 혈구계에서 준비된 마이크로캡슐의 크기 분포 및 농도를 조사합니다. ImageJ 또는 이와 동등한 소프트웨어를 사용하여 입자의 크기를 분석합니다. 얻은 캡슐화된 프로브를 어두운 곳에 보관하십시오.

광학 시스템을 준비하려면 적용된 형광 염료의 특성에 따라 필요한 형광 필터 세트를 형광 현미경에 놓고 형광등을 켭니다. 레버를 접안렌즈로 당겨 빼냅니다. 광섬유의 한쪽 끝을 분광계에 연결하고 다른 쪽 끝을 시준기에 연결합니다.

어댑터를 사용하여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 사용 가능한 다른 포트에서 시준기를 재생합니다. 준비된 마이크로캡슐의 보정을 위해 약 5마이크로리터의 마이크로캡슐 현탁액을 현미경 슬라이드에 놓고 어두운 곳에서 방울을 건조시킵니다. 분광계를 켭니다.

분광계 제어 프로그램을 실행하고 측정을 위해 분광계를 준비합니다. 마이크로 캡슐화된 SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정하려면 pH가 다른 일련의 버퍼를 사용하십시오. SNARF-1이 함유된 건조된 마이크로캡슐에 약 10마이크로리터의 나트륨 완충액을 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다.

현미경 스테이지에 유리 슬라이드를 놓습니다. 약 400 배율을 사용하여 마이크로캡슐을 찾습니다. 현미경 레버를 카메라 포트로 돌립니다.

분광계에 형광을 등록합니다. 스펙트럼 신호가 배경 수준을 훨씬 벗어나 있는지 확인하고 마이크로캡슐이 기포 안에 있지 않은지 관찰합니다. SNARF-1이 광표백에 민감한 것과 동일한 마이크로캡슐의 장기간 조명을 피하십시오.

레버를 접안렌즈로 다시 돌립니다. protonated 및 deprotonated dye의 emission peaks에 해당하는 파장에서 encapsulated SNARF-1의 형광 강도 비율을 계산합니다. 매체의 pH에 대한 비율 의존성의 검량선을 구축합니다.

안락사된 물고기에서 약 10마이크로리터의 혈액을 수집합니다. 미세 전극을 사용하여 pH 측정기로 pH를 측정합니다. 그런 다음 건조된 마이크로캡슐이 있는 슬라이드에 혈액을 떨어뜨리고 보정 버퍼에 대해 설명된 대로 형광 강도의 비율을 등록합니다.

캡슐화된 SNARF-1의 판독에 대한 혈액 성분의 영향을 고려해야 하므로 검량선의 선형 계수를 조정하여 곡선이 어류의 혈액 측정값과 일치하도록 합니다. 주사 바늘을 준비하려면 날카로운 란셋으로 플라스틱을 제거하여 인슐린 주사기 끝에서 강철 바늘을 풀어줍니다. 바늘을 유리 미세 모세관에 반쯤 삽입합니다.

가스 토치로 빠르고 부드럽게 납땜하십시오. 유리 마이크로캐필러리를 마이크로인젝터에 연결하고 멸균수로 3회 세척합니다. 액체가 바늘을 통해 흐르는지 확인하십시오.

시스템에 물을 채웁니다. 시스템에 기포가 없는지 확인하십시오. 실험 당일, 마이크로리터당 1/2에서 600만 개의 마이크로캡슐을 포함하는 멸균 식염수에 준비된 마이크로캡슐 현탁액을 취합니다.

초음파 수조로 1 분 동안 다시 매달아 두십시오. 다음 주입 중에는 주기적으로 바이알을 흔들어 마이크로캡슐을 재현탁하고 응집을 방지합니다. 숟가락을 사용하여 생선을 마취제에서 꺼내고 젖은 스펀지에 부드럽게 올려 놓고 오른손잡이인 경우 머리를 왼쪽으로, 왼손잡이인 경우 오른쪽을 향하게 합니다.

주사 직전에 마이크로 인젝터로 연결된 유리 모세관으로 1-2mm의 공기를 빨아들입니다. 그런 다음 약 2마이크로리터의 분산된 마이크로캡슐을 로드합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 스펀지에 물고기의 몸을 부드럽게 안정시킵니다.

물고기 측선을 찾으십시오. 바늘을 측선의 복부 부분 중간 지점에서 1mm 아래에 놓습니다. 그런 다음 긁는 동작으로 물고기 비늘을 옆으로 옮기고 구멍을 뚫습니다.

테이블 표면에 대해 45도 각도로 바늘을 본체에 삽입합니다. 바늘이 척추에 조심스럽게 닿을 때까지 바늘을 척추 쪽으로 밉니다. 그런 다음 약 1마이크로리터의 마이크로캡슐 현탁액을 신장으로 천천히 방출하고 바늘을 천천히 빼냅니다.

주사 부위에 엎질러진 마이크로캡슐을 제거하기 위해 물줄기로 물고기를 머리부터 꼬리까지 헹굽니다. 해부 가위를 사용하여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거하고 물고기 아가미를 벗겨냅니다. 아가미를 물로 헹굽니다.

숟가락을 사용하여 물고기를 현미경 슬라이드로 옮기고 형광 현미경의 무대에 놓습니다. 다음 절차를 수행할 때 물고기의 아가미가 마르지 않도록 하십시오. 이렇게하려면 파스퇴르 피펫을 사용하여 주기적으로 물을 적셔주세요.

방을 어둡게 하고 저배율을 사용하여 아가미를 검사하여 형광 마이크로캡슐을 찾습니다. 렌즈를 찾으면 렌즈를 더 높은 크기로 전환하고 시야의 중앙에 배치합니다. 연결된 분광계가 있는 포트로 레버를 돌립니다.

스펙트럼 신호를 기록합니다. 레버를 접안렌즈로 다시 돌립니다. 다른 마이크로캡슐에 대한 측정을 여러 번 반복합니다.

회복을 위해 적절한 폭기로 물고기를 수족관으로 옮깁니다. 측정 절차는 반복 마취 또는 다른 고정 방법을 사용하여 한 개인에 대해 여러 번 반복 할 수 있습니다. 사진은 캡슐화된 형광 염료 SNARF-1에 의한 제브라피시 혈액과 하이퍼칼슘니아의 생체 내 측정의 대표적인 예를 보여줍니다.

대조군 조건에서 혈액 pH는 마이크로캡슐 주입 후 4시간 동안 안정적으로 유지되는 반면, 높은 이산화탄소에 5분 노출되면 물고기 혈액의 산성화가 발생합니다. 시술을 진행하는 동안 취급 및 수술로 인한 동물의 스트레스를 최소화하는 것이 중요합니다. 약간의 연습을 통해 주입 및 신호 등록은 평균 약 2-3분이 걸리므로 이 프로토콜을 사용하면 물고기가 가벼운 마취에서 깨어나기 전에 조작을 완료할 수 있습니다.

시술하는 동안 물고기의 아가미가 항상 촉촉한지 확인하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 작은 물고기의 순환계에 미세 입자를 간단하고 효과적으로 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 입증된 바와 같이, 이 기술은 형광 프로브로 채워진 마이크로캡슐을 사용하여 성인 제브라피시의 혈액 pH를 반복적으로 생체 내에서 기록하는 데 매우 편리합니다.