최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

이 방법론의 전반적인 목표는 저브라피쉬 유충의 미세 주입을 더 쉽고 정확하게 만드는 것입니다. 이 방법은 제브라피시 모델 시스템을 사용하는 연구자가 제브라피시 유충을 대규모 어레이에서 특정 방향으로 고정하는 데 도움이 됩니다. 이 기술을 사용하면 미세 주입 및 이미징을 위해 특정 조직에 더 쉽게 접근할 수 있으며 감염 또는 이종 이식편 암 모델과 같은 응용 분야에 많은 수의 유충이 필요한 경우에 매우 효과적입니다.

제브라피시 모델에 대한 저의 제작 전략은 매우 상호 보완적입니다. 하나는 인간이 만든 단순한 것입니다. 다른 하나는 생생하고 복잡합니다.

둘 다 동일한 크기 척도를 공유합니다. 둘 다 투명합니다. 또한 둘 다 단일 세포 분해능에서 관찰을 가능하게 합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 이 둘은 쉽게 결합할 수 있으며 거의 모든 주요 질병 연구에 적용할 수 있습니다. E-3 박막으로 덮인 페트리 접시에서 PDMS 블록을 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 전달 피펫을 사용하여 필요한 수의 배아를 PDMS 블록 표면으로 전달합니다. 헤어 루프 또는 유사한 도구를 사용하여 배아를 특히 등쪽 및 복부 방향의 미세 구조 디봇으로 밀어 넣습니다.

디봇에 유충을 적재할 때 쉽게 조작할 수 있도록 PDMS 블록을 덮는 충분한 물을 확보하는 것이 중요합니다. 주입하는 동안 제자리에 남아 있도록 디봇 안으로 밀어 넣는 것도 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이전에 준비된 미세구조 채널에서 제브라피시를 유도하려면 전송 피펫을 사용하여 패턴화된 PDMS 블록에서 E-3를 끌어냅니다.

E-3의 수준은 블록의 가장자리 아래로 떨어져야하지만 여전히 저장소와 채널에 존재해야하며 PDMS에 얇은 층이 남아 있습니다. 이송 피펫을 사용하여 마취된 배아 10개를 저장소로 옮기되 가장자리가 넘치지 않도록 주의합니다. 헤어 루프를 사용하여 각 배아를 먼저 적절한 채널의 입구에서 깔때기 머리로 조작하여 배아가 채널로 들어갈 때 적절한 방향을 갖도록 합니다.

그런 다음 헤어 루프를 사용하여 각 배아를 채널 아래로 밀어 제자리에 유지하는 채널 벽의 방향 미세에 도달할 때까지 배아를 채널 아래로 밀어 넣습니다. 미세주사 바늘과 미세주사 용액을 준비한 후 미세하게 가늘어진 피펫 팁을 사용하여 용액 5마이크로리터를 바늘에 넣습니다. 마그네틱 스탠드에 장착된 마이크로 매니퓰레이터에 바늘을 장착하고 PICO 펌프 마이크로인젝터에 연결합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 가늘어진 끝을 꼬집어 바늘 끝을 45도 각도로 부러뜨립니다. PICO 펌프 컨트롤러에서 주입 시간을 조정하여 주입 볼루스 크기를 1나노리터로 조정합니다. micromanipulation 컨트롤러에서 microinjection 바늘의 각도를 배아의 길이와 평행한 바늘로 45도부터 조정합니다.

미세주입 중 배아의 측면 이동을 최소화하기 위해 더 가파른 각도를 사용할 수 있습니다. 왼손으로 페트리 접시를 제어하고 오른손으로 필요한 미세 조작기를 제어하여 바늘을 이낭과 같은 미세 주입의 의도 된 위치에 가능한 한 가깝게 가져옵니다. micromanipulation 컨트롤러를 사용하여 바늘을 대상 조직에 삽입하고 PICO 펌프 풋 스위치를 사용하여 미리 설정된 부피를 주입합니다.

조직이 침투에 저항하면 micromanipulation 컨트롤러 손잡이를 부드럽게 두드립니다. 배아를 방출하려면 이송 피펫을 사용하여 E-3를 위에서 아래로 표면 위로 흐르게 하거나 배아가 주변 E-3로 방출되도록 접시를 휘젓습니다. 배아를 MS-222가 없는 E-3의 회수 접시로 옮깁니다.

6개의 웰 플레이트의 웰에서 PDMS 장치를 사용하여 배아를 스크리닝하려면 1, 000 마이크로리터 피펫 또는 팁이 좁은 이송 피펫을 사용하여 E-3을 포트를 통해 흐르게 하여 장치를 프라이밍합니다. E-3 및 MS-222를 사용하여 장치가 덮일 때까지 우물을 채웁니다. 그런 다음 이송 피펫을 사용하여 이전에 주입된 4개의 배아를 각 웰에 전달합니다.

헤어 루프 또는 유사한 도구를 사용하여 이미징 채널의 입구에 원하는 방향으로 배아를 배치하고 부분적으로 장치에 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 장치에 고르게 끌어들이는 데 도움이 됩니다. 1, 000 마이크로리터 피펫 또는 이송 피펫을 사용하여 배아가 이미징을 위해 올바른 방향으로 채널로 유입될 때까지 포트에서 장치를 통해 E-3을 끌어냅니다.

웰 플레이트를 도립 형광 현미경으로 옮깁니다. 배아를 이미지화하려면 제브라피시 네투라오힐 이동을 촬영하기 위한 10x와 같은 적절한 렌즈를 선택하여 배율을 조정합니다. 각 채널의 광원 강도와 노출 시간을 조정하여 각 신호가 선명하지만 포화되지 않도록 합니다.

마지막으로, 각 형광등 및 투과 채널에 대한 이미지를 캡처합니다. 측면 방향의 배아를 안정화하기 위해 미세 구조 채널 장치를 사용하여 수정 후 이틀 동안 제브라피시 배아를 이낭에 미세주입한 표준 화학유인물질 fMLP 및 LTB4에 반응하는 호중구의 능력을 테스트했습니다. 호중구 동원을 시각화하기 위해 고분자량 로다민 덱스트란(rhodamine dextran)으로 주사를 추적하고 녹색 형광 호중구를 가진 형질전환 배아에서 주사를 수행했습니다.

주입되지 않은 배아와 로다민만 주입된 배아를 음성 대조군으로 사용하였다. 미세주입 후, 배아를 이미징 채널 장치로 옮기고 주입 후 30분 및 5시간에 EVOS 형광 현미경을 사용하여 이미지화했습니다. 예상대로, 소수의 형광 호중구가 이른 시점에 모의 주입된 이낭에 동원되었는데, 이는 손상된 매개된 동원에 기인하는 것으로 보입니다.

흥미롭게도, 로다민 덱스트란 추적자는 실험 중에 이석에 축적되는 것이 관찰되었습니다. 두 화학유인물질 모두, 호중구는 특히 LTB4에 대한 반응으로 더 높은 숫자로 동원되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제브라피시 미세 주입의 속도와 정확성을 크게 향상시킬 수 있습니다.

이 기술의 개발은 우리 실험실의 특정 과제에 의해 주도되었습니다. 우리는 제브라피시 모델의 진균 감염 및 종양 이종이식편에 대한 프로젝트의 요구 사항에 맞게 이 접근 방식을 개선했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 미세 주입 및 확장된 라이브 이미징을 위해 미세 구조 표면 어레이를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.