Name: 최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 제브라피시 애벌레의 미세주입 및 이미징을 위한 미세구조 장치 활용법. 이 방법은 Danio rerio를 고정하여 조직 표적화 정확도를 높이고 대규모 감염 및 종양 연구에 효과적입니다.

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저자는 데이비드 란 게 나 우 수족관 공간; 아낌없이 제공 감사 하 고 싶습니다. 에릭 스톤, 존 C. 무어와 진 탕에 대 한 여기에 사용 된 zebrafish 스트레인 조달에 대 한 레너드 Zon의 연구소에서 zebrafish 유지 보수 및 시 약, 및 앤 로버트 슨와 엘리엇 Hagedorn 도움이. 그들은 또한 옥 타 비오 Hurtado photolithographic 기술에 대 한 조언을 감사 하 고 싶습니다. FE는 어린이 미국 호주 협회 위한 Shriner의 병원에서 동호회에 의해 투자 되었다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 되었다 GM92804를 부여.

애벌레의 microinjection 프로토콜 2011N000127에서 매사 추세 츠 종합 병원 분과 연구 동물 관리에 의해 승인 되었다.
1. 장치 제조
참고: 모든 컴퓨터 보조 그리기 (CAD) 파일 여기에서 설명 하는 사진 평판 마스크를 디자인 하는 데 사용 (그림 1) 다운로드를 위해 사용할 수 있습니다. 링크 테이블의 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>표준 photolithographic 기법7를 사용 하 여 클래스 1000 클린 룸에 마스터 형 웨이퍼를 조작. 미세 배열 및 채널에 대 한 제조업체의 지침에 따라 순차적으로 3 별도 마스크를 사용 하 여 3 계층에 에폭시 기반 부정적인 감광 제 패턴: 얕은 기능에 대 한 100 µ m, 중간 기능에 대 한 200 µ m 및 400 µ m에 대 한 깊은 기능. 이미징 장치에 대 한 두 가지 패턴 레이어 얕은 기능과 깊은 기능에 대 한 600 µ m에 대 한 400 µ m를 사용 하 여 경우</li>
	<li>15 cm (그림 2)을 주조에 대 한 페 트리 접시의 기초를 완성 된 웨이퍼를 테이프.</li>
</ol>2. Microstructured 표면 배열-PDMS의 준비
<ol><li>장치를 사용할 수 있도록입니다 (PDMS), 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. 초기자의 5 g PDMS 단위체의 50 g을 결합 하 고 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.</li>
	<li>1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.</li>
	<li>치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.</li>
	<li>메스의 팁과 웨이퍼 표면 사이 접촉을 유지 하는 메스를 사용 하 여 마스터 웨이퍼 장치 주위 잘라 신중 하 게 합니다. 집게를 사용 하 여, 웨이퍼와 깨끗 한 10 cm 배양 접시, 기능 쪽 (그림 3)에 PDMS 복제 껍질.</li>
	<li>산소 플라즈마 35 플라즈마 오븐을 사용 하 여 장치 취급 hydrophobicity를 줄이기 위해 s.</li>
	<li>Zebrafish 태아 매체 (E3) 168 mg/L 에틸 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5)의 포함 된 커버. 전송 피 펫을 사용 하 여 장치의 표면에 물이 흐르는 깊은 기능에서 모든 거품을 제거 합니다.</li>
</ol>3. Microstructured 표면 배열-Agarose의 준비
<ol><li>네거티브 PDMS 몰드를 만들기 위해 먼저 산소 플라즈마와 PDMS 장치 취급.</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 불활성 표면8만들려고 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) 실 란 증기 PDMS 장치 취급. 간단히:
	<ol>
<li>수 처리 기능-사이드 업 연기 후드 내에서 진공 챔버에 PDMS를 놓습니다.</li>
		<li>PDMS, 옆 작은 오픈 유리 또는 알루미늄 접시를 놓고 신중 하 게 PFDTS의 200 µ L 플라스틱 (98 %silane) 접시에. 주의: PFDTS silane 높은 휘발성은, 물으로 강력 하 게 반응, 가연성 이며 접촉에 심각한 피부 및 안구 손상의 원인. 사용 하기 전에 자세히 읽기 MSDS입니다.</li>
		<li>진공 챔버를 닫고 진공 15-30 분, 또는 PFDTS silane 완전히 증발 때까지 적용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장치를 페 트리 접시에 놓고 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 준비 신선한 PDMS 몰드로 사용 합니다.</li>
	<li>적어도 3 h, 65 ° C에서 구워 다음 처리 장치에서 신선한 PDMS의 전체 레이어를 껍질과 신선한 배양 접시에 놓습니다. 이 다음 agarose를 부정적인 형으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Agarose를 준비 하려면 낮은 고 온도 agarose E3에서 전자 레인지에서의 2% 솔루션은 agarose는 완전히 녹아 때까지 끓인 다.</li>
	<li>부정적인 PDMS 몰드에 붓는 뜨거운 agarose 고 흐르는 뜨거운 agarose에 의해 전송 피 펫을 사용 하 여 기능 장치 취재 agarose에서 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>일단 거품이 제거 되는 agarose 설정 하 4 ° C에서 냉동.</li>
	<li>손으로 밑에서 PDMS를 변형 하 여 부정적인 PDMS 몰드에서 agarose 블록을 제거, 새로운 배양 접시, 및 MS-222를 포함 하는 e 3와 젖은 agarose 블록을 전송 합니다.</li>
</ol>4입니다. PDMS 이미징 장치 준비
<ol><li>장치를 사용할 수 있도록, PDMS, 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. PDMS 단위체의 50 g 5 g (동일 단계 2.1에서에서 사용) 초기자 및 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합 결합.</li>
	<li>신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.</li>
	<li>1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.</li>
	<li>치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.</li>
	<li>마스터 웨이퍼에서 소자를 잘라내어 포트 1.5 m m 펀치를 사용 하 여 밖으로 펀치.</li>
	<li>치료 장치 및 6-잘 유리 하단 잘 산소 플라즈마 35 접시 s, 단계 2.6에에서 설명 된 대로.</li>
	<li>10 분 동안 85 ° C 열판에 그것을 배치 하 여 한 장치 기능-사이드-아래 6 잘 플레이트의 각 유리 coverslip에 본드. 참고: 확인 하 고 성공적인 결합, 한쪽 집게를 사용 하 여 보 세 장치 회사 압력을 적용. 장치는 유리 coverslip에 연결 된 유지 되어야 합니다.</li>
</ol>5. 제 브라 문화
<ol><li>표준 기술3를 사용 하 여 2 dpf 문화 zebrafish 태아.</li>
	<li>Dechorionate 배아 포 셉 또는 1 mg/mL 효소를 사용 하 여 그들을 수 있도록 장치에 로드 하기 전에 적어도 30-60 분 (참조 자료 테이블)3 을 혼합.</li>
	<li>배아는 E3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션을 사용 하 여 그들의 페 트리 접시에 anaesthetize</li>
</ol>6. Microstructured 표면-디벗 배열에 Zebrafish의 방향
<ol><li>배아의 쉽게 조작할 수 있는 e 3의 얇은 (1-2 m m) 층에 의해 포함 되는 그것의 페 트리 접시에 2.7 (그림 3A) 단계에서 PDMS 블록을 준비 합니다.</li>
	<li>전송 피 펫을 사용 하 여 PDMS 블록의 표면에 배아 (조건 당 일반적으로 10-20)의 필요한 수를 전송 합니다.</li>
	<li>Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 배아 microstructured divots (그림 3A)에 밀어. Divots의 사용은 지 느 러 미 및 복 부 방향에 특히 적합 합니다. 참고:와 엄격한 divots (지 느 러 미 및 복 부)에 맞게, 배아, 디벗을 병렬로 블록의 표면에 위치 하 고 머리 루프를 사용 하 여 위치에 그들을 압 연. 깊이 디벗으로 그들을 밀어 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>7. Microstructured 표면-에서 Zebrafish의 방향을 Microstructured 채널
<ol><li>E3 PDMS 블록 microstructured 채널 (그림 3B) e 3의 수준, 블록의 가장자리 아래로 떨어지면 하지만 여전히 존재 저수지와 채널에는 PDMS에 얇은 층에서 때까지 전송 피 펫을 사용 하 여 패턴을 그립니다.</li>
	<li>가장자리를 오버플로 하지 않도록 주의 되 고 전송 피 펫을 사용 하 여 저수지에 단계의 5.3 10 배아를 전송.</li>
	<li>머리 루프를 사용 하 여 적절 한 채널의 입구에 깔때기에 각 배아를 조작 하 고 태아의 머리는 채널 쪽으로 고 태아는 적절 한 방향으로 채널 입력 되도록 방향.</li>
	<li>각 태아 orienting microfeatures 장소에 그것을 유지 하는 데 도움이 채널 벽에 도달할 때까지 머리 루프를 사용 하 여 채널 아래로 슬라이드. Microstructured 채널의 사용은 특히 측면 방향에 대 한 권장 됩니다. 참고: microinjection 중 슬라이딩 배아를 줄이기 위해, 저수지에서 e 3를 그려서 표면 장력의 양을 조정 해보십시오.</li>
</ol>8입니다. 제 브라 microinjection
<ol><li>
Microinjection 바늘을 준비 합니다.
	<ol>
<li>앞에서 설명한4micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 microcapillary 바늘을 확인 합니다. 결과 바늘 약 10 m m의 테이퍼 길이 한쪽 끝 지점으로 테이퍼 합니다.</li>
		<li>이 경우 100 nM chemoattractant에 주입 하는 솔루션을 준비 (N-Formylmethionine-leucyl-페닐알라닌 (fMLP) 또는 Leukotriene b 4 (LTB4))와 100 nM 70 kDa Rhodamine dextran 추적 프로그램 PBS에.</li>
		<li>가늘게 가늘게 한 피 펫을 사용 하 여 바늘에 솔루션의 5 µ L 로드 팁 (자료 표 참조).</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 장착 하 고 picopump microinjector에 연결 된 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집게와 테이퍼 팁을 곤란 하 게 하 여 45 ° 각도로 바늘의 팁을 휴식.</li>
	<li>1 주입 bolus 크기 조정 picopump 컨트롤러에 주입 시간을 조정 하 여 nL.</li>
	<li>Microinjection 바늘의 각도 조정 합니다. Micromanipulation 컨트롤러에 45 °의 바늘 각도 일반적으로 태아의 길이에 평행 하 게 바늘으로 좋은 출발점. 험한 각도 microinjection 동안 태아의 측면 움직임을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>왼손으로 페 트리 접시와 오른쪽으로 바늘 micromanipulator controlling, microinjection,이 경우 otic 소포의 의도 사이트로 최대한 바늘 가까이 가져. 참고: otic 소포 직사각형 기관 후부 두 작은 뚜렷한 어두운 직사각형 구조 (otoliths)를 포함 하는 눈으로 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulation 컨트롤러를 사용 하는 바늘의 팁, 소포 내 (이 경우 otic 소포)에 대상 조직을 관통 하 고 picopump 발 스위치를 사용 하 여 미리 설정 된 볼륨을 주입. 참고: 조직 침투를 저항 하는 경우 부드럽게 micromanipulation 컨트롤러 노브 도청 보십시오.</li>
	<li>배아를 출시, E3 표면 위쪽에서 전송 피 펫을 사용 하 여 아래쪽 또는 배아 주변 E3에 출시 되는 접시를 소용돌이 흐름.</li>
	<li>MS-222 전송 피 펫을 사용 하 여 없이 e 3의 복구 접시에 배아를 전송.</li>
</ol>9. 장치 이미징 PDMS를 사용 하 여 배아의 심사
<ol><li>포트를 통해 흐르는 E3 (+ MS-222) 단계의 4.7 장치 프라임. 이 행 해질 수 있다 1000 µ L 피 펫 또는 좁은 팁 전송 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>채워 잘 e 3 + MS-222 장치 덮여 때까지.</li>
	<li>잘 사용 하 여 각 전송 피 펫에 8.7 단계에서 4 삽입 된 배아를 제공 합니다. E3 + MS-222 (5.3 단계)를 로드 하기 전에 1-2 분 동안 배양 하 여 배아 미리 마 취 될 수 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 동양 (꼬리 1 또는 머리-첫 번째, 사용 하는 장치에 따라), 원하는 방향으로 영상 채널의 입구에서 배아 및 장치 (그림 4A)에 부분적으로 그들을 밀어. 이 장치에 균등 하 게 그들을 그릴 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>배아 채널 (그림 4B) 이미징에 대 한 올바른 방향으로 그려집니다 때까지 1000 µ L 피 펫 또는 전송 피 펫을 사용 하 여 포트에서 장치를 통해 E3를 그립니다. 참고: 트래핑 지점 과거 배아를 빨 아 하지 않도록 주의 하십시오,이 배아를 손상 하 고 그들의 방향을 변경 합니다.</li>
	<li>(그림 4C) 이미징을 위한 현미경을 잘 플레이트를 전송 합니다.</li>
	<li>
이미지를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여입니다.
	<ol>
<li>적절 한 렌즈를 선택 하 여 확대를 조정 합니다. 10 배는 일반적으로 이미징 zebrafish 호 중구 마이그레이션에 대 한 유용한 확대.</li>
		<li>각 신호는 분명, 하지만 하지 포화 되도록 광원 강도 및 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.</li>
		<li>각 채널에 대 한 이미지를 캡처하십시오. 여기, 우리가 사용 하는 녹색 형광 단백질 (GFP, 예: 470/22, Em: 525/50), 텍사스 레드 (TxRed, 예: 585/29, Em: 628/32) 채널을 전송. 멀티 채널 이미지 후 처리 하는 동안 결합 될 수 있다 (그림 4B-I).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

여기, 우리는 사용 설명 장치 우리는 최근 2 dpf zebrafish microinjection의5, 촉진 하기 위하여 소개 하는 배아의 편리한 이미징에 대 한 간단한 agarose 무료 장착 장치 개발. 이러한 도구는 zebrafish 기법에 대 한 유용한 장치 제조를 위한 photolithographic 기술의 유틸리티를 강조 표시합니다.
우리는 발견 MSA 장치 특히 유용 세포 또는 입자의 주입을 위해 microinjection 바늘 같은 곰 팡이 conidia 또는 배달에 대 한 더 큰 구멍 바늘의 사용을 요구 하는 인간의 암 세포 내에서 집계 하는 경향이 있다. Otic 소포 (그림 4)에 주입 배아 자주 바늘과 접촉 시 롤로 특정 도전을 선물 한다. 우리 동양 하는 측면에서 zebrafish 안정화 microstructured 채널의 사용 하 여 찾을 방향 처리량 및 우리...

Zebrafish의 기본적인 발달 생물학 대규모 유전 연구에서 다양 한 분야에 대 한 강력한 모델로 등장 하 고 화학 스크린1,2. 일상적인 유전자 조작, 유전자 overexpression, 최저, CRISPR/Cas9 mutagenesis, transgenesis 등 상업적으로 간단한, 쉬운--사용의 개발을 주도하 고 있다 단일 셀 zygote에 유전 물질의 microinjection에 의존 방향을 사출3계란 안정화를 사용할 수 있는 도구. 감염, 이식 등 다른 접근으로 나중 단계 태아 그리고 애벌레 더 큰 게이지 모 세관 바늘4를 사용 하 여 microinjection을 해야 하는 경우가 많습니다. 그러나, 더 큰 계기 바늘의 사용으로 밀거나 태아 롤링 없이 표적 조직에 침투 하기 어려운 중요 한 기술적 과제, 선물. 이러한 조건에서 절차 동안 건조를 방지 하는 것은 어렵다, 하는 동안 태아를 안정화 하는 데 필요한 적절 한 물 긴장 및 배아 수 있습니다 이상적으로 표적 조직에 주입에 대 한 지향.
Microinjection, 다음 그것이 주입된 태아 성공적으로 주입 되어, 그를 선택 하 고 초기 시간 포인트의 이미지를 캡처 화면 종종 유용 합니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 microinjection5, 그리고 빠른 이미지 기반 심사 후 주입을 위한 다양 한 방향에서 2 dpf 배아를 안정화 하는 데 도움이 microstructured 장치의 범위를 개발 했습니다.
이 장치에 충분 한 구조 해상도 얻으려면, 우리는 photolithographic 기술을 활용. 최근 미세 제작 추정 마이크로 전자 산업 등에서 일반적으로 사용 되는, 이러한 접근 1-1000 µ m, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 조작에 적합 한 규모에서에서 배열 하는 수직 구조를 얻을 수 있습니다. 모든 장치입니다 (PDMS), 저렴 한, 생물학으로 비활성, 육체적으로 강력 하 고 투명 한은 사용 하 여 날조 되었다.
Microstructured 표면 배열 (MSAs) 꽃무늬 최고 표면 PDMS의 블록으로 포맷 했다, 계란 microinjection 위해 간단한 채널 agarose 블록에 유사한 일반적으로 사용. 포스트 주입 심사에 대 한 이미징 장치 6 표준 유리 바닥 6 잘 플레이트에 배열할 수 있다. 이 소자는 배아의 쉬운 로딩을 위한, 언로드 절차 편리 하 게 이미지 기반 구조 촉진 특정 배아의 수에 의해 개발 된 이전 그 장치 보다 더 많은 사용자 친화적인 방식으로 접근을 차단 합니다 비비 실험실6.

<table><tbody><tr><td>다우 코닝 실가드 184 폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>엘스워스 애드시브</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>장치 주조용. 키트에는 PDMS 단량체 및 개시제가 포함되어 있습니다</td></tr>: <tr><td>저겔화 온도, 아가로스</td>, <td>Sigma, Aldrich</td>, <td>A9414-10G</td>, <td>아가로스 장치 주조용</td></tr>, <tr><td>PFDTS 실란</td><td>, Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>, 네거티브 PDMS 주형용</td></tr><tr><td>트리카인(MS-222)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E10521-10G</td>, <td>제브라피시 마취용</td></tr><tr><td>, Rhodamine Dextran, 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>미세 주입을 추적하려면</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td> <td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>호중구 화학 유인제</td></tr><tr><td>N- 포르 밀 메티오닌 - 류실 - 페닐알라닌 (fMLP)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>호중구 화학 유인 물질</td></tr><tr><td>15cm 페트리 접시</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>마스터 웨이퍼에서 주조</td></tr> 용 <tr><td>유리 바닥 6 웰 플레이트</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>이미징 장치</td></tr><tr><td>용 붕규산 유리 미세 모세관</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>미세 주입 바늘</td></tr><tr><td>이송 피펫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>제브라 피쉬 배아 이송 용</td></tr><tr><td>마이크로 로더 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td>미세 주입 바늘 로딩 용</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5mm 펀치</td><td>테드 펠라 Inc.</td><td>15111-15</td><td>PDMS 이미징 장치</td></tr><tr><td>No. 11 메스</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>PDMS 절단용</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>배아 제거 및 미세 주입 바늘 팁 절단용</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>미세 주입 바늘 조작용</td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>microinjection volume and timing 제어용</td></tr><tr><td>EVOS 도립 형광 현미경</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>주입된 배아를 이미지화하기 위해</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD 소프트웨어</td><td>Autodesk 시각화</td><td></td><td>AutoCAD 파일 다운로드: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 및 ZFIN 커뮤니티 프로토콜 위키 페이지: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &nbsp;</td></tr></tbody></table>

최적화 된 microinjection 및 zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish 대규모 유전과 화학 스크린을 통해 기본적인 발달 생물학에 걸친 다양 한 인간 질병 및 실험 연구의 증가 범위에 대 한 유용한 도구 강력한 모델로 떠오르고 있다. 그러나, 많은 실험, 특히 감염 및이 종이 식 모델에 관련 된 microinjection와 배아와 힘 드는 기법 기술 및 전문 지식이 필요로 하는 애벌레의 이미지에 의존 합니다. 정밀도 현재 microinjection 기법의 처리량을 개선 하기 위해, 우리는 이전에 복 부, 등, 또는 측면 방향 동양 zebrafish 태아 2 일 게시물 수정 (dpf)에 안정화를 microstructured 장치의 시리즈를 개발 합니다 절차입니다. 배아의 이미징에 도움, 우리는 또한 채널 4 zebrafish 유리 커버 슬립에 대 한 동시에 옆 방향으로 간단한 장치 설계. 함께, 우리가 여기 제시 도구 zebrafish 기술의 최적화를 위한 유용한 장치를 생성 하기 위해 photolithographic 접근의 효과 보여 줍니다.

여기서 설명 하는 접근은 (그림 1)의 설계 및 제조 2 dpf zebrafish, photolithographic (그림 2)와 소프트 리소 그래피 (그림 3) 기법을 사용 하 여 함께 사용 하기 위해 장치를 보여 줍니다. 이 방법을 사용 하면 많은 설계 반복 및 수정, 빠른 테스트 하 고 변경 및 개발의 다른 단계에서 제 브라와 함께 사용 하기 위해 미세 크기의 최적화 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다.
우리 도전 microinjection 기술과 편리한 이미징이이 소자의 사용을 보여 줍니다. Otic 소포 (그림 4D, 흰색 파선된 윤곽선) ze...

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

이 방법론의 전반적인 목표는 저브라피쉬 유충의 미세 주입을 더 쉽고 정확하게 만드는 것입니다. 이 방법은 제브라피시 모델 시스템을 사용하는 연구자가 제브라피시 유충을 대규모 어레이에서 특정 방향으로 고정하는 데 도움이 됩니다. 이 기술을 사용하면 미세 주입 및 이미징을 위해 특정 조직에 더 쉽게 접근할 수 있으며 감염 또는 이종 이식편 암 모델과 같은 응용 분야에 많은 수의 유충이 필요한 경우에 매우 효과적입니다.제브라피시 모델에 대한 저의 제작 전략은 매우 상호 보완적입니다. 하나는 인간이 만든 단순한 것입니다. 다른 하나는 생생하고 복잡합니다.둘 다 동일한 크기 척도를 공유합니다. 둘 다 투명합니다. 또한 둘 다 단일 세포 분해능에서 관찰을 가능하게 합니다.여기에서 볼 수 있듯이 이 둘은 쉽게 결합할 수 있으며 거의 모든 주요 질병 연구에 적용할 수 있습니다. E-3 박막으로 덮인 페트리 접시에서 PDMS 블록을 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 전달 피펫을 사용하여 필요한 수의 배아를 PDMS 블록 표면으로 전달합니다. 헤어 루프 또는 유사한 도구를 사용하여 배아를 특히 등쪽 및 복부 방향의 미세 구조 디봇으로 밀어 넣습니다.디봇에 유충을 적재할 때 쉽게 조작할 수 있도록 PDMS 블록을 덮는 충분한 물을 확보하는 것이 중요합니다. 주입하는 동안 제자리에 남아 있도록 디봇 안으로 밀어 넣는 것도 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이전에 준비된 미세구조 채널에서 제브라피시를 유도하려면 전송 피펫을 사용하여 패턴화된 PDMS 블록에서 E-3를 끌어냅니다.E-3의 수준은 블록의 가장자리 아래로 떨어져야하지만 여전히 저장소와 채널에 존재해야하며 PDMS에 얇은 층이 남아 있습니다. 이송 피펫을 사용하여 마취된 배아 10개를 저장소로 옮기되 가장자리가 넘치지 않도록 주의합니다. 헤어 루프를 사용하여 각 배아를 먼저 적절한 채널의 입구에서 깔때기 머리로 조작하여 배아가 채널로 들어갈 때 적절한 방향을 갖도록 합니다.그런 다음 헤어 루프를 사용하여 각 배아를 채널 아래로 밀어 제자리에 유지하는 채널 벽의 방향 미세에 도달할 때까지 배아를 채널 아래로 밀어 넣습니다. 미세주사 바늘과 미세주사 용액을 준비한 후 미세하게 가늘어진 피펫 팁을 사용하여 용액 5마이크로리터를 바늘에 넣습니다. 마그네틱 스탠드에 장착된 마이크로 매니퓰레이터에 바늘을 장착하고 PICO 펌프 마이크로인젝터에 연결합니다.그런 다음 집게를 사용하여 가늘어진 끝을 꼬집어 바늘 끝을 45도 각도로 부러뜨립니다. PICO 펌프 컨트롤러에서 주입 시간을 조정하여 주입 볼루스 크기를 1나노리터로 조정합니다. micromanipulation 컨트롤러에서 microinjection 바늘의 각도를 배아의 길이와 평행한 바늘로 45도부터 조정합니다.미세주입 중 배아의 측면 이동을 최소화하기 위해 더 가파른 각도를 사용할 수 있습니다. 왼손으로 페트리 접시를 제어하고 오른손으로 필요한 미세 조작기를 제어하여 바늘을 이낭과 같은 미세 주입의 의도 된 위치에 가능한 한 가깝게 가져옵니다. micromanipulation 컨트롤러를 사용하여 바늘을 대상 조직에 삽입하고 PICO 펌프 풋 스위치를 사용하여 미리 설정된 부피를 주입합니다.조직이 침투에 저항하면 micromanipulation 컨트롤러 손잡이를 부드럽게 두드립니다. 배아를 방출하려면 이송 피펫을 사용하여 E-3를 위에서 아래로 표면 위로 흐르게 하거나 배아가 주변 E-3로 방출되도록 접시를 휘젓습니다. 배아를 MS-222가 없는 E-3의 회수 접시로 옮깁니다.6개의 웰 플레이트의 웰에서 PDMS 장치를 사용하여 배아를 스크리닝하려면 1, 000 마이크로리터 피펫 또는 팁이 좁은 이송 피펫을 사용하여 E-3을 포트를 통해 흐르게 하여 장치를 프라이밍합니다. E-3 및 MS-222를 사용하여 장치가 덮일 때까지 우물을 채웁니다. 그런 다음 이송 피펫을 사용하여 이전에 주입된 4개의 배아를 각 웰에 전달합니다.헤어 루프 또는 유사한 도구를 사용하여 이미징 채널의 입구에 원하는 방향으로 배아를 배치하고 부분적으로 장치에 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 장치에 고르게 끌어들이는 데 도움이 됩니다. 1, 000 마이크로리터 피펫 또는 이송 피펫을 사용하여 배아가 이미징을 위해 올바른 방향으로 채널로 유입될 때까지 포트에서 장치를 통해 E-3을 끌어냅니다.웰 플레이트를 도립 형광 현미경으로 옮깁니다. 배아를 이미지화하려면 제브라피시 네투라오힐 이동을 촬영하기 위한 10x와 같은 적절한 렌즈를 선택하여 배율을 조정합니다. 각 채널의 광원 강도와 노출 시간을 조정하여 각 신호가 선명하지만 포화되지 않도록 합니다.마지막으로, 각 형광등 및 투과 채널에 대한 이미지를 캡처합니다. 측면 방향의 배아를 안정화하기 위해 미세 구조 채널 장치를 사용하여 수정 후 이틀 동안 제브라피시 배아를 이낭에 미세주입한 표준 화학유인물질 fMLP 및 LTB4에 반응하는 호중구의 능력을 테스트했습니다. 호중구 동원을 시각화하기 위해 고분자량 로다민 덱스트란(rhodamine dextran)으로 주사를 추적하고 녹색 형광 호중구를 가진 형질전환 배아에서 주사를 수행했습니다.주입되지 않은 배아와 로다민만 주입된 배아를 음성 대조군으로 사용하였다. 미세주입 후, 배아를 이미징 채널 장치로 옮기고 주입 후 30분 및 5시간에 EVOS 형광 현미경을 사용하여 이미지화했습니다. 예상대로, 소수의 형광 호중구가 이른 시점에 모의 주입된 이낭에 동원되었는데, 이는 손상된 매개된 동원에 기인하는 것으로 보입니다.흥미롭게도, 로다민 덱스트란 추적자는 실험 중에 이석에 축적되는 것이 관찰되었습니다. 두 화학유인물질 모두, 호중구는 특히 LTB4에 대한 반응으로 더 높은 숫자로 동원되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제브라피시 미세 주입의 속도와 정확성을 크게 향상시킬 수 있습니다.이 기술의 개발은 우리 실험실의 특정 과제에 의해 주도되었습니다. 우리는 제브라피시 모델의 진균 감염 및 종양 이종이식편에 대한 프로젝트의 요구 사항에 맞게 이 접근 방식을 개선했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 미세 주입 및 확장된 라이브 이미징을 위해 미세 구조 표면 어레이를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 적층을 사용하여 미세유체 장치를 제조하는 혁신적인 방법은 여러 개의 살아있는 제브라피시 배아를 포획하고 이미징하는 비용과 복잡성을 크게 줄여줍니다.

저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 라미네이션 미세유체역학(Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics) 설계로 멀티플렉스 제브라피시 이미징

배우세요 제브라피시 애벌레의 미세주입 및 이미징을 위한 미세구조 장치 활용법. 이 방법은 Danio rerio를 고정하여 조직 표적화 정확도를 높이고 대규모 감염 및 종양 연구에 효과적입니다.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

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