생명 공학 응용 프로그램에 대 한 고급 재료의 항균 특성

이 방법은 항균 특성과 같은 재료 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 많은 생명 공학 응용 분야에 매우 바람직합니다. 이 기술은 정확한 결과를 위해 심층적인 단계별 절차가 필요한 경험이 부족한 연구자를 돕기 위해 실험실 전반에 걸쳐 일관된 프로토콜로 활용될 수 있습니다. 우리는 항균 프로토콜을 찾기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 문헌에 이에 대한 자세한 프로토콜이 없다는 것을 깨달았습니다.

이 연구에서는 화학적 성질이 다른 4가지 고급 재료와 대조 물질이 항균 활성에 대해 테스트됩니다. 각 재료를 10mm 직경의 디스크로 절단하여 준비합니다. 다음으로, 각 표본을 70% 에탄올에 10분 동안 담근 다음 측면당 1시간 동안 자외선을 조사하여 멸균합니다.

세 가지 다른 미생물을 사용하여 첨단 재료의 항균 활성을 테스트합니다. 그람 양성 박테리아, 황색포도상구균, 그람 음성 박테리아, 대장균 및 효모, 칸디다 알비칸스. 멸균 면봉을 사용하여 멸균 원심분리기 튜브에 들어 있는 25mL의 트립틱 소이 육수(TSB)에 각 미생물의 몇 군락을 재현탁합니다.

균일한 혼합을 달성하기 위해 1분 동안 소용돌이. 분광 광도계로 각 미생물 배양에 대해 540nm에서 흡광도를 측정합니다. 각 미생물의 농도를 적절한 수의 집락 형성 단위 또는 밀리리터당 CFU로 조정합니다.

미생물 현탁액을 5초 동안 소용돌이켜 미생물 분산을 개선하고 이 미생물 현탁액에 멸균 면봉을 잠시 담그십시오. 배양물이 들어 있는 튜브 벽에 면봉을 눌러 면봉에서 과도한 액체를 제거합니다. 멸균 면봉으로 각 미생물 육수 현탁액을 트립틱 콩 한천 또는 TSA 플레이트의 표면에 세 개의 평면으로 균일하게 줄무늬를 만들어 전체 표면을 미생물로 덮습니다.

접종 후 5분 동안 접시를 말리십시오. 미생물 현탁액 현탁액은 나중에 미생물 현탁액 농도와 순도를 확인하기 위해 사용할 수 있도록 벤치 상단에 그대로 둡니다. 핀셋을 96% 에탄올이 든 비커에 담근 다음 알코올 버너로 불을 붙여 살균합니다.

멸균 핀셋을 사용하여 테스트할 샘플 디스크를 TSA 플레이트 중앙에 놓습니다. TSA 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 거꾸로 배양합니다. 확산 테스트 결과를 분석하려면 디지털 캘리퍼를 사용하거나 사진을 찍고 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 억제 영역의 직경과 샘플 디스크 직경을 측정합니다.

이 절차는 이전에 측정된 미생물 농도가 정확한지 확인하고 미생물 환경 오염이 없는지 확인하는 데 필요합니다. 적절한 오토클레이브 팁과 무균 조건이 있는 마이크로피펫을 사용하여 멸균 TSB를 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 음성 대조군으로 활용될 샘플을 포함합니다.

TSA 플레이트에 줄무늬를 만들기 위해 이전에 사용된 미생물 배지 현탁액으로 6개의 소수점 연속 희석을 수행합니다. 사전 멸균된 Drigalski 주걱을 사용하여 선택한 각 희석액 100l를 TSA 플레이트에 펴 바릅니다. TSA 플레이트에 미생물이 없는 TSB 배지 100l를 음성 대조군으로 펴 바릅니다.

TSA 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날에는 콜로니의 수를 세어 밀리리터당 CFU가 이전에 결정된 것과 유사한지 확인합니다. 네거티브 컨트롤 플레이트를 확인하여 미생물 환경 오염이 없는지 확인하십시오.

TSB에서 테스트할 다양한 미생물을 섭씨 37도의 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 배양하여 이 절차를 시작합니다. 다음 날, 각 야간 배양의 OD540을 측정한 다음 50mL 사전 멸균 원심분리기 튜브에 20mL의 TSB에 각 배양액을 약 10 - 6 CFU의 농도로 희석합니다. 각 유형의 재료로 구성된 디스크 4개와 제어 디스크 4개를 멸균 48웰 플레이트의 별도 웰에 놓습니다.

각 디스크 표면에 미생물 현탁액 150l를 피펫으로 분사합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 48웰 플레이트를 24시간 동안 배양한 후, 850l의 멸균 PBS를 4개의 샘플 디스크와 4개의 대조 디스크 각각의 표면에 피펫팅하고 미생물 현탁액과 혼합합니다.

48웰 플레이트에서 각 PBS 미생물 현탁액 혼합물과 각 디스크를 수집하여 15mL 사전 멸균 튜브로 옮깁니다. 1 분 동안 PBS 미생물 현탁액 혼합물과 디스크를 소용돌이. 50Hz에서 5분 동안 초음파 처리한 다음 다시 1분 동안 소용돌이하여 생존 가능한 미생물이 재료 표면에 부착되지 않도록 합니다.

초음파 처리된 배양물과 TSB를 포함하는 멸균 마이크로 원심분리기 튜브의 10진수 연속 희석을 수행합니다. TSA 플레이트에 각 희석액 100l를 바르고 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 호기성으로 배양합니다. 24시간 후 군체의 수를 세고 이 숫자를 밀리리터당 CFU로 표시합니다.

그런 다음 접촉 방법 결과는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분석됩니다. 한천 디스크 확산 테스트의 결과는 첫 번째 재료에 대해 비 항균 활성을 보여주고 다른 세 가지 재료에 대해 S.aureus 및 E.coli에 대한 항균 활성이 증가하는 것을 보여줍니다. 이 그래프는 배양 24시간 후 S.aureus 및 E.coli에 대한 각 재료 디스크의 정규화된 후광을 보여줍니다.

접촉 방법의 결과는 또한 첫 번째 재료에 대한 비 항균 활성을 나타내고 다른 세 가지 재료에 대해 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성이 증가함을 나타냅니다. C는 배양 24시간 후 제어 디스크에서 회수된 생존 가능한 박테리아입니다. 이 그래프는 재료 표면에서 S.aureus 및 E.coli에 대한 4가지 재료의 생존력 손실률을 보여줍니다.

샘플 M1은 항균 활성을 나타내지 않았습니다. 여기에 나타나있지는 않지만, 4가지 물질 중 어느 것도 다른 방법으로 효모인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 성장을 억제할 수 없습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 두 가지 상호 보완적인 방법으로 항균 활성을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.