Name: 세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 학습하세요 세포 기반 흐름 세포측정법을 이용해 효소 대체 요법에 영향을 주는 중화 항체를 Jurkat 세포에서 검출하는 방법입니다. 이 기술은 약물 특이적 중화 항체를 반정량적으로 측정하여 면역원성 연구에 활용됩니다.

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저자 아무 승인 있다.

인간의 행렬 승인 그들의 기관 검토 위원회 (IRB)에서 상용 소스 로부터 구입 했다 하지만 잠재적으로 감염 치료를 해야 합니다. 사용 하는 실험실 환경 안전12의 문화를 유지 확인 합니다.
1. 분석 결과 시작 하기 전에
<ol><li>ERT 활용 streptavidin 자석 구슬 제조 업체의 지침13에 따라 준비 합니다.</li>
	<li>
품질 관리 샘플 (QCs) 준비: 종의 매트릭스 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청)에 긍정적인 제어 항 체 (PC) (예를 들어,는 NAb) 스파이크. 참고: FDA 및 EMA 지도 분석 결과 검증 및1,14테스트 루틴에 대 한 높은 그리고 낮은 QC 준비 권장 합니다.<ol>
<li>예를 들어 10 µ g/mL에서 QC를, 1000 µ L의 전체 볼륨에 대 한 (예를 들어, CSF) 관련 매트릭스의 990 µ L에 1 mg/mL 재고 긍정적인 통제의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Aliquot 볼륨 단일에 대 한 적합 한 QC 샘플 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C1에서 고정.</li>
		<li>약 수를 잘라 포인트-제어 (CC), 종의 매트릭스는 단일 테스트 문서 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청) 치료 하지 않을 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C1에서 고정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>활용 반응에 fluorophore와 ERT 제조업체의 프로토콜15에 따라 단백질 라벨 키트를 사용 하 여 수행 합니다. Aliquot 볼륨 단일 적합에 샘플 사용 (예를 들어, 50 µ L)와 동결-60-80 ° c에 aliquots</li>
</ol>2. 주 1: 셀 도금 및 샘플 준비
<ol><li>
셀 접시 준비
	<ol>
<li>조직 문화 후드를 사용 하 고 다음 단계에 대 한 무 균 환경을 유지. 70% 에탄올과 후드에 배치 됩니다 깨끗 한 환경16,,1718를 유지 하는 각 개체를 스프레이.</li>
		<li>37 ° C19에서 물 또는 목욕에서 따뜻하게 셀 성장 매체 (예를 들어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 RPMI-1640).</li>
		<li>수 인간 T 림프 톨 Jurkat 세포 및 플레이트 100 µ L 당 96 잘 라운드-하단에 105 셀/mL x 7.5에서 잘 문화 접시 접시 로더를 갖춘 교류 cytometer에서 사용 하기 위해 적절 한 세포.<ol>
<li>예를 들어 셀20,21을 계산 하는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 사용 합니다.</li>
			<li>셀 적어도 70%를 갖도록 생존 실험을 진행 하기 전에 (예를 들어, trypan 푸른 얼룩과 생존 능력 평가)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>14-20 h에 대 한 하룻밤 5% CO2 와 95% 습도 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 준비 검사
	<ol>
<li>주제를 희석 또는 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)를 사용 하 여 컨트롤 샘플 분석 결과. 여기 예제에서는 메서드에서 RPMI-1640 년에 샘플 1:2.5 혈 청 자유로운 매체의 90 µ L을 샘플의 60 µ L을 추가 하 여 희석. (예를 들어, 8 스트립 튜브). 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다. 참고: 1:2.5의 희석 실험적으로 결정 했다 고 여기 제시 하는 방법에 대 한 최적입니다. 개발 된 각 방법에 대 한 최적의 샘플 희석을 결정 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
확실 한 비드와 샘플 준비
	<ol>
<li>확실 한 샘플에 필요한 ERT 활용 된 구슬의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>예를 들어, 10 샘플 사용 샘플 + 30% 추가 세척 단계 동안 손실에 대 한 보상 ERT 활용 된 구슬의 10 샘플 x 100 µ L = 1300 µ L ERT 활용 된 구슬의.</li>
		</ol>
</li>
		<li>소용돌이 구슬 철저 하 게. 세척에 대 한 15 mL 원뿔 튜브를 구슬의 계산 된 번호를 추가 합니다.</li>
		<li>ERT 활용 자석 구슬 커플링 버퍼 또는 (예를 들어, 0.1% 폴 20에 식 염 수 인산 염 버퍼와) 제조 업체에 의해 제안 된 1300 µ L을 추가 하 여 씻어13아래 단계를 수행.</li>
		<li>소용돌이 관 철저 하 게. 2 분 동안 자기 튜브 랙에서 튜브를 놓습니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 솔루션 구슬 자석에 때를 진한 갈색에서 돌 것 이다.</li>
		<li>버퍼를 커플링의 1300 µ L와 구슬 resuspend 총 4 개의 세척 세척 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>최종 세척 후 버퍼 (이전 단계 2.3.1.1에서에서 계산) 커플링의 1300 µ L에 비즈를 일시 중단 합니다. 96-글쎄, 흰색, 라운드-하단에 잘, (예를 들어, 하나의 샘플 또는 QC 당 잘 확인, fluorophore 표시 ERT와 알을 품을 때 중복으로 분할 샘플 지) 판 지도 따라 구속력이 폴 리 프로필 렌 플레이트 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>96-잘 측면 skirted 자석에 접시를 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다. 신중 하 게 맑은 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기. 참고: 솔루션이 바뀝니다 어둠에서 갈색에 측면 skirted 자석에 약 1-2 분 후 취소. 얻은 구슬 구슬 "건조" 라고 합니다.</li>
		<li>샘플 긍정적인 상영 확인 되는 경우 추가 100 µ L와 ERT 활용 된 구슬 없이 각 샘플의 적절 한/할당으로 잘 합니다. 접시는 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 실 온 (RT)에서 약 800 rpm에 회전 통에 적어도 60 분 동안 그것을 동요. 참고: 이전에 준비 하 고 긍정적이 고 부정적인 냉동 QCs와 CC 포함 되어야 합니다 모든 접시에.</li>
		<li>부 화 후 96 잘 측면 skirted 자석에 확실 한 접시 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Titer 희석 시리즈 준비
	<ol>
<li>Titer 시리즈를 준비 하려면 연속적으로 풀링된 매트릭스 포인트1을 잘라 미리 정해진된 titer를 시간의 충분 한 수에에서 샘플 희석.</li>
		<li>예를 들어 30 µ L의 샘플 8 희석 (예를 들어, 8 스트립 튜브)의 총에 대 한 1:3 희석 시리즈에서 풀링된 매트릭스의 60 µ L 혼합. 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 주 1: 분석 결과 절차
<ol><li>
혈 청 무료 매체 (예를 들어, 잘, 또는 약 6 mL/접시 당 60 µ L)에 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 합니다.
	<ol>
<li>예를 들어, 1 µ g/mL의 10 mL를 준비 fluorophore 표시 ERT, 재고 1 mg/mL의 10 µ L을 추가 fluorophore 표시 ERT 9.99 ml 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 외피 격판덮개 (예를 들어, 96-잘, 백색, 라운드-하단, 구속력이 없는 폴 리 프로필 렌 플레이트), 추가 준비 샘플에서 단계 2.2, 2.3 또는 2.4 및 중복 스 (예를 들어, 각각의 전송 60 µ L 1:1 혼합물에 fluorophore 표시 ERT 샘플을 준비 하 고 잘 당 fluorophore 표시 ERT의 60 µ L 추가). 참고: 예를 들어 실험 판 지도 그림 1에 제공 됩니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> 그림 1: 실험 접시 레이아웃의 예. 샘플 및 fluorophore 표시 ERT는 2-8 ° c.에 하룻밤 incubated 했다 높은-품질 관리 (HQC), 낮은-품질 관리 (LQC), 및 부정적인 품질 관리 (NQC) 같은 컨트롤 상영 되었고 접시 균일성을 평가 하기 위해 접시의 반대쪽 모서리에 확인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 샘플과 fluorophore 표시 된 ERT를 믹스. 격판덮개는 호 일에 포장 하 고 품 어 그들 하룻밤 2-8 ° C에 14-20 h에 대 한.</li>
</ol>4. 주 2: 셀에 준비 된 샘플 추가
<ol><li>2-8 ° C에 외피에서 샘플 인큐베이션 plate(s)를 제거 하 고 10-15 분 동안 37 ° C에서 구슬 목욕에 그들을 배치 하 여 접시를 따뜻하게.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 셀을 제거 합니다. 셀 표시 우물17,19에서 건강 하 고 고르게 분산을 보장 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 도금된 셀의 시각적 확인을 수행 합니다.</li>
	<li>실험 접시 지도 따르면 셀 플레이트에 이전 혼합된 샘플의 fluorophore 표시 ERT 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>추가 샘플 셀 플레이트 37 ° c.에 CO2 배양 기에 다시 배치 3 h 및 ± 격판덮개를 품 어 15 분. 참고:이 시간으로 신호 대 잡음 응답 분석 결과에 대 한 최적의 실험실에서 설립 되었다.</li>
	<li>14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 세포 격판덮개 원심 격판덮개 우물의 바닥에 셀 펠 릿의 존재를 확인 합니다.</li>
	<li>30-45 ° 각도에서 접시를 개최. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 각 잘 resuspend 셀을 셀 펠 릿에 1 x DPBS의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 세척 총 3 세척에 대 한 단계를 반복 합니다. 얼룩이 지는 세포 생존 능력에 대 한 5 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>5. 주 2: 세포 생존 얼룩
<ol><li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘, fluorophore 표시 ERT의 다른 방출 파장을 선택 하 고 제조 업체의 지침22에 따라 준비를 라이브/죽은 얼룩 x 1의 작업 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어. 14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 격판덮개 원심</li>
	<li>셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 씻어 셀 1 x 1 x DPBS.</li>
</ol>6. 주 2: 1 %Paraformaldehyde 셀 고정
<ol><li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘으로 100 µ L 냉장된 (2-8 ° C)에서 1 %paraformaldehyde (PFA)의 분배.</li>
	<li>접시와 부드럽게 혼합 펄스 소용돌이 인감. 접시는 호 일에 포장 하 고 고정을 위한 수 있도록 적어도 10 분 동안 2-8 ° C에서 그것을 배치. 참고: 접시 인감에 splashing 피하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>분석 하기 전에 여기저기 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘으로 1 x DPBS의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>7. Cytometry
<ol><li>플레이트 로더 교류 cytometer에 접시를 놓고 그들을 실행 합니다.</li>
	<li>습득 하 고 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 측정 된 평균 형광 강도 (MFI) 기록 ( 재료의 표참조). 참고: 로더 설정에 대 한 예를 들어 그림 2 를 참조 하십시오. 샘플 흐름 속도 샘플 볼륨, 볼륨, 혼합 속도, 및 혼합 수 혼합이 분석 결과 대 한 최적화 되어 있다. 이러한 기준 교류 cytometry 수집 소프트웨어23에 따라 각 기준에 대 한 숫자 옆 "화살표를" 또는 "아래로" 버튼을 사용 하 여 조정할 수 있다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> 그림 2: 흐름 cytometer 로더 설정의 예. 로더 설정은 개발 된 각 분석 결과 대 한 최적화 되어야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>cytometer 분석/빌 게이츠/플롯에 그림 3과 같이 만듭니다. 참고: 게이트 생성 및 응용 프로그램 각 흐름 cytometry 소프트웨어23에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> 그림 3: 전략 게이팅 cytometry 흐름. Jurkat 세포 총 이벤트에서 분리 되었고 측면 살포 (SSC) 채널 대 앞으로 분산형 (FSC) 플로팅 게이트 대상 인구 주위를 그리기에 의해 수집 된. Singlets (단일 셀) 남자에서 분리 되었다 또는 더 큰 셀 FSC 영역을 사용 하 여 집계 (FSC-A) 및 FSC 높이 (FSC-H) 채널. 라이브 세포 내의 세포 생존 얼룩에 대 한 부정적인 게이팅에 의해 선정 됐다. 메디아 형광 강도 (MFI) 단일, 라이브 Jurkat 셀에 측정 되었다 하 고 히스토그램으로 그려집니다. 약물 흡수와 셀의 MFI 값 (예를 들어, HQC) 차단 및 제어와 셀의 통풍 관의 금액 표시는 (빨강, 파랑, 각각). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="4"><li>분석에서 죽은 세포를 제외 하 고 대략 10000 이벤트23을 기록 합니다.</li>
</ol>8. 데이터 분석
<ol><li>(원시 MFI) 데이터 분석 소프트웨어를 내보낼 ( 재료의 표참조). 참고: 필요한 분석에 따라 다음 데이터 분석 수 있습니다 수행 분석 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
	<li>MFI (QCs 및 샘플) 중복 우물의 평균 및 평균에서 중복의 확산 가변성 평가 하 변형 (%CV)의 계수를 계산 합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>샘플 및 QCs는 분석 결과에 상영 된 계산에 대 한 비율의 의미 MFI 상대적 금지 (%SI) 신호는 QCs 풀링된 매트릭스 CC에 대 한. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>필요한 경우 확인 QCs 및 해당 화면 값을 기준으로 샘플에 대 한 복구 비 (Rr)를 계산 합니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

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저자는 직원 및 BioMarin 제약 주식회사의 주주

중화 항 체 또는 CI M6PR 통해 ERT 통풍 관을 방지 기타 요인 ERT 안전 이나 효능1영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 그것은 강력한 모델 관련 약물의 행동의 메커니즘을 사용 하 여 제목 샘플에서 NAbs를 평가 하는 것이 중요입니다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 일부 생물 검정 형식 (예:수용 체 이합체 화, luciferase 식, 등)의 성능 분석 결과 정밀도, 재현성, 고 감도 대 한 보건 기관 권장 일치 하지 29. 여기 설명 하는 검정 방법을, Jurkat 세포 생 CI M6PR 나타내는 NAbs lysosomal ERT 통풍 관에 특정 모니터링 하 고용 된다. 교류 cytometry 판독을 결합해,이 분석 결과 적합 한 분석 결과 정밀도, 감도, 재현성, 및 높은 샘플 처리량 생리 셀 모델을 사용 합니다. 탐지를 잡을 수는 흐름 cytometry 판독도에 적용 된 다른 표시. 예를 들어 메서드 간염 E과 adeno 관련 바이러스 (AAV)30,31에 대 한 기존의 항 체를 검출 하기 위하여 개발 되었습니다.
중요 한 단계는 프로토콜에 적합 한 fluorophore, 모니터에 감도, 시험 세포 생존 능력의 충분 한 수준을 보장 하 고 부 화 시간에 엄격한 준수를 유지 관리 하는 LQC 통합을 선택 포함 됩니다. 여기에 제시 된 예에 fluorophores (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 488, 알 렉 사 Fluor 647, 및 사이 퍼 5e), lysosomal ERT, 그들의 성능에 광범위 하 게 변화를 활용. 밝은 fluorophore 테스트32는 또한, 알 렉 사 Fluor 647 추가 분석 결과 개발에 대 한 선정 됐다. 여러 fluorophores 최고의 감도 및 동적 범위를 제공 하는 분석 결과의 개발 초기에 평가 하는 것이 좋습니다. 샘플 테스트 하는 동안 분석 결과 감도 테스트 실행1의 1%에 실패 합니다 감도 제한에 근접 하는 LQC를 포함 하 여 모니터링 해야 합니다. HQC, 함께 LQC 역할도 시스템 적합성 QC 시간3분석 결과 드리프트 모니터링 한다. 최적의 세포 생존 능력 및 성능을 단일 사용 aliquots의 세포 은행을 준비 하 고 비교 QC 결과3,18에 따라 새로운 세포 은행에 한정 함으로써 이루어집니다. 약물 흡수 증가 약물 세포와 알을 품는 시간 이후 셀 및 fluorophore 활용 된 마약 보육 시간 일관성 분석 결과 성능 중심도 있습니다. 약물 흡수에 일상적인 변화를 최소화 하기 위해 샘플 데이터 (예를 들어, 위의 방법에서 컷된 포인트 제어 샘플) 각 접시에 풀링된 매트릭스 제어 샘플 정규화 수 있습니다. 일관 된 데이터를 생산 하는이 방법에 또 다른 중요 한 요소 플레이트 균일성을 모니터링 하 고 가능한 가장자리 효과 최소화 하는 것입니다. 초기 실험 수행 하는 동안 더 강력한 실험 분석 결과 유효성 검사 (예를 들면, 정밀도 정확도)1동안 수행할 수 있습니다 전체 접시에 걸쳐 단일 QC를 사용 하 여 분석 결과 포함할 수 있습니다. 이 접시 지도 레이아웃33의 중요성을 보여 줍니다. 플레이트 지도 예제 에서처럼 품질 관리 샘플 배치 접시 모니터의 양쪽에 Levey 제닝스 차트34시간이 지남에 추적할 수 있는 균일.
이 분석 결과 NAbs 및 lysosomal ERT 통풍 관 억제 수 있습니다 하는 다른 요소를 모니터링 하는 동안 추가 실험 확인 한 통풍 관 억제 항 체 때문에 실시 수 있습니다. 하나의 옵션 A/G/L, 비 특정 면역 글로불린35를 묶는 단백질으로 샘플을 치료 하는 것입니다. 샘플 단백질 A/G/L 고갈 후 긍정적인 테스트를 계속 해 서, 비 항 체 억제 요소 차단 약물 이해에 대 한 책임 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 항 체 중재 통풍 관 억제, 그리고 긍정적인 통제 및 다른 분석 결과 비 항 체 억제 요인으로 주제 샘플의 높은 비율로 발견 되 면 재검토 해야 하는 매개 변수를 측정 하도록 설계 되었습니다.
분석 결과 약물의 행동의 메커니즘에 따라 적절 한 세포질 구획에 fluorophore 라는 마약 교통 정체를 보여 주기 위해 추가 특징 수 있습니다 또한. 여기에 제시 된 예제는 ERT CI M6PR 세포 표면에 바인딩 하는 리소좀에 교통으로 예상 된다. 우리 이전 보고 있음을 나타내는 여러 가지 실험의 결과 거의 모든 리소좀8ERT fluorophore 표시에서 메서드 결과에서 관찰 하는 형광 신호. 우리는 ERT fluorophore 표시 신호 cytochalasin 방해 말라 개편의 억제를 통해 국제화 B에 포함 된 셀의 치료를 다음과 탈락 했다 발견. 또한, 4 ° C에서 셀을 배치 하 여 외부 fluorophore trypan 파랑, 또는 둔화 국제화와 침묵 실험 나타냅니다 fluorophore 표시 ERT 빠르게 내 면 아주 작은 형광은 세포 표면에 바운스되는 ERT. Lysosomal 타겟팅 fluorophore 활용 된 마약 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 pH에 민감한 lysotracker 염료의 공동 지역화를 머릿속으로 확인 됐다. CI-M6PR 통해 통풍 관에 대 한 특이성 수 있습니다 또한 수용 체 바인딩에 대 한 레이블이 약물과 경쟁 하기 위해 exogenous M6P를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 비슷한 실험 이해 속도 론 및 다른 분석 실험에 fluorophore 활용 된 약물의 세포 지역화 확인 수행 되어야 한다.
이 세포 기반 분석 플랫폼 NAbs CI M6PR 수용 체 중재 된 endocytosis를 활용 하는 치료 약물에 대 한 연구에 사용 되었습니다. 우리는 최근 elosulfase 알파36,37NAb 및 약물 효능의 개발 사이의 상관 관계가 입증이 분석 결과 플랫폼을 사용 하 여 결과 보고 했다. 임상 샘플 테스트, 매개 변수, 분석 결과 감도, 정밀도, 선택도, 특이성, 약물 내성, 견고성를 포함 하 여 분석 결과 유효성을 검사 하 여 포인트를 잘라 설립된 guidances3, 평가 되어야 한다 4. 또한 주목 해야 한다, lysosomal ERTs 대 NAbs 효소 촉매 사이트 근처 바인딩을 통해 마약 활동을 방해 하는 잠재력을 개발할 수 있습니다. 일반적으로, 우리는이 유형의 NAb는 리소좀의 가혹한 산 성 및 분해 환경 ERT 항 체 상호 작용2,,3940에 유리한 있기 때문에 우선 순위가 낮은의 수를 모니터링을 고려 합니다. 그러나, 그것은 분해 방지 NAbs 존재 및 약40의 촉매 부분을 억제 수 있습니다. 이 분석 결과 모니터 fluorophore 표시 ERT 글귀는 리소좀 및 분석 결과의 제한에 분해 방지 NAbs 모니터링 하는 무 능력 이다. NAb의이 종류는 안전 또는 효 험 데이터에 따라 의심 되, ERT 활동을 모니터링 하는 분석 결과 개발 하 고 샘플을 테스트 하는 데 사용 해야 합니다.
Immunogenicity의 평가 마약 안전 및 효 험에 NAbs의 효과 이해에서 중요 하다. 생체 외에서 마약 통풍 관을 통해 CI M6PR 억제 능력이 NAbs의 식별 NAb 활동 비보를 이해 하기 위한 기회를 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법 CI-M6PR fluorophore 활용 lysosomal ERT 세포질 통풍 관의 간섭 측정을 표현 하는 인간 세포 선을 활용 합니다. 이 방법은 이미 NAbs lysosomal 저장 질병을 치료 하기 위한 여러 ERTs에 대 한 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 분석 결과 플랫폼 그들의 적절 한 기능에 대 한 셀룰러 국제화를 필요로 하는 생물 학적 치료제에 NAbs의 효과 연구를 위한 다른 방법을 적용할 수 있습니다.

Immunogenicity 평가 안전 성과 효능 모니터링 ERTs 포함 모든 생물 학적 치료 제품에 대 한 프로그램의 중요 한 부분입니다. 환자는 약물 안전, 효능, 그리고 pharmacokinetic pharmacodynamic 프로필 직접 영향을 수 있는 면역 반응을 개발할 수 있습니다. NAbs, 라는이 ADA의 하위 집합 두 가지 방법으로 ERT 효능을 억제 수 있습니다: 대상된 셀 또는 ERT 촉매 활동을 억제 함으로써 ERT 통풍 관의 억제를 통해. 여기에 제시 된 방법 측정 NAbs ERT 통풍 관 세포로 방해 하는 설계 되었습니다. 안전과 치료 ERT의 효능을 완벽 하 게 모니터링 하려면 NAbs의 지속적인 모니터링 elucidating 임상 결과 또는 pharmacodynamic 효과1어떤 잠재적인 상관 관계에서 결정적 이다.
NAbs 단백질 치료제에 대 한 평가 대 한 플랫폼 포함 셀 기반, 효소 활동 및 ligand 바인딩 분석1. 다양 한 기준에 따라 최적의 분석 결과 플랫폼 선택: vivo에서 치료 제품, 분석 결과 플랫폼 감도, 선택도, 정밀도, 및 중요 한 것은,의 금지 행동을 모방 하는 능력의 행동의 메커니즘 NAbs . Ligand 바인딩 분석 실험은 특정 경우에 있을 수 있습니다 (예를 들어, 관련 셀 라인을 식별할 수 없는 경우 또는 세포 기반 분석 결과에 적절 한 감도 얻을 수 없는 경우). 그러나, 산업 문서 및 다른 업계에서 수용 된 백서에 대 한 2016 초안 FDA 지침, 셀 기반 NAb 분석 실험 때문에 그들은 더 나은 있습니다 것이 좋습니다 반영1,2 생체 내에서약물의 생물 학적 메커니즘 , 3.
교류 cytometry 셀 기반 NAb 분석 결과 개발 하기 위한 중요 한 구성 요소는 적합 한 셀 하 포함 약 자극, 대리 긍정적인 제어 응답 중화는 ERT, fluorophore 활용 ERT 및 생물학적 테스트 종 NAb 매트릭스4,,56. 셀 라인 선택 행동의 ERT 메커니즘에 의존 하 고 여러 셀 라인 분석 결과 개발3중 평가 한다. 여기 설명 하는 방법을 인간의 Jurkat T 세포 세포 표면에 항 체 단편 수용 체 (FcRs)을 무차별 대부분 항 체7,8의 Fc 지역의 부족 그들의 생 CI M6PR 식 선정 됐다 . 분석 결과 개발 하는 동안 유효성 검사 연구와 테스트, 테스트 문서1치료 하지 개인에서 풀링된 혈 청 등 환자 샘플에 대 한 부정적인 통제 설정 중요 하다. 셀 라인 또한 약물 개발1의 nonclinical, 임상, 및 사후 마케팅 단계에 걸쳐 연속성에 대 한 다른 종에서 관련 행렬을 용납 한다. 다른 구성 요소 분석 결과 긍정적인 통제의 선택 이다. ERT 셀 이해 분석 결과 대 한 긍정적인 컨트롤 바인딩 치료과 CI M6PR9,1를 통해 이해를 무력화 하는 기능에 따라 선택 되었다. 희귀 질환 환자 인구2에서 특히 분석 결과 컨트롤로 사용 하기 위해 인체에서 유용한 또는 지속 가능한 양의 중화 antisera 얻기 위해 자주 어렵습니다. 대안 하이퍼 예방 접종 동물, 또는 선호도 정화 polyclonal 또는 단일 클로 널 항 체 분석 결과 관련 매트릭스1에 아군에서 antisera를 포함 합니다. 종의 매트릭스를 사용 하 여, 매트릭스에 존재 하는 항 체 이외의 금지 요인 ERT 통풍 관 억제 수 있습니다 가능 하다. 분석 결과의 또 다른 중요 한 구성 요소가 이다 fluorophore 활용 ERT. ERT 활용에 대 한 fluorophore의 선택은 밝기, pH 안정성, 그리고 교류 cytometer에 다른 채널에 잠재적인 스펙트럼 중첩에 대 한 분석 결과 필요에 따라 각 ERT에 대 한 평가 되어야 한다.
여기서 설명 하는 분석 결과 ERT는 셀 통해 CI M6PR 들어가는 등 치료 단백질, NAb 측정에 대 한 예입니다. 여러 ERTs, lysosomal 저장 장애 (LSDs) 치료, elosulfase 알파 A Morquio 증후군, CLN2 고정 편 질병에 대 한 cerliponase 알파, Fabry 질병에 대 한 agalsidase 알파를 포함 하 여 세포 통풍 관 및 lysosomal 타겟팅이 통로 활용 하기 위한 고 Pompe 질병10,11alglucosidase 알파. 이 방법의 목적은 마약 바인딩 및 국제화를 통해 CI M6PR 방해 NAbs의 상대적 수준을 측정 하는 것입니다. 이 계층 검사, 확인, 및 titer에서 수행 단계3. 샘플 먼저 NAb 양성 위한 상영 되며 다음 확인 단계에서 긍정적인 확인. 마지막으로, 샘플 화면 하 고 긍정적인 확인을 항 체 titer1생성 하 순차적으로 희석 수 있습니다. 이 셀 기반 흐름 cytometry 약물 이해 분석 결과는 측정 하는 약물의 약리 프로 파일에 영향을 미칠 수 있는 약물 관련 NAbs의 민감하고 mechanistically 관련 생체 외에서 방법을 제공 합니다. 우리는 이전 메서드를 유효성을 검사 하 고 약 elosulfase 알파8이 플랫폼을 사용 하 여 임상 샘플 테스트. 여기는 다른 치료 단백질 또는 ERTs에 적용할 수 있습니다 상세한 단계별 프로토콜에 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 필터 장치, 500 mL 진공 필터 플라스크</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom 96-well culture plates</td><td>Thermo-Nunclon</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>멸균 시약 저장용기</td><td>VistaLab</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>96웰 흰색 둥근 바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트 플레이트</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>96-well 폴리프로필렌 튜브, 8-튜브 스트립</td><td>Corning</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 비드 분리기 튜브 랙</td><td>V& P Scientific, Inc</td><td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag -2 자</td><td>석 Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag -96 사이드 스커트 자석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad TC20 자동 세포 계수기</td><td>BioRad</td><td>1450103</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 셰이커</td><td>VWR</td><td>12620-928</td><td></td></tr><tr><td>갤럭시 미니스타 마이크로원심분리기</td><td>VWR</td><td>C1413</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 CO2 인큐베이터</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>생물안전 캐비닛</td><td>Labcono</td><td>정제기 세포 논리 +</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB152&거래;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 단백질 라벨링 키트</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20173</td><td></td></tr>, <tr><td>Dynabeads M270, Streptavidin,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65306</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link, NHS-LC-LC-Biotin,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640, 1x Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A10491-01-500mL</td><td></td></tr>, <tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep (100x) 액체 제형</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS 칼슘 및 마그네슘 없음</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라-포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15735-85</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정 가능한 바이올렛 데드 셀 스테인 키트, 405 nm 여기용</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-100mL</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>3059</td><td></td></tr><tr><td>풀드 인간 매트릭스 (예: 인간 혈청 또는 뇌척수액)</td><td>생물 재생 IVT</td><td>웹사이트에서</td><td></td>견적 요청</tr><tr><td>VWR 폴리에스터 플레이트 필름</td><td>VWR</td><td>60941</td><td></td></tr><tr><td>Seal & 샘플 알루미늄 호일</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

효소 대체 요법 (ERTs)의 관리 및 다른 생물 학적 치료 환자에 게 마약 방지 면역 반응을 유도 수 있습니다. 특히 그 마약, 중화 항 체 (NAbs)를 나의 생물 학적 활동을 무력화 수 있습니다 이러한 마약 방지 항 체 (ADA)의 특성은 약물의에이 항 체의 효과 이해 하는 중요 한 약리 프로 파일입니다. 이 프로토콜에서는 인간의 매트릭스에 대표 lysosomal ERT의 세포질 통풍 관을 중화 하는 요소를 검색 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 설명 합니다. 3 절차의 프로토콜 구성: 심사, 확정 단계를 감지, 분석 실험 titer 식별, 그리고 중화 주제 샘플에 항 체 titer의 상대적 수준을 확립.
이 방법에서는, 샘플 먼저 fluorophore 활용 ERT 제품 혼합 다음 셀 [예를 들면, 인간 T 림프 톨 (Jurkat 세포)] 세포-표면 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CI-M6PR), 표현 하는 인 큐베이 팅 하 고 마지막으로, 교류 cytometer와 분석. 반면, NAbs의 존재는 마약을 바인딩할 하 고 CI M6PR 바인딩 및 통풍 관을 방해 NAbs 없이 샘플은 fluorophore 활용 ERT 제품 통해 CI M6PR의 통풍 관에 발생 합니다. Fluorophore 활용 ERT Jurkat 세포에 의해 내 면의 양은 cytometry에 의해 측정 하 고 대표적인 약물 순진한 매트릭스 존재 얻은 응답에 비해 백분율 (%) 신호 억제로 평가. 확정 단계 샘플 미리 incubated 구슬과 ERT 활용 된 자기 세포로 부 화 하기 전에 (예: NAbs) 마약에 바인딩되는 마약 관련 요소를 고갈 하는. 샘플 화면 하 고 마약 관련 NAbs 분석 결과에 대 한 긍정적인 확인을 순차적으로 생성 한 항 체 titer를 희석 됩니다. 반 정량적 항 체 titers 약물 안전 및 효 험의 측정 상관 될 수 있습니다.

방법의 첫 날, Jurkat 세포의 냉동된 약 수는 해 동 도금, 그리고 테스트 샘플을 준비 했다. 그림 1 예제 판 지도를 보여준다. 두 번째 날, 샘플 Jurkat 세포와 혼합 하 고 약 3 시간 15 분 동안 37 ° C에서 incubated 했다. 셀 다음 세척, PFA, 고정 되었고 교류 cytometer에서 분석. 그림 2 예제 교류 cytometer 설정을 보여 줍니다.
전략 게이팅 cytometry 라이브 단일 Jurkat 세포24 (그림 3)에 fluorophore 활용 된 약물의 양을 측정 하도록 설계 되었습니다. 셀 게이트 세포질 파편을 제외 하 여 파편에서 분리 되었다 [일반적으로, 낮은 앞으로 분산형 (FSC)] 및 죽은 세포 [일반적으로, 높은 쪽 (SSC) 분산형], 분석25라이브 셀만을 떠나. 단일 셀 다음 게이트 높은 FSC 지역과 낮은 FSC 높이26제외 하 여 셀 클러스터에서 분리 되었다. 세포 생존 능력 얼룩 없이 그대로 막 죽 었 거 나 건강에 해로운 셀 표시로 치료 했다 고 추가 게이트 죽은 세포22제외를 만들었습니다. 라이브 단일 셀의 MFI fluorophore 활용 ERT 통풍 관의 분석을 위해 사용 되었다. 시험 결과 심사 하는 잠재력의 예를 들어, 대리 항 약물 항 체 긍정적인 컨트롤 [예를 들어, 높은-품질 관리 (HQC)]의 높은 금액으로 아군 매트릭스 fluorophore 활용 ERT 글귀, 결과의 낮은 MFI에 저해 약 300 (그림 3)입니다. 반면, 긍정적인 제어 항 체의 부재에서 매트릭스와 incubated 셀 높은 MFI 있어야 (MFI 그림3에서 37,830 =), fluorophore 활용 ERT의 통풍 관을 보여주는.
예를 들어 여기에 대 한 긍정적인 제어 항 체 선정 되었다 중화 (즉, CI M6PR 통해 ERT 글귀) 약물의 행동의 메커니즘에 따라. Fluorophores의 패널은 또한 테스트 하 고 최적의 분석 결과 감도 및 동적 범위1에 대 한 비교. 사이 퍼 5e는 약27의 lysosomal 대상의 추가 조치로 일부 ERTs에 관련성이 있을 수도 있습니다 산 성 pH에서의 증가 형광으로 시험 되었다. 녹색 형광 성 염료 (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 488), 그리고 빨강 형광 염료 (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 647) 또한 시험 되었다. 어떻게 다른 fluorophores의 예로 수행할 수 그림 4a 와 4b에 제시. 예제에서는 알 렉 사 Fluor 647 ERT (예를 들어, 낮은 PC 농도에서 높은 %SI) 우수한 감도와 넓은 동적 범위 (~ 3 크기 순서) 최상의 성능을 했다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> 그림 4: 다른 fluorophore-ERT 어원이 같은 말에서 결과 예. (A) 분석 결과 개발 하는 동안 긍정적인 제어 (PC) 희석 곡선 평가 되어야 한다 다른 fluorophore 활용 ERTs를 사용 하 여. 예, 여기 두 fluorophore 활용 ERTs (알 렉 사 Fluor 488와 사이 퍼 5e) 6.25 µ g/mL에서와 밝은 fluorophore 활용 ERT (알 렉 사 Fluor 647) 1.56 µ g/mL에서 긍정적인 제어 NAbs의 농도 증가 하는 면 전에 서 시험 되었다. (B)이이 패널 표시 패널 A 에서 곡선 그래프로, MFI를 사용 하 여 알 렉 사 Fluor 647 활용 된 ERT를 사용 하 여 동적 범위에 상당한 증가 보여. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
설명 하는 방법을 검색, 확인, 및 보간 NAb titer3의 준 양적 수준에 대 한 계층형된 접근 이다. 분석 결과 분석 결과 감도, 정밀도, 선택도, 특이성, 약물 내성, 견고성를 포함 하는 매개 변수 유효성 검사에 대 한 준비 이며 컷된 포인트에 따라 평가 되어야 한다 설정 설립 guidances1,3 .
샘플 심사 삭감 포인트 (SCP) 보다 큰 %SI 값 가져온 때 잠재적으로이 분석 결과에서 긍정적인 간주 됐다. SCP는 대표적인 인구에서 마약 순진한 샘플 테스트 신호 강도 (SI)3의 상대적 감소를 측정 하 여 통계적으로 결정 했다. 지도 (FDA)의 예를 들어 권장 SCP는 일반적으로 분산 된 데이터 세트의 95번째 백분위 수에 설정 되 고 SCP 계산 방법 되었습니다 다른 곳에서 상세히 설명1. 모든 샘플 분석 결과 신호 (측정 시 % 증가) SCP 이상 감소 하는 잠재적으로 긍정적인 결정 했다 및 SCP 보다 높은 결과 (없이 변경 또는 SI % 감소) 부정적인 것으로 간주 됩니다.
긍정적인 (SCP 위의 %SI) 상영 샘플은 ERT NAbs의 특이성을 결정 하는 확실 한 분석 결과에서 테스트 되었습니다. 확실 한 분석 결과 ERT 활용 자석 구슬 약물 특정 항 체 또는 억제 요인 제거와 미리 배양 하 여 수행 되었다. RR (MFI 상영을 확정 MFI의 비율) NAbs의 수 샘플에서 제거 결정을 평가 했다. RR 양성 [즉, 확실 한 컷된 포인트 (CCP)]의 계산 된 임계값 보다 높은 anti-drug NAbs의 존재를 표시. 심사 분석 결과에서 확실 한 분석 결과에서 대표적인 인구에서 치료 순진한 샘플을 평가 하 여 먼저 CCP은 설립 해야한다. CCP는 통계적으로 결정된 1% 긍정 비율에 근거 했다 고 했다 임계값 지정 긍정적으로 확인된 샘플 (그림 5)3.
샘플을 상영 하 고 긍정적인 확인 순차적으로 희석 되었고 상대적 수준 또는 각 샘플에서 NAbs의 titer 결정 titer 분석 결과에서 테스트. 샘플 테스트 긍정적인 그것 [예를 들어, 포인트 (TCP)를 잘라 titer]에 지정 된 임계값을 넘어 가장 높은 희석은 샘플 titer (그림 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> 그림 5: 예제 샘플 테스트 결과. 이러한 패널 예를 보여 테스트 샘플의 포지티브 또는 네거티브 심사 위 또는 아래 17.51%의 SCP로 시. 긍정적인 샘플 다음 약물 활용 자석 구슬 고갈 분석 결과에서 테스트 이전 샘플에서 약물 특정 항 체를 사용 하 여 확실 한 분석 결과에서 테스트 되었습니다. 복구 비율 (RR) 확실 한 컷된 포인트 보다 큰 샘플 (즉, RR = 1.315) 긍정적인 확인할 수로 간주 됐다. 샘플 확인 긍정적인 신호 건너 titer 포인트 titer (희석 비율) 샘플 결과 titer를 같게 잘라 포인트 설정 (TCP)를 잘라 때까지 희석 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
분석 결과 반복성 및 다양성 더 이상의 애 널 리스트와 몇 일 동안 시험 되었다. QCs는 처음 하나의 일괄 처리에서 준비 하 고 서브-aliquoted 1 x 사용 했다. 3 d 과정 두 애 널 리스트 분석 결과의 전체 자릿수를 보여 QCs의 여러 분석 결과 수행 합니다. 남북 및 내부 분석 정밀도 QCs의 CV % 표시 되는 예제 데이터에서 % 이력서 &lt; 20% (그림 6)1의 FDA 지침의 권고는 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> 그림 6: QC 정밀 데이터 두 애 널 리스트와 함께 3 일 동안 생성의 예. 정밀 데이터는 분산 분석 (ANOVA) DeSilva 외 에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 된 28. (실행) 내 내부 배치 및 (실행) 사이 간 배치 통계 %cv.로 보고 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리는 중화 항 체 또는 인간 매트릭스, 뇌 척추 액체 (CSF) 등 인간의 혈 청에에서 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 방해 하는 다른 요소를 감지 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 제시.

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

이 방법은 중화 항체가 약물 안전성, 효능, 약동학 및 약력학 프로파일에 미치는 영향에 대한 면역원성 및 생물분석 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반정량적 방식으로 약물 특이적 중화 항체를 측정하기 위한 민감하고 생물학적으로 관련된 세포 기반 방법을 제공한다는 것입니다. 이 기술에서 형광단으로 표지된 효소는 만노스-6-인산염 잔기와 양이온 독립 만노스-6-인산염 수용체 또는 CI-M6PR에 결합을 통해 Jurkat 세포에 들어갑니다.효소 수용체 상호작용을 방해하는 중화 항체는 유세포 분석법으로 측정된 형광 감소를 유도합니다. 먼저 96웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 세포 성장 배지에 7.5배 10을 파종하여 섭씨 37도, 5% 이산화탄소와 95% 습도에서 14-20시간 동안 배양합니다. 먼저 무혈청 배지에서 분석 샘플을 1 대 2.5 비율로 희석합니다.그런 다음 각 샘플 60마이크로리터를 96웰 흰색 둥근 바닥 비결합 폴리프로필렌 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 이것은 샘플 배양 플레이트가 될 것입니다. 양성 판정이 완료되어 확인이 필요한 샘플의 경우, 효소 대체 요법(Enzyme Replacement Therapy) 또는 ERT 비드의 바이알을 와류로 처리하고, 15ml 원추형 튜브에 적절한 수의 비드를 추가하여 또 다른 와류를 유발합니다.그런 다음 튜브를 마그네틱 튜브 랙에 2분 동안 놓고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 네 번째 세척 후 100마이크로리터의 비드를 새로운 흰색 96웰 원형 바닥 비결합 폴리프로필렌 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 모든 비드가 도금되면 플레이트를 96웰 사이드 스커트 자석에 놓고 투명한 상층액을 조심스럽게 제거하기 전에 비드가 펠릿을 형성하도록 합니다.다음으로, 각 샘플 140마이크로리터를 적절한 웰에 추가하고 실온에서 약 800RPM의 회전식 셰이커에서 최소 60분 동안 흔들기 위해 플라스틱 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 그런 다음 비드가 다른 펠릿을 형성할 수 있도록 96웰 측면 스커트 자석에 확인 플레이트를 놓고 60마이크로리터의 샘플을 96웰 흰색 둥근 바닥 비결합 폴리프로필렌 샘플 배양 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 스크리닝되고 양성으로 확인된 샘플의 경우 역가 시리즈를 수행할 수 있습니다.역가 시리즈를 준비하려면 사전 결정된 역가 절단 지점을 교차할 수 있도록 풀링된 매트릭스의 샘플을 충분한 횟수만큼 연속으로 희석하고 각 희석된 샘플 60마이크로리터를 샘플 배양 플레이트의 적절한 웰에 추가하고 적절한 농도의 형광단 표지 ERT 60마이크로리터를 텍스트 프로토콜에 따라 새로운 96웰 흰색 둥근 바닥 비결합 폴리프로필렌 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 그런 다음 형광단 ERT 샘플 용액을 여러 번 피펫팅하여 플레이트를 혼합하고 호일로 감싸 섭씨 2도에서 8도에서 14-20시간 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 섭씨 37도의 비드 수조에서 샘플 플레이트를 10-15분 동안 따뜻하게 하고 도립 현미경으로 도금된 셀을 확인하여 세포가 건강하고 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.플레이트가 따뜻해지면 실험 플레이트 맵에 따라 100마이크로리터의 샘플과 형광단이 표지된 ERT 혼합물을 세포 플레이트에 추가하고 세포를 다시 3시간 15분 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화하고 각 웰 바닥에 펠릿이 있는지 확인합니다. 플레이트를 30-45도 각도로 잡고 펠릿을 방해하지 않고 각 웰의 상층액을 조심스럽게 제거하고 웰당 원심분리당 200마이크로리터의 DPBS로 세포를 3회 세척합니다.마지막 세척 후 각 웰에 100마이크로리터의 살아있는 죽은 얼룩을 추가하여 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화하고 웰당 200마이크로리터의 DPBS로 세포를 세척합니다. 세척된 펠릿을 웰당 섭씨 2도에서 8도, 파라포름알데히드 100마이크로리터에 재현탁하고 부드러운 펄스 소용돌이를 위해 플레이트를 밀봉합니다.그런 다음 플레이트를 호일로 싸서 섭씨 2도에서 8도에서 10분 동안 고정합니다. 유세포 분석으로 세포 생존율을 분석하려면 세포를 웰당 50마이크로리터의 DPBS와 혼합하여 단일 세포 현탁액을 달성하고 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 유세포 분석기에서 세포를 판독합니다. 그런 다음 살아있는 단일 세포의 MFI(Median Fluorescence Intensity)에 따라 Fluorophore conjugated ERT upupage를 평가할 수 있습니다.분석에서 테스트하기 전에 실험용 스크리닝 절단 지점은 양성 및 음성 샘플을 결정하기 위한 임계값으로 계산됩니다. 이 예에서는 많거나 적은 양의 중화 항체로 스파이크된 품질 대조군이 표시됩니다. 그런 다음 양성 샘플은 약물 접합 마그네틱 비드를 사용하여 확인 분석에서 테스트하여 샘플에서 약물 특이적 항체를 고갈시킵니다.회수율이 확인 절단점보다 큰 샘플은 양성으로 간주됩니다. 스크리닝하고 양성으로 확인된 샘플은 각 샘플에서 중화 항체의 상대적 역가를 결정하기 위해 순차적으로 희석되고 역가 분석에서 테스트됩니다. 역가는 역가 절단점을 교차하는 두 희석 사이의 보간 값입니다.여기에서 볼 수 있듯이, 살아있는 단일 세포 MFI는 형광단 접합 ERT 흡수를 평가했습니다. 예를 들어, 이 실험에서 양성 대조 항체로 스파이크된 매트릭스는 형광단 접합 ERT 흡수를 억제하여 형광 강도 중앙값을 낮췄습니다. 대조적으로, 양성 대조군 항체가 없는 상태에서 매트릭스와 함께 배양된 세포는 더 높은 중앙값 형광 강도를 보였으며, 이는 형광단 접합 ERT의 흡수를 입증했습니다.이 절차를 시도하는 동안 신뢰할 수 있고 일관된 결과를 얻기 위해 엄격한 배양 기간을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 효소 대체 요법에 대한 분석을 최적화하는 것도 중요합니다. 개발 후 이 기술은 약물 개발에서 면역원성 및 생물 분석 과학자들이 세포 흡수 중화 항체가 ERT 안전성 및 효능에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.인간 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 모든 샘플을 잠재적으로 감염될 수 있는 것처럼 취급해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

detection-antibodies-that-neutralize-cellular-uptake-enzyme

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 양 혈청 샘플에서 알칼리 인산가수분해효소 발현 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6(rAAV6) 벡터에 대한 중화 항체의 존재를 검출하는 체외 비색 분석을 시연합니다. 이 분석은 인간 태반 알칼리성 인산가수분해효소 유전자를 암호화하는 AAV와 그 기질 사이의 반응을 활용하여 불용성 보라색 생성물을 생성합니다.

세포 기반 AAV 중화 항체 분석: 혈청 내 특정 아데노 관련 바이러스에 대한 중화 항체를 검출하는 비색 기법

이 비디오는 인간 혈청에서 섬 자가항체의 전기화학발광 검출을 보여줍니다. 혈청의 항체는 루테늄 접합 항원을 비오틴화 포획 항원에 연결하여 전기화학발광 측정으로 검출되는 복합체를 형성합니다.

전기화학발광 분석을 사용한 human islet 자가항체 검출

최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

여기에서 우리는 적혈구에 대한 항체에 의해 유도 된 보체 활성화를 측정하기위한 두 가지 분석을 설명합니다. 현재의 분석을 통해 가장 큰 장점은 양적 및 쉬운 해석하는 성격이다.

적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

우리는 암 환자에게서 말초 혈액의 단지 한 방울을 요구하는 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석분석서를 개발했습니다.

말초 혈액 한 방울에서 파생 된 T 세포에 바인딩된 PD-1 차단 항체 모니터링

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

포괄적인 실험실 프로토콜 및 분석 워크플로우는 AAV6에 대한 중화 요소를 감지하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 간단한 색채 세포 기반 분석법을 위해 설명됩니다.

색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

여기에서는 ADCC bioassay kit를 사용하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 ADCC 메커니즘을 규명하고 암 면역 요법에서 항체의 치료 가능성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가

새로운 anti-HER2 단클론 항체를 사용하여 검증된 샌드위치 ELISA 분석을 제시합니다. 이 분석을 통해 체외 배양 세포 및 혈액 및 조직을 포함한 기타 샘플에서 세포 결합 및 방출 HER2 단백질을 정밀하게 정량화할 수 있습니다.

세포에서 방출되고 세포에 결합하는 인간 표피 성장 인자 수용체 2의 포괄적인 측정을 위한 검증된 면역화학 분석

학습하세요 세포 기반 흐름 세포측정법을 이용해 효소 대체 요법에 영향을 주는 중화 항체를 Jurkat 세포에서 검출하는 방법입니다. 이 기술은 약물 특이적 중화 항체를 반정량적으로 측정하여 면역원성 연구에 활용됩니다.

세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

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