세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

이 방법은 중화 항체가 약물 안전성, 효능, 약동학 및 약력학 프로파일에 미치는 영향에 대한 면역원성 및 생물분석 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반정량적 방식으로 약물 특이적 중화 항체를 측정하기 위한 민감하고 생물학적으로 관련된 세포 기반 방법을 제공한다는 것입니다. 이 기술에서 형광단으로 표지된 효소는 만노스-6-인산염 잔기와 양이온 독립 만노스-6-인산염 수용체 또는 CI-M6PR에 결합을 통해 Jurkat 세포에 들어갑니다.

효소 수용체 상호작용을 방해하는 중화 항체는 유세포 분석법으로 측정된 형광 감소를 유도합니다. 먼저 96웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 세포 성장 배지에 7.5배 10을 파종하여 섭씨 37도, 5% 이산화탄소와 95% 습도에서 14-20시간 동안 배양합니다. 먼저 무혈청 배지에서 분석 샘플을 1 대 2.5 비율로 희석합니다.

그런 다음 각 샘플 60마이크로리터를 96웰 흰색 둥근 바닥 비결합 폴리프로필렌 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 이것은 샘플 배양 플레이트가 될 것입니다. 양성 판정이 완료되어 확인이 필요한 샘플의 경우, 효소 대체 요법(Enzyme Replacement Therapy) 또는 ERT 비드의 바이알을 와류로 처리하고, 15ml 원추형 튜브에 적절한 수의 비드를 추가하여 또 다른 와류를 유발합니다.

그런 다음 튜브를 마그네틱 튜브 랙에 2분 동안 놓고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 네 번째 세척 후 100마이크로리터의 비드를 새로운 흰색 96웰 원형 바닥 비결합 폴리프로필렌 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 모든 비드가 도금되면 플레이트를 96웰 사이드 스커트 자석에 놓고 투명한 상층액을 조심스럽게 제거하기 전에 비드가 펠릿을 형성하도록 합니다.

다음으로, 각 샘플 140마이크로리터를 적절한 웰에 추가하고 실온에서 약 800RPM의 회전식 셰이커에서 최소 60분 동안 흔들기 위해 플라스틱 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 그런 다음 비드가 다른 펠릿을 형성할 수 있도록 96웰 측면 스커트 자석에 확인 플레이트를 놓고 60마이크로리터의 샘플을 96웰 흰색 둥근 바닥 비결합 폴리프로필렌 샘플 배양 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 스크리닝되고 양성으로 확인된 샘플의 경우 역가 시리즈를 수행할 수 있습니다.

역가 시리즈를 준비하려면 사전 결정된 역가 절단 지점을 교차할 수 있도록 풀링된 매트릭스의 샘플을 충분한 횟수만큼 연속으로 희석하고 각 희석된 샘플 60마이크로리터를 샘플 배양 플레이트의 적절한 웰에 추가하고 적절한 농도의 형광단 표지 ERT 60마이크로리터를 텍스트 프로토콜에 따라 새로운 96웰 흰색 둥근 바닥 비결합 폴리프로필렌 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 그런 다음 형광단 ERT 샘플 용액을 여러 번 피펫팅하여 플레이트를 혼합하고 호일로 감싸 섭씨 2도에서 8도에서 14-20시간 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 섭씨 37도의 비드 수조에서 샘플 플레이트를 10-15분 동안 따뜻하게 하고 도립 현미경으로 도금된 셀을 확인하여 세포가 건강하고 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.

플레이트가 따뜻해지면 실험 플레이트 맵에 따라 100마이크로리터의 샘플과 형광단이 표지된 ERT 혼합물을 세포 플레이트에 추가하고 세포를 다시 3시간 15분 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화하고 각 웰 바닥에 펠릿이 있는지 확인합니다. 플레이트를 30-45도 각도로 잡고 펠릿을 방해하지 않고 각 웰의 상층액을 조심스럽게 제거하고 웰당 원심분리당 200마이크로리터의 DPBS로 세포를 3회 세척합니다.

마지막 세척 후 각 웰에 100마이크로리터의 살아있는 죽은 얼룩을 추가하여 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화하고 웰당 200마이크로리터의 DPBS로 세포를 세척합니다. 세척된 펠릿을 웰당 섭씨 2도에서 8도, 파라포름알데히드 100마이크로리터에 재현탁하고 부드러운 펄스 소용돌이를 위해 플레이트를 밀봉합니다.

그런 다음 플레이트를 호일로 싸서 섭씨 2도에서 8도에서 10분 동안 고정합니다. 유세포 분석으로 세포 생존율을 분석하려면 세포를 웰당 50마이크로리터의 DPBS와 혼합하여 단일 세포 현탁액을 달성하고 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 유세포 분석기에서 세포를 판독합니다. 그런 다음 살아있는 단일 세포의 MFI(Median Fluorescence Intensity)에 따라 Fluorophore conjugated ERT upupage를 평가할 수 있습니다.

분석에서 테스트하기 전에 실험용 스크리닝 절단 지점은 양성 및 음성 샘플을 결정하기 위한 임계값으로 계산됩니다. 이 예에서는 많거나 적은 양의 중화 항체로 스파이크된 품질 대조군이 표시됩니다. 그런 다음 양성 샘플은 약물 접합 마그네틱 비드를 사용하여 확인 분석에서 테스트하여 샘플에서 약물 특이적 항체를 고갈시킵니다.

회수율이 확인 절단점보다 큰 샘플은 양성으로 간주됩니다. 스크리닝하고 양성으로 확인된 샘플은 각 샘플에서 중화 항체의 상대적 역가를 결정하기 위해 순차적으로 희석되고 역가 분석에서 테스트됩니다. 역가는 역가 절단점을 교차하는 두 희석 사이의 보간 값입니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 살아있는 단일 세포 MFI는 형광단 접합 ERT 흡수를 평가했습니다. 예를 들어, 이 실험에서 양성 대조 항체로 스파이크된 매트릭스는 형광단 접합 ERT 흡수를 억제하여 형광 강도 중앙값을 낮췄습니다. 대조적으로, 양성 대조군 항체가 없는 상태에서 매트릭스와 함께 배양된 세포는 더 높은 중앙값 형광 강도를 보였으며, 이는 형광단 접합 ERT의 흡수를 입증했습니다.

이 절차를 시도하는 동안 신뢰할 수 있고 일관된 결과를 얻기 위해 엄격한 배양 기간을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 효소 대체 요법에 대한 분석을 최적화하는 것도 중요합니다. 개발 후 이 기술은 약물 개발에서 면역원성 및 생물 분석 과학자들이 세포 흡수 중화 항체가 ERT 안전성 및 효능에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

인간 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 모든 샘플을 잠재적으로 감염될 수 있는 것처럼 취급해야 한다는 것을 잊지 마십시오.