Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

RNA에서 이 포스포로티오에이트 접근법의 전반적인 목표는 단일 단계로 포화 돌연변이 유발을 수행하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절과 같은 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 단일 단계로 RNA의 단백질 결합 부위의 포화 돌연변이 유발을 달성할 수 있다는 것입니다.

이 single-step saturation mutagenesis 프로토콜의 핵심 단계는 단백질 결합 부위 내에서 non-wild type nucleotides로 DNA template를 도핑하는 것입니다. 먼저 DNA 합성기에서 화학적 합성으로 T7 프라이머를 합성합니다. 다음으로, 단백질 결합 부위에 해당하는 도핑된 올리고뉴클레오티드를 합성합니다.

이 예에서, 밑줄이 그어진 염기서열은 초파리 성 치사 단백질 결합 부위의 역 보체를 포함하며, 각 도핑 부위는 X.Use로 표시되는 각 도핑 부위에 대해 90% 야생형 뉴클레오티드와 10%비야생형 뉴클레오티드의 비율을 사용합니다. 녹색으로 표시된 염기서열은 T7 프라이머 염기서열과 상보적이며 체외 전사를 위한 T7 프로모터입니다. 이 프로토콜의 다음 단계는 각 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드와 별도의 RNA를 합성한 다음 RNA의 5-프라임-엔드 방사성 표지입니다.

20마이크로리터 전사 반응에서 각 포스포로티오에이트에 대한 RNA를 합성합니다. 각 마이크로 원심분리 튜브에 T7 전사 완충액, 마이크로몰 T7 올리고뉴클레오티드 1개, 마이크로몰 도핑된 올리고뉴클레오티드 1개, DTT 10밀리몰, GTP 2밀리몰, ATP, CTP 및 UTP 각각 1밀리몰, T7 RNA 중합효소 마이크로리터당 2개를 추가합니다. 한 튜브에 0.167 밀리몰의 알파-티오 ATP를 추가하고 다른 튜브에 0.05 밀리몰의 알파-티오 UTP를 추가합니다.

RNA 합성 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 각 RNA 샘플에 열에 불안정한 알파 포스파타제 2.5마이크로리터와 10X 포스파타제 완충액 2.5마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 10-30분 동안 배양하여 5-프라임 인산염을 제거합니다.

알칼리성 인산가수분해효소를 섭씨 80도에서 2-5분 동안 가열하여 비활성화합니다. 나머지 단계는 방사능 사용과 관련이 있으며 방사능으로부터 보호하기 위해 적절한 예방 조치와 플렉시 유리 실드를 사용하여 수행해야 합니다. 탈인산화된 RNA의 5-프라임 말단을 방사성 표지하려면 10마이크로리터 반응 부피에서 1마이크로리터의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 1마이크로리터의 감마 P32 ATP를 사용합니다.

반응 혼합물을 섭씨 37도에서 30-60분 동안 배양합니다. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 효소를 섭씨 65도에서 20-30분 동안 가열하여 비활성화합니다. 10%denaturing polyacrylamide 젤에 있는 반응을 실행하십시오.

자가방사선 촬영으로 겔에서 RNA를 찾고 방사선 표지된 RNA가 포함된 겔 슬라이스를 절제합니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 젤 슬라이스를 피펫 팁으로 측면에 대고 눌러 으깬 다음 proteinAse K buffer를 추가합니다. 튜브를 실온에서 2시간에서 밤새 회전시킵니다.

다음으로 겔 슬러리를 원심분리하고 완충 용액을 수집하고 겔을 버립니다. 동일한 부피의 페놀 클로로포름으로 각 용액을 두 번 추출합니다. 그 후, 클로로포름으로 용액을 한 번 추출하십시오.

수성상을 수집하고 pH 5.2의 3 몰 아세트산 나트륨 0.1 부피, 운반체 tRNA 또는 글리코겐 및 에탄올 2.5 부피를 첨가하십시오. 샘플을 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 유지합니다. 고속 마이크로 원심분리기에서 샘플을 16, 873회 g에서 5-10분 동안 원심분리합니다.

RNA 펠릿을 방해하지 않고 완충 에탄올 용액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 2-5분 동안 원심분리기를 사용합니다. 에탄올을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 자연 건조시킵니다.

각 펠릿을 20-50마이크로리터의 DEPC 처리수에 재현탁합니다. 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 간섭으로 인한 분할의 개념이 여기에 설명되어 있습니다.

단백질 결합 과정에서 RNA 분자는 단백질 결합 분획과 결합되지 않은 분획 사이에서 분할합니다. 주어진 위치에 있는 특정 뉴클레오티드가 단백질 결합을 방해하는 경우, 단백질 결합 분획에서 우선적으로 제외됩니다. 그 후, 요오드는 포스포로티오에이트 혼입 부위에서 RNA를 절단하는 데 사용됩니다.

이 절차를 시작하려면 10 밀리몰 Tris-HCl, 1 밀리몰 DTT, 50 밀리몰 염화칼륨, RNase 억제제 마이크로리터당 0.5 단위, 아세틸화 소 혈청 알부민 마이크로리터당 0.09 마이크로그램, 1 밀리몰 EDTA, tRNA 마이크로리터당 0.15 마이크로그램, 5-프라임 엔드 방사성 표지 RNA 및 적절한 농도의 단백질 6마이크로리터를 포함하는 각 반응으로 단백질-RNA 결합 반응을 설정합니다. 단백질 결합 반응을 섭씨 25도에서 20-30분 동안 배양합니다. 니트로셀룰로오스 필터 결합에 의해 단백질 결합 RNA 분획을 결합되지 않은 분획과 분리합니다.

실온에서 진공 매니폴드에 연결된 니트로셀룰로오스 필터에 결합 반응을 적용합니다. 결합되지 않은 RNA가 필터를 통해 흐르는 동안 RNA 단백질 복합체만 필터에 유지됩니다. 잔류 방사성 RNA가 포함된 니트로셀룰로오스 필터 부분을 마이크로 원심분리 튜브에 맞도록 더 작은 조각으로 자르고 필터 조각을 담가두기에 충분한 proteinase K 버퍼를 추가합니다.

필터 조각에서 RNA를 2-3시간 또는 하룻밤 동안 용리합니다. 다음으로, 각 튜브의 용액을 새 튜브로 옮기고 앞에서 설명한 것처럼 페놀 클로로포름과 클로로포름으로 추출합니다. 수성상을 모아 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨, pH 5.2 및 2.5 부피의 에탄올을 첨가하고 냉동실에서 배양합니다.

앞서 그림과 같이 RNA를 원심분리, 세척 및 건조시킨 후 DEPC 처리된 물에 RNA를 재현탁합니다. 요오드와 관련된 모든 단계는 배기 후드에서 수행해야 합니다. 포스포로티오에이트 통합 부위에서 RNA를 절단하려면 최대 10마이크로그램의 운반체 tRNA를 포함하는 20마이크로리터의 DEPC 처리된 물에 1밀리몰 요오드를 각 RNA 샘플에 추가합니다.

실온에서 5분 동안 배양합니다. 앞서 보여준 바와 같이 아세트산나트륨과 에탄올을 첨가하여 절단된 RNA를 침전시킵니다. 절단된 RNA를 변성 겔을 위한 로딩 염료에 재현탁합니다.

가열 후 샘플을 15-20% 변성 폴리아크릴아미드 겔에 넣고 전기영동으로 RNA 단편을 분리합니다. 폴리아크릴아미드 겔을 X선 필름에 노출시키고 자가방사선 촬영을 사용하여 결합된 분획 대 전체 풀에서 밴드를 검출합니다. 이 회로도는 간섭으로 인한 분할의 개념을 보여줍니다.

레인 T에서 총 RNA 분율, 밴드 강도는 모든 도핑된 위치에 대해 거의 동일합니다. 단백질 결합 RNA 분획에서 위치 1, 4 및 7에서 뉴클레오티드는 결합에 영향을 미치지 않습니다. 그러나 위치 3과 6에서는 결합을 방해하고 결합 분획에서 제외됩니다.

위치 5에서 간섭은 부분적입니다. 각 뉴클레오티드에 대한 쌍을 이룬 lane을 비교하면 4개의 뉴클레오티드를 모두 분석할 수 있습니다. 이 자가방사선 사진은 변성 겔에서 두 쌍의 레인을 보여줍니다.

레인 T는 총 RNA이고 레인 B는 단백질 결합 RNA입니다. 세로선은 성(sex)에 치명적인 결합 부위를 표시합니다. alpha-thio aline 쌍의 경우, 밴드 1, 2, 3 및 5는 전체 RNA 분획에 존재하지만 결합된 RNA 분획에는 없거나 크게 감소합니다.

알파-티오 울린 쌍의 경우, 밴드 7과 8은 결합 분획에서 상대적으로 덜 강합니다. 결합된 분획에서 우선적으로 제외되는 잔기는 단백질 결합에 중요합니다. RNA가 합성되고 5-프라임 말단 라벨링이 완료되면 이 기술은 적절하게 수행되면 12시간 이내에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 적절한 수준의 포스포로티오에이트 혼입과 결합을 위한 적절한 단백질 농도 측정이 중요한 고려 사항임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 적절한 기능 분석 또는 생체 내 테스트와 같은 다른 방법을 수행하여 돌연변이 유발 접근법의 결과를 검증하고 생물학적 관련성을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 더 비싸거나 더 힘들거나 둘 다인 다른 방법에 대한 대안을 제공합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 돌연변이 라이브러리를 설계 및 합성하고, 결합 반응을 수행하고, 각 풀에서 돌연변이 뉴클레오티드를 식별하고, 테스트된 각 위치에서 비야생형 뉴클레오티드의 영향을 정량적으로 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 폴리아크릴아미드 및 방사능으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 적절한 배기 장치 및 방사성 차폐막 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.