Name: 증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 기법으로 유전자 발현을 조절하는 증강자를 식별하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 SID4X-dCas9-KRAB 융합 단백질을 사용하여 효율적인 증강자 표적화를 가능하게 합니다.

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이 작품은 NIH/NHGRI R00 HG006922 및 J.G.에 NIH/NHGRI R01 HG008974 그리고 사냥꾼 Cancer 학회에 의해 지원 되었다. J.B.C.는 유전자 T32GM007464에 NIH 연수 프로그램에 의해 지원 되었다.

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<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
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<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
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<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
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<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 증강 기능 생 genomic 소재 시에 DNA 순서를 실제로 변경 하지 않고 해 부에 대 한 간단 하 고 유연한 방법을 설명 합니다. 반면 비슷한 개념 dCas9 리아27을 사용 하 여 이전에 게시 CRISPR 간섭 프로토콜, 증강 인자-i는 3 가지 주요 방법으로 이러한 프로토콜에서 다릅니다. 첫째, 증강 인자-i MAD120 증강 비활성화 달성 하기의 SIN3A 상호 작용 도메인을 활용 합니다. 증강 비활성화 HDAC 저 해제, 비활성화 하는 기본 메커니즘 HDAC 의존 하자를 사용 하 여 구출 될 수 있다. CRISPR dCas9-리아와 간섭, 달리 증강-i H3K9me3의 증 착에 연결 되지 않습니다. 사실은 RNAs, 3 일에 수확 되 고 세포 transfection 게시 가이드의 변이 도입에 의존 하는 증강 인자-i이 높습니다. CRISPR 간섭, H3K9me3 증가 7 일 게시물 변환12에서 관찰 됩니다. 마지막으로, 증강 인자-i 프로토콜 여러 사이트를 동시에 대상 및 대상의 효율성을 모니터링할 수 있는 전략을 제공 합니다. 모자이크-seq17, dCas9-리아는 여러 강화를 동시에, 대상 하는 데 사용 됩니다 하지만이 기술은 식 변화를 식별 하는 단일 셀 RNA 시퀀싱에 의존 하 고 (스 트로 겐-응답 유전자) 등 많은 유전자가 들 키 지 않고는 난청 단일 셀 RNA이 증강 인자-i의 감도 개별적으로 강화 연구 조합 어떤 유전자에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다.
증강 인자-i의 가장 중요 한 단계가 이다 transfection, 관심의 셀 라인에 대 한 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜 transfected 세포에 대 한 풍부 하 게 puromycin 치료에 의존 하지만 그 공동 transfecting 가이드 RNAs 형광 단백질 및 형광 셀 cytometry 사용 하 여 정렬 일부 셀에 대 한 더 나은 농축 방법으로 증명할 수 있습니다. 유형입니다. 문제 해결 및 확인 transfection 정량 식 가이드 RNAs의 수준과 SID4x-dCas9-리아 모니터링 하는 것이 좋습니다. 가이드 RNA 레벨은 낮은 경우 (사이클 임계값 > 30), 사용자가 고려할 수 있습니다 또한 대체 가이드 녹음 방송 생체 외에서 28등 RNA 생산 전략. 그것은 또한 가능한 높은 gRNA 수준에도 불구 하 고 가이드 RNA는 SID4x-dCas9-리아 단백질의 대상으로 하는 것은 비효율적, 어떤 경우에 다른 선택 가이드 RNA 시퀀스 할 수 있습니다. 증강 인자-i 치료 세포에서 chromatin와 융합 단백질에 칩 seq를 수행 하 여 대상으로의 효율성을 모니터링할 수 있습니다. SID4x-dCas9-리아, 관심 영역에서의 높은 신호는 그것의 상 상속 대상 유전자 식 변경 감지 하는 경우 다음 가능성이 지역 공부 하는 조건 하에서 그 유전자의 표정에 공헌 하지 않는다.
증강 인자-i의 한 가지 잠재적인 한계는 오프 대상 효과 너무 많은 사이트는 동시에 표적으로 하는 경우 누적 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 최저 CRISPR 방해 전략 있다 대상 효과 RNAi29, 보다 적은 특히 dCas9 리아 표현 polyclonal 셀 라인을 사용할 때. 우리가 본 SID4X-dCas9-리아의 게놈 바인딩 대상에서 동시에 10 개의 사이트를 대상으로 하는 동안 우리가 하지 그 바인딩 이벤트의 결과로 유전자 식 변경 확인 했습니다. 일부 강화 여러 발기인 또는 다른 강화 연락처 수 있습니다, 비록 유전자 규칙의이 형태는 일반적인 경우에 명확 하지 않다 많은 유전자 단일 증강의 대상으로 시 식에 변경 될 수 있음을 가능 하다. 식 변화는 특정 증강을 대상으로 관찰을 확인 하 고 오프-목표는 아니지만 효과, 사용자가 수행할 수 증강-i 겹치지 가이드 같은 지역 타겟팅 하는 RNAs의 두 가지 세트와 함께. 또한, nuclease 유능한 Cas9를 사용 하 여 영역의 유전자 삭제 추가 유전자 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다.
히스톤 deacetylation 통해 증강-i 기능으로 그것은 그것의 비활성화 능력 histone acetylation 감지할 수준을 강화 제한 가능. 타겟팅 특정 강화에 더 효과적일 수 있습니다 대체 억압 융해의 다양 한이 있다. DCas9 DNA methyltransferase 융해 유전자 발현 원심 강화30, 대상으로 하는 경우를 줄이기 위해 사용할 수 있습니다 하지만이 억압은 자주 과도. 또 다른 억압 적인 퓨전 히스톤 H3 리 27 trimethylation 리드 하 고 다양 한 세포 선 및 발기인31dCas9-리아와 비슷한 수준에서 유전자 발현을 누르는 GATA1 친구 (FOG1) 도메인을 사용 합니다. 흥미롭게도, 발기인, SID 도메인의 단일 복사본 증강-i에서 현재 사용 하는 4 복사본 보다 더 증강 비활성화를 제공할 수 있습니다 제안에 억압 적인 잠재력을 감소 dCas9 FOG1의 더 많은 복사본을 추가 합니다. 그것은 일부 loci 위의 dCas9 융해의 다른 조합에 의해 듀얼 타겟팅에서 이점을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 안정적인 장기 억압 dCas9 DNMT3a 및 dCas9-리아32동시 변환에 의해 얻을 수 있습니다. 이러한 억압 적인 융해의 대부분만 타깃이 되어 단일 장소에 한 번에, 그리고 그것은 불분명 남아 있는 여러 강화를 동시에 조작에 가장 효과적 이다.
증강 인자-i, 유전자의 소수에 대 한 강화의 조합을 공부에 대 한 적합 한 방법 동안 사용자 putative 강화 유전자의 수백을 공부 하고자 하는 경우 처리량에 여전히 다소 제한 됩니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램 이미징 기반 기술을 여러 샘플에서 여러 유전자를 동시에 계량을 통합할 예정 이다. 중요 한 것은, 이러한 기술은 시간이 걸리는 RNA 격리에 대 한 필요성을 제거, lysate에서 RNA 분자의 직접적인 탐지와 호환 됩니다. 이러한 적응 강화의 더 큰 세트의 심문을 촉진 한다.

시퀀싱 프로젝트 인코딩1, 로드맵 Epigenomics2, FANTOM 등 대규모3 확인 했습니다 인간 게놈 내 상 상속 강화의 수백만 수백 종류의 세포에서. 각 발기인 4.9 강화의 평균 연결 하 고 각 증강 연락처 2.4 유전자3의 평균 유전자 발현은 종종 여러 분산된 규정 상호 작용의 통합의 결과 제안 추정 된다. 중요 한 나머지 과제 정의 개별 강화 뿐만 아니라 유전자 발현에 기여 하는 하지만 어떻게 그들이 결합 하 여 식에 영향을 미칠. 유전 접근 일반적으로 쥐5 초파리4 에서 모형 유기 체에 강화 간의 관계를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 실험은 어렵고 여러 유전자에서 여러 강화의 연구에 대 한 낮은 처리량.
큰 규모로 증강 기능을 공부 하는 한 가지 방법은 대규모 병렬 기자 분석 실험을 포함 한다. 이 분석 실험 기자 유전자6식 드라이브를 그들의 능력에 대 한 DNA 시퀀스의 수천의 동시 상영에 대 한 수 있습니다. 이 분석 실험 DNA 순서 혼자 유전자 규칙 정보7전달 하기 충분할 수 나타났습니다, 그들은 온 네이티브 chromatin 컨텍스트 외부에서 수행 되 고의 주의 분리의 발기인. 또한, 대규모 병렬 기자 분석에 분석 되 고 DNA 시퀀스의 크기는 일반적으로 관련 주변 시퀀스를 제외 시킬 수 있습니다 미만 200 basepairs. 중요 한 것은, 기자가 분석만 한 번에 하나의 시퀀스의 활동 측정, 그들은 할 하지 고려 강화 사이 존재할 수 있는 복잡 한 관계. 따라서, 대규모 병렬 기자 분석 DNA 시퀀스의 본질적인 활동에 대 한 정보를 제공 될 수 있습니다, 그들은 할 하지 반드시 우리에 게는 게놈의 맥락에서 그 DNA 시퀀스의 기능.
최근 개발 된 CRISPR/Cas9 도구8 있다 그들은 내 생 로커 스에서 강화의 삭제에 대 한 허용 유전자 규칙의 연구를 촉진 했다. 그러나, genomic 불안정성으로 이어질 수 있습니다 여러 강화를 동시에 삭제 하 고 그것은 단일 셀 라인에서 연속 증강 삭제를 생성 하는 시간이 소요. 또한, 새로운 게놈 시퀀스 삭제 복구, 다음의 사이트에서 생성 되 고이 시퀀스 규제 기능을 얻을 수 있습니다. Cas9의 대체 버전9,10 활성화 또는 nuclease 불충분 한 형태의 Cas911,12 도메인을 억압의 융해에 의존 하는 유전자 발현을 변조를 위해 특별히 개발 되었습니다. (dCas9)입니다. 이 융해 단백질 그들은 육체적으로 DNA 순서를 변경 하 고 대신 epigenetics 규제 영역을 심문 하기 위해 변조로 여러 loci를 동시에 공부에 이상적입니다. 가장 널리 사용 되는 억압 적인 퓨전 리아, KAP1 공동 진압 복잡 한 신병이 억압 관련 히스톤 H3 리 진 9 trimethylation (H3K9me3)13의 증 착을 홍보입니다. dCas9-리아, 일컬어 CRISPR 간섭14,16; 유전자의 식15,그들의 공헌에 대 한 대상과 화면 개별 강화를 사용 되었습니다. 그러나, 그것은 하지 최적화 되었습니다 여러 영역을 동시에 대상에 대 한. 강화, 모자이크-seq17, 다중 CRISPR 간섭의 한 버전 사용 단일 셀 RNA-seq는 판독 하지만이 기술은 단일 셀의 낮은 감도 때문에 높게 표현한 유전자의 연구에만 적합 하 고 비싼 RNA-이
우리가 스 트로 겐에 transcriptional 응답의 컨텍스트 내에서 조합 증강 기능 해 부에 대 한 CRISPR 간섭을 기반 방법을 개발 하고자 했다. 스 트로 겐-응답 유전자의 약 절반 2 이상의 강화 근처의18, 에스트로겐 수용 체 알파 (응급실)을 준수할 여러 강화 에스트로겐 응답에 참여 하 고 규제 논리 필요 이해 수 있습니다 제안 포함 동시에 여러 명의 강화를 목표로. 초기 연구에서 발기인 CRISPR 방해를 사용 하 여 모든 발기인은 동등 하 게 리아 중재 억압19응답 제안, 우리 dCas9 별개의 억압 적인 도메인 추가의 비활성화를 촉진 수 있습니다 권유 다양 한 강화입니다. 우리 선택 Sin3a 상호 작용 도메인의 Mad1 (SID)20 히스톤 deacetylases21의 채용에 리드에 transcriptional 활동에 연관 된 히스톤 아 세 틸 그룹을 제거 하는. 중요 한 것은, SID 도메인 dCas922 와 이야기23, 융합 하는 때 유전자 발현을 감소에 효과적 이었고 Sin3a 다양 한 증강 시퀀스 컨텍스트24에 강력한 억압 적인 공동 요인이 될 표시 되었습니다. 우리 응급실, 준수할의 다른 강화 10 개를 대상으로 SID4x-dCas9-리아 (증강 인자-i)를 사용 하 고 응급실 바인딩 사이트 (ERBS) 4 유전자18에 스 트로 겐 transcriptional 응답에 필요한 식별 합니다. 우리는 또한 에스트로겐 transcriptional 응답의 생산에 협력 하는 사이트를 식별 하는 증강의 조합 대상. 우리는 50 개 사이트까지 잠재적으로 타겟팅 할 수 있습니다 동시에 감지 유전자 식 변화 발견. 칩 seq와 RNA-seq 사용 하 여, 우리는 증강-i은 여러 강화를 동시에 공부에 대 한 매우 구체적인 기술 시연 했다.
이 프로토콜에서 우리는 증강-i, 조직 문화 설정에 동시에 여러 강화의 기능 연구를 가능 하 게 하는 유연한 기술 수행에 관련 된 단계를 설명 합니다. 증강 인자-i 유전자 삭제와 상관 매우 하지만 히스톤 deacetylases (HDACs)에 따라 달라 집니다 일시적인 비활성화를 제공 합니다. 바이러스 성 벡터를 통해 안정적인 통합 반대 과도 transfection을 통해 가이드 RNAs를 제공,이 프로토콜 증 착 및 H3K9me3의 잠재적인 확산 방지 합니다. 이 프로토콜 세부 정보 가이드 RNA 디자인 및 깁슨 어셈블리의 transfection 통해 복제 RNAs lipofection를 사용 하 여 가이드와 결과 유전자 발현의 분석 정량 하 여 변경. 우리는 또한 게놈 transcriptome 수준에 증강-i 대상의 특이성을 평가 하기 위한 메서드가 포함 됩니다. 이 기술을 연구 개발 하는 동안 어 유전자 규정 강화 인간 암 세포 라인에서 어떤 포유류 증강의 해 부에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>ZR 96-well Quick-RNA Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII 제한 효소</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR 마스터 믹스(HF 버퍼</td><td>포함) NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA 클린 & 집중 장치 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 RLT 플러스</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>인간: 이시카와 세포</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac 토끼 다클론</td><td>활성 모티프&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 토끼 다클론</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG 마우스 단클론</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER 알파 토끼 다클론</td><td>산타</td>크루즈 <td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro 플라스미드</td><td>애드진&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector 플라스미드</td><td>애드진&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 퓨로마이신 플라스미드</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB 플라스미드</td><td>애드겐&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco 31985070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads</td><td>Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>피어스 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 미니 정제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>유전성 항생제(G418 황산염)(50mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo 연구</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>퀵로드 퍼플 2-Log DNA 사다리</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

증강 기능 다중 crispr 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

여러 강화 종종 주어진된 유전자 조절 아직 대부분 유전자에 대 한 그것은 불분명 남아 있는 강화 유전자 발현에 대 한 필요 하 고 어떻게 이러한 강화 결합 transcriptional 응답. 강화의 수백만 확인 되었습니다로 높은 처리량 도구 게놈 넓은 규모로 증강 기능 확인 필요 합니다. 증강 기능 공부에 대 한 현재 방법은 유전자 삭제 nuclease 실력 Cas9를 사용 하 여 만드는 포함 하지만 여러 연속 클론 셀 라인으로이 기술을 사용 하 여 여러 강화의 조합 효과 공부 하기 어려운 생성. 여기, 선물이 증강-i, 그들의 생 loci에서 동시에 여러 강화의 기능 심문 수 CRISPR 간섭 기반 방법. 증강 인자-i 타겟된 loci에서 히스톤 deacetylation 통해 증강 비활성화 달성 하기 위해 융합 nuclease 불충분 한 두 억압 도메인의 Cas9, SID와 리아, 사용 만든다. 이 프로토콜 가이드 대상된 지역의 일시적인 비활성화 수 있도록 RNAs의 과도 transfection를 활용 하 고 특히 조직 문화 설정에서 자극을 유도할 수 있는 transcriptional 응답을 차단에 효과적 이다. 증강 인자-i은 모두 그것의 게놈을 대상으로 글로벌 유전자 발현에 미치는 영향에 매우 구체적인. 이 프로토콜에서 얻은 결과 증강 유전자 발현, 기여, 규모와 어떻게 기여는 영향을 받는 다른 인근 강화에 기여 하 고 있는지 이해 하는 데 도움이.

그림 1 프로토콜에서 설명 하는 워크플로의 회로도 보여준다. 근처에 스 트로 겐 통제 유전자 MMP17, 칩 seq (그림 2A)에 의해 정의 된 인근 3 바인딩 사이트가 어 바운드 강화 기여 가이드 RNAs를 확인 하려면 각 지역에 대 한 설계 되었습니다. 디자인 가이드 RNAs, 시퀀스를 둘러싼 각 응급실의 600-900 bp 창 관심의 바인딩 사이트 선택 하 고 가이드 RNA 디자인 프로그램에 넣어 했다. 가이드 인 RNA 0-2 사이트는 BLAT을 사용 하 여 인간 게놈에 정렬 했다 목표 예측 시퀀스. 및 칩 seq에 의해 정의 된 영역을 스팬 RNAs 가이드 4 겹치지 DNaseI 과민 증 (그림 2B)를 대상으로 선정 됐다. 추가 시퀀스 (표 1) 다운스트림 복제 및 결과 59 뉴클레오티드 조각을 주문 했다 각 끝에 추가 되었습니다. 도착 후, 가이드 RNAs 희석 되었고 사이트, 그리고 짧은 PCR에 의해 풀링된 깁슨 조립 전에 상 동 영역을 추가 하려면 수행 되었다. 그림 2C 59 basepair의 각 끝에 시퀀스의 20 basepairs를 추가할 것입니다 "U6_internal" 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 짧은 PCR 후 예상된 가이드 RNA 제품 가이드 RNA 조각, 100 ~ basepair 시퀀스에 결과 보여줍니다. 깁슨 어셈블리에 따라 이러한 가이드 RNA 풀 박테리아로 변형 되었다 그리고 플라스 미드 minipreps 다음 날을 준비 했다. 그림 2D MMP17 근처 여러 강화 혼자 표적으로 증강 해 부 실험, 및 조합 증강-i를 사용 하 여 결과 보여줍니다. 증강-i 대상 사이트는 검은 육각형으로 표시 됩니다. 표시 된 사이트를 대상으로 하는 가이드 RNA 플라스 미드를 박탈 하는 에스트로겐 이시카와 셀 라인으로 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아 페 했다. 2 일 후, 미디어 변경 되었습니다과 puromycin transfected 세포에 대 한 풍부 하 게 추가 되었습니다. 다음 날, 셀 8 h 10 nM estradiol 치료 따르는 것을 수확 했다. RNA 격리, 고 1 단계 정량 수행 되었다. 이 예제에서 사이트 1과 2는 사이트 3 (그림 2D, 레인 ii-4)이이 조건 하에서 기여 하지 않는 하는 동안 MMP17의 완전 한 estrogenic 응답 필요 하다. 때만 2 또는 3 사이트는 활성 (vi와 vii), 에스트로겐 응답은 때 없는 사이트는 유사한 활성 (viii), 제안 하는이 사이트를 독립적으로 기여할 수 없습니다. 사이트 1 자체 (v), 일부 식을 기여할 수 있지만 가장 큰 활동은 볼 때 사이트 1 및 2 활성 (iv).
4 다른 유전자 근처 10 강화를 동시에 조작 하기 (그림 3A)의 복잡 한 풀 가이드 RNAs 42 증강 가이드 및 16 발기인 가이드 생성 된. 가이드 RNA oligos 초기 가이드 RNA 확장 PCR (단계 3.3), 전에 풀링된 했다 그리고 결과 PCR 제품 정화 깁슨 어셈블리를 사용 하 여 빈 puromycin U6 클로닝 벡터와 결합 했다. 깁슨 어셈블리에 따라 여러 개의 독립적인 변환은 수행 하 고 도금 했다. 플레이트는 파운드에 긁힌 것 이었고 2-4 h maxiprep 이전에 대 한 밖으로 성장할 수 있습니다. 그림 3B 표시 대표 감소 유전자 발현에 정량 하 여 때 이러한 가이드 RNA 풀을 한 스 트로 겐 박탈 이시카와 셀 라인으로 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아 페 (그림 2D) 위에서 설명한 대로 처리 됩니다. 증강 인자-i에서 감소는 상 상속 대상 유전자의 발기인을 대상으로 얻은 그 비슷합니다. 그림 3C RNAs 증강-i를 사용 하 여 에스트로겐 응답의 감소에 가이드의 희석의 효과 보여줍니다. 1:50 G0S2 아직도 근처 증강을 대상으로 가이드 RNA 수영장의 희석 생성 증강-i 50까지를 대상으로 사용할 수 있습니다 제안 하는 유전자 발현에 있는 뜻깊은 감소는 한 번에 사이트. 그러나, 비활성화 사이트의 수백 더 민감한 탐지 방법을 채용 하지 않는 한 동시에 대상 수 없습니다 것을 나타내는, 희석 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> 그림 1입니다. 프로토콜 증강-나를 사용 하 여 다중 증강 해 부에 대 한 도식 가이드 RNAs (빨간색과 파란색)은 e-선명 및 UCSC 게놈 브라우저를 사용 하 여 선택한 사용 하 여 설계 되었습니다. 4 명의 가이드 RNAs는 관심 (전사 인자 바인딩 사이트 칩 seq에 의해 정의 된 대로) 영역에 걸쳐 선택 됩니다. (빨간색과 파란색)의 지역별 풀링된 가이드 RNA oligonucleotides 깁슨 어셈블리 및 변환 전에 상 동 영역 (주황색)을 추가 하는 PCR를 받 다. 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아 셀 라인 또는 SID4X-dCas9-리아 플라스 미드와 함께에서 야생-타입 셀 결과 플라스 미드 풀 lipofection을 통해 페는. 가이드 RNA 플라스 미드 풀은 한 번에 또는 동시에 여러 사이트를 대상으로 한 사이트를 대상으로 개별적으로 페 수 있습니다. Transfected 세포 가이드 RNAs를 포함 하는 셀에 대 한 풍부 하는 항생제로 처리 됩니다. 에 ~ 72 h 게시물 transfection, 세포 수확. 핵 산 정량, RNA-seq, 또는 칩이 추출 될 수 있다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> 그림 2입니다. MMP17를 위한 RNA 설계 및 증강 해 부 안내. 근처 타겟 응급실 알파 바인딩된 강화 (회색)의 (A) 게놈 브라우저 화면 MMP17. 이 그림에서 칼튼, 외. 수정 되었습니다. 18. (B) 가이드 RNA 바인딩 사이트183에 대 한 설계. ER 칩 seq에 의해 정의 된에 대 한 바인딩 사이트는이 지역에 걸쳐 대상과 4 가이드 RNAs 타일입니다. 바인딩 사이트에 걸쳐 있는 DNaseI 감도 신호 가이드 RNA 디자인에 대 한 대상 시퀀스를 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다. 칩 seq와 DNaseI HS 데이터 1 헤 (C) 대표 가이드 RNA 시퀀스 깁슨 어셈블리, 상 동 영역을 추가 하는 짧은 PCR을 받은 것에 대 한 준비가 된 10 nM estradiol로 치료 시 세포에서 얻은 했다. (D) MMP17 의 상대 식 정량 특정 지역 증강-i와 8-h 10 nM estradiol 치료의 대상으로 다음을 통해 측정. 식 세포 estradiol 치료 하지 않을 MMP17 의 CTCF 및 식 수준에 상대적입니다. 제어 가이드 RNAs의 발기인 대상 IL1RN. 모든 오차 막대를 나타내는 SEM, 이중 별표 나타냅니다 p &lt; 0.01 및 단일 별표 나타냅니다 p &lt; 쌍된 t-검정에서 0.05. 이 그림에서 칼튼, 수정 된 외. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> 그림 3입니다. 증강-i. 풀링 대상 근처에 다른 유전자를 동시에 여러 강화 바인딩 사이트와 풀링된 증강-i에 타겟이 될 발기인의 (A) 회로도 (B) 이시카와 셀에 E2 치료 증강-i 플라스 미드 풀 (녹색), (파란색) 발기인-i 플라스 미드 풀 또는 제어 gRNAs (화이트)18페 후 정량 Pcr로 측정 된 식에 효과. 모든 유전자에서 중요 한 감소는 증강 i 관찰 됩니다. 이 그림에서 칼튼, 수정 된 외. 18. (C) 가이드 G0S2를 대상으로 하는 RNAs의 다른 양의 페 이시카와 셀에 G0S2 식 레벨 e 2 치료 후에 효과. 상당한 감소 가이드 RNA의 소량으로도 볼 수 있다 (1시 50분 희석), 제안 하는 최대 50 개 사이트 동시에 대상 수 있습니다. 모든 오차 막대를 나타내는 SEM, 이중 별표 나타냅니다 p &lt; 0.01 및 단일 별표 나타냅니다 p &lt; 쌍된 t-검정에서 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 가이드 RNA 확장 및 시퀀싱, 정량, 융해 단백질의 탐지 사용 한 뇌관

이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

이 방법은 인핸서(enhancer)라고도 하는 여러 유전자 조절 영역이 함께 작동하여 전사를 제어하는 방법과 같은 유전체학 및 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 조절에 관여하는 영역을 신속하게 식별하기 위해 여러 다른 유전자 근처에 있는 여러 인핸서를 동시에 테스트할 수 있다는 것입니다. 가이드 RNA 설계를 시작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 염기서열을 생성합니다.생성된 DNA 염기서열에서 E-CRISP와 같은 프로그램을 사용하여 off-target이 낮은 가이드 RNA를 찾습니다. 가이드 RNA는 프로토스페이서 인접 모티프의 상류에 있는 20개의 뉴클레오티드로 구성되며, 이는 S.pyogenes의 dCas9에 대한 NGG 형태를 취합니다. E-CRISP 웹 사이트에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 생물을 선택합니다.게놈 어셈블리는 종 이름의 오른쪽에 나타납니다. Input is FASTA sequence(입력은 FASTA 시퀀스) 라디오 버튼을 선택합니다. 위에서 FASTA 시퀀스를 복사하여 대화 상자에 붙여넣습니다.각 시퀀스에 대해 FASTA 헤더가 포함되어 있는지 확인합니다. 드롭다운 메뉴에서 중간 라디오 버튼과 단일 디자인을 선택합니다. Start single gRNA search 버튼을 클릭합니다.새 브라우저 탭이 열리고 결과가 표시됩니다. Download the candidate sequences(후보 시퀀스를 다운로드합니다) 버튼을 클릭하고, 모든 쿼리 시퀀스에 대한 Excel formulated tabular report together(모든 쿼리 시퀀스에 대한 Excel 수식 테이블 형식 보고서 다운로드) 버튼을 클릭합니다. 다음으로, UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 전체 길이 가이드 RNA 염기서열을 게놈으로 BLAT 지정합니다.브라우저에서 UCSC 게놈 브라우저 웹 사이트로 이동합니다. Our Tools(도구 도구) 섹션에서 BLAT라는 단어를 찾아 클릭합니다. BLAT 검색 도구가 열립니다.BLAT 검색 게놈 텍스트 아래에 있는 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 있는 유기체와 게놈 어셈블리를 선택합니다. E-CRISP에 의해 생성된 표 형식의 보고서에서 가이드 RNA 염기서열을 복사하여 대화 상자에 붙여넣습니다. 각 시퀀스에 고유한 FASTA 헤더가 있는지 확인한 다음 대화 상자 아래쪽에 있는 제출을 클릭합니다.BLAT 검색 결과 페이지에서 각 가이드 RNA 염기서열의 정렬이 나타나며 각 줄은 정렬을 나타냅니다. 이상적으로는 각 가이드 RNA에 대해 하나의 정렬이 있어야 하며, 이는 해당 가이드 RNA의 고유성을 나타냅니다. 가능하면 게놈의 여러 위치에 매핑되는 가이드를 피합니다.관심 영역 내에서 가이드 RNA 국소화 및 분포를 검사하려면 쿼리된 가이드 RNA 중 하나에 대한 Actions 섹션 아래의 브라우저 링크를 클릭하십시오. 게놈 브라우저가 나타나고 선택한 가이드 RNA의 중앙에 배치됩니다. 페이지 상단의 zoom out 버튼을 사용하여 관심 영역 내에서 E-CRISP로 식별된 다른 guide RNA의 분포를 시각화합니다.관심 영역 전체에 분포되어 있는 4개, 바람직하게는 비중첩, 가이드 RNA를 선택합니다. 관심 영역이 600개의 염기쌍을 초과하는 경우 1-2개의 추가 가이드를 추가하는 것이 좋습니다. 호모폴리머 스트레치(homopolymeric stretch)와 극단적인 GC 함량을 가진 가이드 RNA는 가이드 RNA 클로닝 프로세스를 방해하고 가이드 RNA 표적화 효율성을 감소시킬 수 있으므로 이러한 특징을 피하십시오.초순수에서 100 마이크로몰의 최종 농도에서 가이드 RNA 올리고를 재구성합니다. 각 관심 영역에 대해 최소 4개의 개별 가이드 RNA 올리고가 있어야 합니다. 관심 있는 각 규제 영역에 대해 관심 영역에 해당하는 모든 올리고의 풀을 생성합니다.Eppendorf tube에 각 부위에 대해 5마이크로리터의 각 재구성 가이드 RNA 올리고를 결합합니다. 와류로 수영장을 잘 섞은 다음 1 마이크로 리터를 제거하고이 eloquat 1-200을 초순수에 희석하십시오. USICS 프라이머로 짧은 PCR을 수행하여 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 올리고에 상동성 영역을 부착합니다.각 올리고에 약 40개의 염기가 추가되어 양쪽 끝의 USIC 스펙터에 대한 충분한 상동성을 포함하는 약 100개의 염기쌍 생성물이 생성됩니다. 다음으로 얼음 위에서 Gibson Assembly 반응을 설정합니다. 20마이크로리터 반응에서 50나노그램의 분해된 벡터와 7나노그램의 인서트를 사용합니다.또한 50나노그램의 벡터를 사용하여 분해된 벡터 전용 Gibson Assembly 반응을 설정하고 삽입물을 물로 교체합니다. Gibson Assembly 반응을 섭씨 50도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 4도에서 유지합니다. 조립된 제품을 얼음에 옮긴 후 얼음 위의 초순수에 1:4로 희석합니다.예를 들어, 5마이크로리터의 Gibson Assembly 제품을 15마이크로리터의 초순수에 첨가합니다. 다음으로, 희석된 Gibson Assembly 제품을 변형합니다. 고효율 유능한 세포를 얼음 위에 떨어뜨리고 각 변형에 대해 25마이크로리터 엘로��트를 만듭니다.여러 부위를 대상으로 하는 복잡한 풀이 필요한 경우 여러 개의 독립적인 변형을 수행할 수 있도록 충분한 세포를 다른 튜브에 떨어뜨립니다. 형질전환된 세포를 50마이크로리터의 플레이트로 만들고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 개별 부위를 대상으로 하는 풀의 미니 프렙을 위해 암피실린 또는 카르베니실린이 함유된 3-5밀리리터의 LB 육수에 세포를 직접 넣습니다.250rpm과 섭씨 37도의 진탕으로 밤새 세포를 배양합니다. 대형 라이브러리의 경우 플레이트 스크레이퍼를 사용하여 각 개별 플레이트의 모든 콜로니를 하나의 맥시 프렙으로 수집합니다. 이는 적절한 항생제와 함께 약 5ml의 LB를 15ml Falcon 튜브에 붓고 집락을 튜브에 긁어내면 촉진될 수 있습니다.transfection 전날, 세포를 30-50% 포화도의 24-well plate에 plate합니다. transfection이 중복으로 수행될 수 있도록 세포를 충분히 플레이트화하고, control guide RNA로 transfection할 well을 포함합니다. 세포 도금 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.처음 15분 동안은 5분마다 흔들어 주십시오. 다음 날, 선택한 transfection 시약의 지침에 따라 transfection을 준비합니다. Ishikawa 세포의 경우, 24-well plate의 각 well에 대해 550 nanogram의 총 플라스미드를 사용합니다.플라스미드를 무혈청 배지에서 밀리리터당 020마이크로그램의 최종 농도로 희석합니다. DNA 1마이크로그램당 3마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 사용하고, 부드럽게 와류를 일으키고, 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 최종 혼합물 25마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.1%베타-메르캅토에탄올로 충분한 양의 용해 완충액을 준비합니다. 진공 흡입기를 사용하여 매체를 흡입합니다. 동일한 부피의 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 가능한 한 많은 PBS를 제거하도록 흡인합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 300마이크로리터의 lysis BME 용액을 각 웰에 추가합니다. 용해 용액을 위아래로 8-10회 피펫팅한 후 딥 웰 플레이트 또는 얼음 위의 1.7ml Eppendorf 튜브로 옮깁니다. RNA를 즉시 추출하거나 향후 처리를 위해 섭씨 영하 80도에서 동결할 수 있습니다.가이드 RNA 설계는 MMP17 근처의 3개의 전사 인자 결합 부위에 대해 표시됩니다. 타겟 영역은 ChiP-seq에 의해 정의된 ER 알파의 결합 부위이며, 이 영역을 가로지르는 4개의 가이드 RNA가 타일링됩니다. 여기에 표시된 것은 USIC의 내부 프라이머를 사용하여 짧은 PCR 후 예상되는 가이드 RNA 생성물입니다.이 반응은 59개의 염기쌍 가이드 RNA 단편의 각 말단에 20개의 염기쌍을 추가하여 대략 100개의 염기쌍 염기서열을 생성합니다. MMP17에서 Enhancer-I 실험의 정성적 PCR 결과를 보여줍니다. Enhancer-I의 대상 사이트는 검은색 육각형으로 표시됩니다.부위 1과 2는 MMP17의 완전한 에스트로겐 반응에 필요하지만, 부위 3은 기여하지 않습니다. 사이트 1은 그 자체로 일부 표현에 기여할 수 있지만 사이트 1과 2가 활성 상태일 때 가장 큰 활동이 나타납니다. 관심 세포주에 최적화되면 이 기술을 적절하게 수행할 경우 5-7일 내에 완료할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 Enhancer-I용 가이드 RNA를 설계하고, 가이드 RNA의 복잡한 풀을 생성 및 transfection하고, transfection된 세포를 수확하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 무균 조직 배양 환경을 유지하고 RNase 및 DNase가 없는 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 ChiP-seq 및 RNA-seq와 같은 다른 방법을 사용하여 게놈 Enhancer-I의 어느 부분에 결합하는지, 전체 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 연구자들이 에피솜 리포터를 사용하는 대신 인간 게놈의 내인성 유전자 자리에서 에스트로겐 유도 유전자 조절을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 포유류 조직 배양 환경에서 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

학습하세요 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 기법으로 유전자 발현을 조절하는 증강자를 식별하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 SID4X-dCas9-KRAB 융합 단백질을 사용하여 효율적인 증강자 표적화를 가능하게 합니다.

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