증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

이 방법은 인핸서(enhancer)라고도 하는 여러 유전자 조절 영역이 함께 작동하여 전사를 제어하는 방법과 같은 유전체학 및 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 조절에 관여하는 영역을 신속하게 식별하기 위해 여러 다른 유전자 근처에 있는 여러 인핸서를 동시에 테스트할 수 있다는 것입니다. 가이드 RNA 설계를 시작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 염기서열을 생성합니다.

생성된 DNA 염기서열에서 E-CRISP와 같은 프로그램을 사용하여 off-target이 낮은 가이드 RNA를 찾습니다. 가이드 RNA는 프로토스페이서 인접 모티프의 상류에 있는 20개의 뉴클레오티드로 구성되며, 이는 S.pyogenes의 dCas9에 대한 NGG 형태를 취합니다. E-CRISP 웹 사이트에서 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 생물을 선택합니다.

게놈 어셈블리는 종 이름의 오른쪽에 나타납니다. Input is FASTA sequence(입력은 FASTA 시퀀스) 라디오 버튼을 선택합니다. 위에서 FASTA 시퀀스를 복사하여 대화 상자에 붙여넣습니다.

각 시퀀스에 대해 FASTA 헤더가 포함되어 있는지 확인합니다. 드롭다운 메뉴에서 중간 라디오 버튼과 단일 디자인을 선택합니다. Start single gRNA search 버튼을 클릭합니다.

새 브라우저 탭이 열리고 결과가 표시됩니다. Download the candidate sequences(후보 시퀀스를 다운로드합니다) 버튼을 클릭하고, 모든 쿼리 시퀀스에 대한 Excel formulated tabular report together(모든 쿼리 시퀀스에 대한 Excel 수식 테이블 형식 보고서 다운로드) 버튼을 클릭합니다. 다음으로, UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 전체 길이 가이드 RNA 염기서열을 게놈으로 BLAT 지정합니다.

브라우저에서 UCSC 게놈 브라우저 웹 사이트로 이동합니다. Our Tools(도구 도구) 섹션에서 BLAT라는 단어를 찾아 클릭합니다. BLAT 검색 도구가 열립니다.

BLAT 검색 게놈 텍스트 아래에 있는 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 있는 유기체와 게놈 어셈블리를 선택합니다. E-CRISP에 의해 생성된 표 형식의 보고서에서 가이드 RNA 염기서열을 복사하여 대화 상자에 붙여넣습니다. 각 시퀀스에 고유한 FASTA 헤더가 있는지 확인한 다음 대화 상자 아래쪽에 있는 제출을 클릭합니다.

BLAT 검색 결과 페이지에서 각 가이드 RNA 염기서열의 정렬이 나타나며 각 줄은 정렬을 나타냅니다. 이상적으로는 각 가이드 RNA에 대해 하나의 정렬이 있어야 하며, 이는 해당 가이드 RNA의 고유성을 나타냅니다. 가능하면 게놈의 여러 위치에 매핑되는 가이드를 피합니다.

관심 영역 내에서 가이드 RNA 국소화 및 분포를 검사하려면 쿼리된 가이드 RNA 중 하나에 대한 Actions 섹션 아래의 브라우저 링크를 클릭하십시오. 게놈 브라우저가 나타나고 선택한 가이드 RNA의 중앙에 배치됩니다. 페이지 상단의 zoom out 버튼을 사용하여 관심 영역 내에서 E-CRISP로 식별된 다른 guide RNA의 분포를 시각화합니다.

관심 영역 전체에 분포되어 있는 4개, 바람직하게는 비중첩, 가이드 RNA를 선택합니다. 관심 영역이 600개의 염기쌍을 초과하는 경우 1-2개의 추가 가이드를 추가하는 것이 좋습니다. 호모폴리머 스트레치(homopolymeric stretch)와 극단적인 GC 함량을 가진 가이드 RNA는 가이드 RNA 클로닝 프로세스를 방해하고 가이드 RNA 표적화 효율성을 감소시킬 수 있으므로 이러한 특징을 피하십시오.

초순수에서 100 마이크로몰의 최종 농도에서 가이드 RNA 올리고를 재구성합니다. 각 관심 영역에 대해 최소 4개의 개별 가이드 RNA 올리고가 있어야 합니다. 관심 있는 각 규제 영역에 대해 관심 영역에 해당하는 모든 올리고의 풀을 생성합니다.

Eppendorf tube에 각 부위에 대해 5마이크로리터의 각 재구성 가이드 RNA 올리고를 결합합니다. 와류로 수영장을 잘 섞은 다음 1 마이크로 리터를 제거하고이 eloquat 1-200을 초순수에 희석하십시오. USICS 프라이머로 짧은 PCR을 수행하여 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 올리고에 상동성 영역을 부착합니다.

각 올리고에 약 40개의 염기가 추가되어 양쪽 끝의 USIC 스펙터에 대한 충분한 상동성을 포함하는 약 100개의 염기쌍 생성물이 생성됩니다. 다음으로 얼음 위에서 Gibson Assembly 반응을 설정합니다. 20마이크로리터 반응에서 50나노그램의 분해된 벡터와 7나노그램의 인서트를 사용합니다.

또한 50나노그램의 벡터를 사용하여 분해된 벡터 전용 Gibson Assembly 반응을 설정하고 삽입물을 물로 교체합니다. Gibson Assembly 반응을 섭씨 50도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 4도에서 유지합니다. 조립된 제품을 얼음에 옮긴 후 얼음 위의 초순수에 1:4로 희석합니다.

예를 들어, 5마이크로리터의 Gibson Assembly 제품을 15마이크로리터의 초순수에 첨가합니다. 다음으로, 희석된 Gibson Assembly 제품을 변형합니다. 고효율 유능한 세포를 얼음 위에 떨어뜨리고 각 변형에 대해 25마이크로리터 엘로��트를 만듭니다.

여러 부위를 대상으로 하는 복잡한 풀이 필요한 경우 여러 개의 독립적인 변형을 수행할 수 있도록 충분한 세포를 다른 튜브에 떨어뜨립니다. 형질전환된 세포를 50마이크로리터의 플레이트로 만들고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 개별 부위를 대상으로 하는 풀의 미니 프렙을 위해 암피실린 또는 카르베니실린이 함유된 3-5밀리리터의 LB 육수에 세포를 직접 넣습니다.

250rpm과 섭씨 37도의 진탕으로 밤새 세포를 배양합니다. 대형 라이브러리의 경우 플레이트 스크레이퍼를 사용하여 각 개별 플레이트의 모든 콜로니를 하나의 맥시 프렙으로 수집합니다. 이는 적절한 항생제와 함께 약 5ml의 LB를 15ml Falcon 튜브에 붓고 집락을 튜브에 긁어내면 촉진될 수 있습니다.

transfection 전날, 세포를 30-50% 포화도의 24-well plate에 plate합니다. transfection이 중복으로 수행될 수 있도록 세포를 충분히 플레이트화하고, control guide RNA로 transfection할 well을 포함합니다. 세포 도금 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.

처음 15분 동안은 5분마다 흔들어 주십시오. 다음 날, 선택한 transfection 시약의 지침에 따라 transfection을 준비합니다. Ishikawa 세포의 경우, 24-well plate의 각 well에 대해 550 nanogram의 총 플라스미드를 사용합니다.

플라스미드를 무혈청 배지에서 밀리리터당 020마이크로그램의 최종 농도로 희석합니다. DNA 1마이크로그램당 3마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 사용하고, 부드럽게 와류를 일으키고, 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 최종 혼합물 25마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.

1%베타-메르캅토에탄올로 충분한 양의 용해 완충액을 준비합니다. 진공 흡입기를 사용하여 매체를 흡입합니다. 동일한 부피의 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 가능한 한 많은 PBS를 제거하도록 흡인합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 300마이크로리터의 lysis BME 용액을 각 웰에 추가합니다. 용해 용액을 위아래로 8-10회 피펫팅한 후 딥 웰 플레이트 또는 얼음 위의 1.7ml Eppendorf 튜브로 옮깁니다. RNA를 즉시 추출하거나 향후 처리를 위해 섭씨 영하 80도에서 동결할 수 있습니다.

가이드 RNA 설계는 MMP17 근처의 3개의 전사 인자 결합 부위에 대해 표시됩니다. 타겟 영역은 ChiP-seq에 의해 정의된 ER 알파의 결합 부위이며, 이 영역을 가로지르는 4개의 가이드 RNA가 타일링됩니다. 여기에 표시된 것은 USIC의 내부 프라이머를 사용하여 짧은 PCR 후 예상되는 가이드 RNA 생성물입니다.

이 반응은 59개의 염기쌍 가이드 RNA 단편의 각 말단에 20개의 염기쌍을 추가하여 대략 100개의 염기쌍 염기서열을 생성합니다. MMP17에서 Enhancer-I 실험의 정성적 PCR 결과를 보여줍니다. Enhancer-I의 대상 사이트는 검은색 육각형으로 표시됩니다.

부위 1과 2는 MMP17의 완전한 에스트로겐 반응에 필요하지만, 부위 3은 기여하지 않습니다. 사이트 1은 그 자체로 일부 표현에 기여할 수 있지만 사이트 1과 2가 활성 상태일 때 가장 큰 활동이 나타납니다. 관심 세포주에 최적화되면 이 기술을 적절하게 수행할 경우 5-7일 내에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 Enhancer-I용 가이드 RNA를 설계하고, 가이드 RNA의 복잡한 풀을 생성 및 transfection하고, transfection된 세포를 수확하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 무균 조직 배양 환경을 유지하고 RNase 및 DNase가 없는 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 ChiP-seq 및 RNA-seq와 같은 다른 방법을 사용하여 게놈 Enhancer-I의 어느 부분에 결합하는지, 전체 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 연구자들이 에피솜 리포터를 사용하는 대신 인간 게놈의 내인성 유전자 자리에서 에스트로겐 유도 유전자 조절을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 포유류 조직 배양 환경에서 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.