모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제
August 7th, 2018
모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.
이 방법은 모기 종이 특정 바이러스에 대한 유능한 매개체인지 여부와 같은 모기 매개 질병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 쥐와 같은 실험실 동물을 사용하지 않고도 많은 양의 모기를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 연습을 통해서만 습득할 수 있는 소근육 운동 기술이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 기술의 시각적 시연은 핵심 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 그들은 모기와 바이러스를 다루는 경험과 소근육 운동 기술이 필요합니다. 시작하려면 바이러스 재고를 희석합니다. 그런 다음 만료된 인간 혈액을 과당, 여과된 소 혈청 및 바이러스 스톡과 혼합합니다.
TCID50을 통한 추가 분석을 위해 140마이크로리터의 혈액 가루 혼합물을 동결합니다. 다음으로, 플라스틱 유리병에 50마이크로리터 크기의 혈액 가루 혼합물 두 방울을 넣고 모기가 2시간 동안 먹이를 먹도록 합니다. 모기를 마취한 후, 완전히 충혈된 모기를 세고 과당에 적신 화장솜이 들어 있는 새 유리병으로 옮깁니다.
그런 다음 모기를 섭씨 27도, 습도 80%로 14일 또는 21일 동안 유지한다. 과당이 포화된 화장솜에 72시간마다 1.5ml의 과당을 보충하십시오. 먼저, 성장배지를 보충한 96웰 플레이트에 웰당 20, 000개의 Vero 세포를 파딩합니다.
타액 분비 장치를 준비하려면 사각 유리판을 30도 각도로 벤치에 놓습니다. 그런 다음 유리판 상단에 양면 테이프를 붙입니다. 다음으로 모델링 점토를 직경 0.5cm가 될 때까지 굴려 양면 테이프에서 1cm 떨어진 접시에 수평으로 부착합니다.
필요한 수의 10마이크로리터 필터 팁에서 팁을 잘라내고 각 팁을 10마이크로리터의 PBS로 채웁니다. 그런 다음 모델링 점토에 팁을 놓고 부드러운 압력으로 고정합니다. 다음으로, 모기의 다리와 날개를 제거하여 모기를 움직이지 못하게 합니다.
필터 팁 위의 테이프에 모기를 고정하십시오. 각 모기의 주둥이를 필터 팁에 부드럽게 놓습니다. 30분 후 필터 팁을 제거하고 점토와 테이프를 버립니다.
수집된 타액을 10마이크로리터의 PBS가 들어 있는 반응 튜브로 옮깁니다. 타액과 PBS를 부드럽게 혼합하고 혼합물을 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 접시를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 7일 동안 배양합니다.
광학 현미경을 사용하여 세포에 세포요법 효과가 있는지 확인합니다. 웰이 세포요법 효과에 대해 양성이 되면 피펫을 사용하여 140마이크로리터의 상층액을 수확합니다. 그런 다음 상등액을 반응관으로 옮깁니다.
다음으로, 140마이크로리터의 상등액과 560마이크로리터의 AVL 완충액을 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로 560마이크로리터의 에탄올을 넣고 샘플을 뒤집어 혼합합니다. 이 프로토콜을 사용하여 여러 모기 종을 대상으로 다양한 기후 조건에서 지카 바이러스 감염 및 전파를 테스트했습니다.
섭씨 27도의 배양 조건에서 모든 흰줄숲모기 종은 지카 바이러스 양성 타액을 나타냈다. 반대로, Culex 분류군의 타액 샘플에는 바이러스의 증거가 포함되어 있지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간에 50마리의 모기에 대해 수행할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 강제 타액 분비 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 감염된 모기와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 실험을 수행하는 동안 항상 BSA-3 조건에서 모기를 다루기 위한 특별한 안전 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
개요
이 기사는 지카 바이러스 전파를 위해 모기, 특히 아시아 대모기와 다양한 큐렉스 종류의 벡터 능력을 분석하는 방법에 대해 논의합니다. 강제 타액 분비 기술을 사용하면 실험용 동물을 사용하지 않고 여러 모기를 동시에 분석할 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 벡터 생물학
- 바이러스학
- 모기에 의한 질병
배경
- 벡터 능력을 이해하는 것은 모기에 의한 바이러스를 통제하는 데 중요합니다.
- 강제 타액 분비는 모기의 전파 가능성을 평가하는 새로운 방법입니다.
- 이전 방법은 종종 실험용 동물이 필요했으며, 이 기술은 그 사용을 배제하는 것을 목표로 합니다.
- 정밀 운동 능력은 이 방법에 필수적이며, 연습과 경험이 필요합니다.
연구 목적
- 지카 바이러스에 대한 다양한 모기 종류의 벡터 능력을 평가합니다.
- 모기 타액의 고처리량 분석을 가능하게 하는 방법을 시연합니다.
- 이 기술을 처음 사용하는 연구자들을 위한 시각적 가이드를 제공합니다.
사용된 방법
- 모기 먹이를 위한 혈액 혼합물의 준비.
- 모기의 타액을 수집하기 위한 강제 타액 분비 기술.
- 지카 바이러스의 존재를 평가하기 위한 세포 배양 방법.
- 세포병리 효과를 위한 시료의 배양 및 분석.
주요 결과
- 아시아 대모기 종은 통제된 조건에서 지카 바이러스에 대해 긍정적인 타액을 보였습니다.
- 큐렉스 종은 그들의 타액에 지카 바이러스의 증거를 보이지 않았습니다.
- 이 방법은 마스터한 후 한 시간에 최대 50마리의 모기를 시험할 수 있습니다.
- 시각적 시연은 이 기술을 배우는 데 크게 도움이 됩니다.
결론
- 강제 타액 분비는 모기에 의한 바이러스 전파를 연구하는 효과적인 방법입니다.
- 기술의 성공적인 실행을 위해서는 훈련과 연습이 필수적입니다.
- 감염된 모기를 취급할 때는 안전 조치를 준수해야 합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
