모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제
2018년 8월 7일
모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.
이 방법은 모기 종이 특정 바이러스에 대한 유능한 매개체인지 여부와 같은 모기 매개 질병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 쥐와 같은 실험실 동물을 사용하지 않고도 많은 양의 모기를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 연습을 통해서만 습득할 수 있는 소근육 운동 기술이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 기술의 시각적 시연은 핵심 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 그들은 모기와 바이러스를 다루는 경험과 소근육 운동 기술이 필요합니다. 시작하려면 바이러스 재고를 희석합니다. 그런 다음 만료된 인간 혈액을 과당, 여과된 소 혈청 및 바이러스 스톡과 혼합합니다.
TCID50을 통한 추가 분석을 위해 140마이크로리터의 혈액 가루 혼합물을 동결합니다. 다음으로, 플라스틱 유리병에 50마이크로리터 크기의 혈액 가루 혼합물 두 방울을 넣고 모기가 2시간 동안 먹이를 먹도록 합니다. 모기를 마취한 후, 완전히 충혈된 모기를 세고 과당에 적신 화장솜이 들어 있는 새 유리병으로 옮깁니다.
그런 다음 모기를 섭씨 27도, 습도 80%로 14일 또는 21일 동안 유지한다. 과당이 포화된 화장솜에 72시간마다 1.5ml의 과당을 보충하십시오. 먼저, 성장배지를 보충한 96웰 플레이트에 웰당 20, 000개의 Vero 세포를 파딩합니다.
타액 분비 장치를 준비하려면 사각 유리판을 30도 각도로 벤치에 놓습니다. 그런 다음 유리판 상단에 양면 테이프를 붙입니다. 다음으로 모델링 점토를 직경 0.5cm가 될 때까지 굴려 양면 테이프에서 1cm 떨어진 접시에 수평으로 부착합니다.
필요한 수의 10마이크로리터 필터 팁에서 팁을 잘라내고 각 팁을 10마이크로리터의 PBS로 채웁니다. 그런 다음 모델링 점토에 팁을 놓고 부드러운 압력으로 고정합니다. 다음으로, 모기의 다리와 날개를 제거하여 모기를 움직이지 못하게 합니다.
필터 팁 위의 테이프에 모기를 고정하십시오. 각 모기의 주둥이를 필터 팁에 부드럽게 놓습니다. 30분 후 필터 팁을 제거하고 점토와 테이프를 버립니다.
수집된 타액을 10마이크로리터의 PBS가 들어 있는 반응 튜브로 옮깁니다. 타액과 PBS를 부드럽게 혼합하고 혼합물을 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 접시를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 7일 동안 배양합니다.
광학 현미경을 사용하여 세포에 세포요법 효과가 있는지 확인합니다. 웰이 세포요법 효과에 대해 양성이 되면 피펫을 사용하여 140마이크로리터의 상층액을 수확합니다. 그런 다음 상등액을 반응관으로 옮깁니다.
다음으로, 140마이크로리터의 상등액과 560마이크로리터의 AVL 완충액을 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로 560마이크로리터의 에탄올을 넣고 샘플을 뒤집어 혼합합니다. 이 프로토콜을 사용하여 여러 모기 종을 대상으로 다양한 기후 조건에서 지카 바이러스 감염 및 전파를 테스트했습니다.
섭씨 27도의 배양 조건에서 모든 흰줄숲모기 종은 지카 바이러스 양성 타액을 나타냈다. 반대로, Culex 분류군의 타액 샘플에는 바이러스의 증거가 포함되어 있지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간에 50마리의 모기에 대해 수행할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 강제 타액 분비 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 감염된 모기와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 실험을 수행하는 동안 항상 BSA-3 조건에서 모기를 다루기 위한 특별한 안전 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
개요
본 논문은 지카 바이러스 전파에 대한 모기, 특히 Aedes albopictus 및 다양한 Culex 분류군의 벡터 능력을 분석하는 방법에 대해 다룹니다. 강제 타액 분비 기술을 통해 실험 동물을 사용하지 않고도 여러 마리의 모기를 동시에 분석할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 매개체 생물학
- 바이러스학
- 모기 매개 질환
배경
- 매개체 역량을 이해하는 것은 모기 매개 바이러스를 제어하는 데 매우 중요합니다.
- 강제 타액 분비법은 모기의 전파 잠재력을 평가하기 위한 새로운 방법입니다.
- 기존 방법들은 흔히 실험 동물을 필요로 했으나, 본 기술은 이를 제거하는 것을 목표로 합니다.
- 이 방법에는 정교한 운동 능력이 필수적이므로 연습과 경험이 필요합니다.
연구 목적
- 지카 바이러스에 대한 서로 다른 모기 종의 매개 능력을 평가합니다.
- 모기 타액의 고처리량 분석이 가능한 방법을 시연합니다.
- 해당 기술을 처음 접하는 연구자들에게 시각적 가이드를 제공합니다.
사용된 방법
- 모기 급여를 위한 혈액식 혼합물 준비.
- 모기로부터 타액을 수집하기 위한 강제 타액 분비 기술.
- 지카 바이러스의 존재 여부를 평가하기 위한 세포 배양 방법.
- 세포병성 효과 분석을 위한 시료 배양 및 분석.
주요 결과
- 제어된 조건 하에서 Aedes 종의 타액에서 지카 바이러스 양성 반응이 나타났습니다.
- Culex 분류군에서는 타액 내 지카 바이러스의 증거가 나타나지 않았습니다.
- 이 방법은 숙달되면 한 시간 내에 최대 50마리의 모기를 검사할 수 있습니다.
- 시각적 시연은 기술 습득에 큰 도움이 됩니다.
결론
- 강제 타액 분비 유도는 모기 매개 바이러스 전파를 연구하는 데 효과적인 방법입니다.
- 이 기술을 성공적으로 구현하기 위해서는 훈련과 연습이 필수적입니다.
- 감염된 모기를 다룰 때는 안전 수칙을 반드시 준수해야 합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
강제 타액 분비 분석법은 동물 모델 없이도 모기의 매개 능력을 고속으로 평가할 수 있게 하여, 항바이러스제 발굴의 초기 단계에서 타겟 검증을 지원합니다. 이 방법은 개별 곤충으로부터 복제가 가능한 바이러스를 정량적으로 검출함으로써, 아르보바이러스에 대한 예방 또는 치료 후보 물질의 진행 여부(go/no-go) 결정을 돕습니다. 또한, 확장성과 재현성이 뛰어나 전임상 단계에서 전파 차단 중재법의 리스크를 줄이는 데 있어 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 개별 질병 매개체의 바이러스 전파 가능성을 측정하여 치료 가설을 검증합니다.
- 운용적 가치: 통제된 조건에서 매개체 적합성을 직접 평가함으로써 표적의 생물학적 리스크 제거를 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 적합하지 않은 매개체 종을 식별하여 포트폴리오 우선순위 결정을 지원하며, 아르보바이러스 프로그램의 위양성 리드 가능성을 줄여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 벡터 모델에서 바이러스 감수성을 확인함으로써 하위 항바이러스 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 운영적 가치: 타액 수집 및 바이러스 검출 과정을 표준화하여, 대규모 모기 집단 전체에서 재현 가능한 정량적 결과물을 보장합니다.
- 확장성: 전파 차단 화합물 또는 백신에 대한 고속 대량 평가를 위해 플랫폼의 재사용을 용이하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 역학적으로 유의미한 온도(18–27°C)에서 매개체 감염 능력을 테스트함으로써 질병 관련 시스템과 일치시킵니다.
- 운영적 가치: 일관된 타액 기반 바이러스 판독을 통해 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 보장합니다.
- 리스크 완화: 선도 후보 물질에 대해 온도 의존적 전파 임계값을 설정함으로써 추진 결정에 필요한 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
강제 타액 분비법은 타겟 검증부터 리드 물질 발굴, 그리고 전임상 평가에 이르는 발견 연속 과정에 적합하며, 특히 아르보바이러스 대상 중재 연구에 유용합니다.
- 발견 생물학: 모기 타액 내 바이러스 존재량을 전파 가능성의 기능적 판독값으로 정량화함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 타액 수집 및 Vero 세포에서의 TCID50 동등 바이러스 검출을 통해 분석 준비도와 재현성을 제공합니다.
- 분석: 정량적 종속 변수 측정값(타액 내 바이러스 역가)을 생성하여 종, 균주 및 환경 조건 간의 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 야외 환경과 유사한 전파 창을 반영하는 온도 계층화 전파 데이터를 통해 전임상 연속성과 연결됩니다.
- 기업적 재사용: 재최적화 없이 다양한 매개체 종에 걸쳐 여러 아르보바이러스(예: ZIKV, DENV, CHIKV)를 스크리닝할 수 있는 재사용 가능한 역량으로 기능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 표적 검증에 대한 예측 신뢰도 향상, 전파 생물학의 기전적 모호성 감소.
- 운영적 가치: 곤충학 및 바이러스학 팀 간의 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 더 나은 go/no-go 결정, 자본 효율성 증대 및 항바이러스 프로그램의 후기 단계 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 경험적 매개체 역량 데이터를 기반으로 한 리스크 조정 우선순위 지정 및 추진 결정.
실행 시 고려 사항
- BSL-3 격리 시설 내에서의 모기 취급, 바이러스학 및 미세 수술 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 타액 분비 장치, 정밀 습도 제어가 가능한 배양기, 세포병변효과(cytopathic effect) 점수 산출을 위한 현미경 등 전문 장비가 필요합니다.
- 흡혈 준비, 배양 일정 및 타액 수집 간격에 대한 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 적응 시 고려 사항으로는 매개체 모델별 종 특이적 구강관 크기, 섭식 행동 및 타액선 형태가 있습니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 숙련도 확보를 위한 광범위한 교육의 필요성과 타액으로부터의 생존 바이러스 회수 여부에 따른 방법론적 의존성이 있습니다.
