Name: 모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 배우세요 모기의 강제 타액 분비법을 이용한 벡터 역량 분석 기술입니다. Aedes albopictus와 Culex 속 모기를 대상으로 지카바이러스 전파 능력을 평가하며, 실험동물 없이 시간당 50마리까지 고처리량 분석이 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리 감사 엘라 Weinert, 미셸 헬 름 및 우수한 기술 지원 Marlis Badusche, Culex 모기의 분석에 대 한 제시카 Börstler, 노르 베르트 베 커와 Björn Pluskota Aedes albopictus 계란과 올 리 Vapalahti에 대 한 제공에 대 한 바이러스 재고를 제공합니다. ML는 Leibniz 협회에 의해 지원 되었다 번호 보았다-2014-SGN-3을 부여 합니다.

1. 준비 여성 모기
<ol><li>흡 인기 (큰 감 금 소 당 약 400 모기)를 사용 하 여 큰 케이지에서 모기를 수집 합니다.</li>
	<li>7에 대 한 이산화탄소 (CO2)와 모기 anesthetize s.</li>
	<li>플라스틱 병 당 20 여성을 정렬 (Ø 50 m m × 100 mm). 참고: 모기 일어나, 다른 3 사용의 s2.
</li>
	<li>밤새 모기 굶 어.</li>
</ol>2. 인공 혈액 식사
참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>
전염 성 혈액 식사를 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 x 108 플 라크 형성 단위 (PFU)의 농도에 바이러스 주식 희석 / mL. 참고: 재고 농도 조직 문화 감염 복용량 50 방법 (TCID50)를 수행 하 여 결정 되었고 Spearman & Kärber 알고리즘10,11계산.</li>
		<li>혼합 혈액 은행에서 인간의 혈액 (혈액 보존) 만료 (에 적합 하지 않은 모기에 대 한 유용 하지만, 더 이상 인간)과 당 (8% 솔루션), 만들어지고 소 혈 청 (FBS)와 바이러스의 작업 솔루션 (인간의 혈액:과 당: FBS 만료: 작업 솔루션 = 5:3:1:1). 참고: 우리 때문에 이것이 알려진된 자연 포유동물 호스트 ZIKV의 인간의 혈액 선택.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈액 식사 혼합 TCID50 통해 추가 분석을 위해의 140 µ L를 고정 합니다.</li>
	<li>
인공 먹이 종에 따라 다른 먹이 방법을 사용 하 여 수행.
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: 막 먹이 30 분 (1 mL 당 급지대) 시스템을 사용 하 여.</li>
		<li>
Culex 종: 밤새 면 스틱을 통해 감염 혈액을 제공 하 고 피 (병 당 300 µ L) 따뜻한 하지 않습니다.</li>
		<li>
Aedes albopictus: 플라스틱 유리병으로 혈액 식사 혼합의 두 방울 (50 µ L 각)을 넣어 고 모기 2 h에 대 한 피드. 혈액 따뜻한 하지 않습니다. 참고: 모기는 첫번째 15 분에 공급 합니다. 연장된 보육 시간은 안전 상의 이유로 인해 필요 합니다. 혈액 방울 2 h, 따라서 오염 위험의 정렬 하는 동안 감소 된다 모기 먹이 후 배수는 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>7 공동2 모기 anesthetize s. 참고: 경우 모기 일어나 사용 하 여 다른 3 CO2의 s.</li>
	<li>정렬 및 카운트 완전히 부풀어 오른 모기 새로운 유리병에.</li>
	<li>면 패드, 유리병 및 플러그 사이 (8% 솔루션)과 포화 상태를 추가 합니다.</li>
	<li>14 또는 21 일 동안 18 ° C 또는 80%의 습도에서 27 ° C의 지정 된 온도에서 모기를 유지.</li>
	<li>과 포화 목화 패드와 함께 모기를 피드. 모든 72 h 1.5 mL 유리병 당과 당 (8% 솔루션)의 보충 (20 모기까지 먹이 따라 속도, 단계 2.5 참조).</li>
</ol>3. 강제 14 또는 21 일에 타 액 분 비 분석 실험
참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>2 × 104 Vero 세포 씨앗/는 96에 잘 당 잘 성장 매체 (Dulbecco´s 수정이 글 중간 (DMEM) 3 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 5 µ g/mL 암포 B, 2 mM L-글루타민 보충의 200 µ L 플레이트 1% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1% 나트륨 pyruvate).</li>
	<li>
타 액 분 비 장치를 준비:
	<ol>
<li>30 °의 각에서 벤치에 제곱된 유리 접시 (20 × 20 cm)를 배치 합니다. 참고:이 안전 실험실에서 underpressure 때문. 접시는 수평 또는 수직, 액체 누출 됩니다.</li>
		<li>이중 양면된 접착 테이프는 유리 접시 위에 놓습니다.</li>
		<li>역할까지 모델링 점토 0.5 cm의 직경을 도달 하 고 가로 1cm 양면 접착 테이프에서 연결.</li>
		<li>10 µ L 필터 팁의 팁의 첫 번째 0.3 cm을 잘라. 참고: biosafety 실험실 외부 실험을 시작 하기 전에 이것을 준비 합시다.</li>
		<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4)의 10 µ L로 필터 팁을 채우십시오.</li>
		<li>스티커 테이프 쪽으로 팁 모델링 점토에 필터 팁을 놓습니다.</li>
		<li>부드러운 압력으로 필터 팁 보안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모기를 준비:
	<ol>
<li>CO2모기 anesthetize</li>
		<li>다리와 날개 무력화 모기를 제거 합니다.</li>
		<li>필터 팁 위에 스티커 테이프에 생활 모기 시체를 수정 합니다.</li>
		<li>장소 필터 팁으로 부드럽게 코입니다.</li>
		<li>30 분에 대 한 타 액 분 비 분석 실험을 실행 합니다.</li>
		<li>필터 팁을 제거 하 고 점토와 테이프 폐기.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 타 액의 처리
참고: 단계 4.1-4.6.2 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>PBS의 10 µ L을 포함 하는 반응 튜브에 내용을 추방.</li>
	<li>부드럽게 혼합 하 고 사용 하 여 샘플 당 하나 잘 준비 96 잘 접시의 우물으로 콘텐츠를 전송.</li>
	<li>5% CO2와 37 ° C에서 7 일 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>Cytopathic 효과 (CPE)의 존재에 대 한 셀을 확인 하는 쌍안경을 사용 합니다.</li>
	<li>잘 CPE에 대 한 긍정적인 경우에, RNA 추출에 대 한 반응 관에는 상쾌한 pipetting 140 µ L에 의해 수확.</li>
	<li>
RNA 추출 키트를 사용 하 여 RNA를 정화.
	<ol>
<li>AVL의 560 µ L로는 상쾌한의 믹스 140 µ L (바이러스 성 세포의 용 해 버퍼)를 버퍼링 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
		<li>에탄올 (96%)와 소용돌이 샘플의 560 µ L를 추가 합니다. 참고: 샘플이이 단계 후 비활성화 하 고 BSL-3 실험실에서 출력 될 수 있습니다.</li>
		<li>피펫으로 630 µ L 열에 1 분 동안 6000 x g으로 원심 분리기 샘플의.</li>
		<li>여과 액을 피펫으로 열에 나머지 630 µ L 삭제 하 고는 원심 분리를 반복 합니다.</li>
		<li>RNA를 세척, 6000 x g 1 분에서 버퍼 1 열 및 분리기 세척의 500 µ L을 추가 하 여 열의 막에 바인딩된.</li>
		<li>컬렉션 튜브를 버리고 고 열 새로운 컬렉션 튜브를 합니다. 12500 x g 3 분 동안에 500 µ L 세척 버퍼 2와 원심 분리기를 추가 합니다.</li>
		<li>컬렉션 튜브를 버리고 고 열 1.5 mL 반응 관 합니다.</li>
		<li>차입 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
		<li>1 분 동안 6000 x g 에서 centrifuge 고 열을 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실시간 정량 Pcr을 통해 ZIKV RNA에 대 한 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>5. 모기 시체의 처리
참고: 단계 5.1-5.5 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>모기의 시체를 제거 하 고 각 신체 반응 관에 배치. 참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는</li>
	<li>반응 관에 균질 미디어 (어떤 supplementals 없이 DMEM)의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>손 모터 믹서를 사용 하 여 본문을 균질 하 고 모든 샘플에 대 한 새로운 암 꽃 술을 사용 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시 정화에 대 한에 homogenate의 200 µ L를 추가 합니다. 참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는</li>
	<li>60 분 60 ° c.에 외피에 의해 접시를 비활성화</li>
	<li>자동화 된 핵 산 정화 하 여 RNA를 정화. 참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는</li>
</ol>6입니다. 분석
<ol><li>실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 바이러스 성 RNA 복사본 계량. 참고: RNA 복사본에는 모든 ZIKV 양성 모기 시체와 ZIKV 부정적인 모기를 포함 하지 않고 평균 했다.</li>
	<li>IR, ZIKV 양성 모기 시체 수가 먹이 여성 당 수로 정의 계산 합니다.</li>
	<li>TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수를 계산 합니다. 전송 속도 없음 ZIKV 양성 기관과 종 온도 조합에 대 한 계산 되지 않을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region">http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region</a> (2016).</li>
<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
<li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li>
<li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+selected+African+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29+species+for+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li>
<li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li>
<li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+salivation+and+virus+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li>
<li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li>
<li>Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Eurovsurveillance%22%5BJournal%5D)">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li>
<li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124653306500038">Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual</a>. , (1996).</li>
<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
<li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites & Vectors. 8, 463(2015).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeger-Lucarelli%2C+J+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22">PLOS Neglected Tropical Diseases</a>. Turell, M. J. 10 (10), (2016).</li>
<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그것은 이전 강제 타 액 분 비와 함께 얻은 결과 고전 다시 먹이 실험6라인 표시 되었습니다. 그러나, 다시 실험을 먹이 강제 타 액 분 비의 우리의 제시 방법에서, 직접 타 액 분 비 활동 증거 또는 타 액의 릴리스를 모니터링 수는 없습니다. 증명 하기 위해 타 액 분 비 활동, 샘플 시험 될 수 있었다 다른 구성 요소는 타 액에 존재 하는 위해 (예., 단백질, 탄수화물, 등.). 또한, 추가 qPCRs 바이러스 성 RNA 사본의 감지를 수 있습니다. 그러나 이것은,, 셀 문화 분석 결과 매우 낮은 입자 번호 경우에 민감도 제한할 수 있습니다 다양 한 분석에 대 한 타 액 샘플의 분할 필요 합니다. 차례 차례로,이 과소 결정된 전송 속도의 발생할 수 있습니다.
재현 가능한 결과 위해 그것은 모든 모기는 실험의 끝까지 살아 남기 위해 필요한입니다. 이것은 시각적으로 모기의 몸 운동 활동을 모니터링 하 여 제어 됩니다. 또한, 주어진된 모기 종에 대 한 타 액 분 비 분석 실험의 원리 사용 제어 바이러스,이 특정 모기 종에 의해 전송 될 알려진 먹이로 테스트할 수 있다. 반대로, 실험에 도입 하는 모든 바이러스 감염 모기에서 테스트할 수 있다.
강제 타 액 분 비 분석 실험은 많은 이점이 있다. 모기의 높은 숫자를 동시에 제어 표준화 된 조건 하에서 기본 단일 표본에 동물 복지 규정9와 충돌 하지 않고 테스트할 수 있습니다.
메서드는 여러 실험실에 의해 사용 됩니다. 그러나, 정확한 설정을 달라질 수 있습니다, 실험실 사이 결과에 차이를 낼 수 있는. 하나의 중요 한 구성 요소는 유리14 또는 플라스틱15의 만들 수 있는 타 액을 수집 하는 모 세관. Biosafety 수준 3 insectary의 높은 안전 규정을 준수, 우리 플라스틱 필터 팁 대신 사용 유리 모 세관, 상해의 위험 감소. 또한, 필터 팁을 수집된 액체 쉽게 옮겨질 수는 피 펫을 사용 하 여 하는 이점이 있다.
여기에 제시 된 강제 타 액 분 비 분석 실험의 설치 두 조사 협력 및 업무 공유를 기반으로 합니다. 모기의 demobilizing 다른 동시에 강제 타 액 분 비 설치를 준비 하는 동안 한 사람에 의해 수행 됩니다. 이 크게 처리 시간을 단축 하 고 위험을 최소화 샘플의 철거 작업 환경 및 타 액 분 비 판 사이 변경으로 전환 필요 하지 않습니다. 또한, 제 대 직후 강제 타 액 분 비 장치에 모기를 배치 하는 수 있습니다. 처리 시간이 오히려 짧은 모기 성공적인 강제 타 액 분 비에 필수적 이다. 마지막으로, 모기는 모든 실험을 통해 운동에 대 한 직접 모니터링할 수 있습니다.
여기에 제시 된 타 액 분 비 분석 결과 모기 종의 벡터 잠재력에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 몇 가지 구체적인 질문에 대답 (예., 척추 동물을 감염 하는 데 필요한 모기 물린의 숫자), 동물 실험 필요 수.

2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV), 가족 Flaviviridae, 콜롬비아와 브라질에서 등장 하 고 주목할 만한 수의 전염병을 일으키는 아메리카 및 카리브 해, 급속 하 게 확산에 속하는 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus) 관련 임상 케이스 microcephaly의 Guillain-바레 증후군1. 종의 Aedes aegypti , Aedes albopictus 모기 ZIKV2, 기본 및 보조 벡터 간주 됩니다 하지만 다른 종의 속 Aedes 또한 실험 벡터 능력3 입증 . Aedes 종 달리 Culex 종 지금까지 테스트의 대부분은 바이러스4전송 수 없습니다. 단지, Culex quinquefasciatus 에 대 한 데이터 제공 불확실 결과3. 현재, 정보 부족 한 모기 벡터 적성에 ZIKV에 대 한 온건한 온도 조건 하에서 (< 20 ° C). 그러나,이 정보는 중앙 유럽 등 온대 기후 지역에 가능한 퍼짐의 위험 평가 대 한 상당한.
ZIKV에 대 한 유능한 벡터는 취득 하 고, 유지 하 고, 증폭 하 고 마지막으로 바이러스를 전송 수 있습니다. 따라서, 테스트 모기 시체 또는 시체의 부분, 다리, midgut, 머리 또는 침 샘를 포함 하 여 ZIKV에 대 한 충분 하지 않습니다 벡터 역량을 확인 하. 그것은 출시 된 타 액 내 감염 성 바이러스 입자에 대 한 테스트 필수입니다. 벡터 역량 평가, 감염 율 (IR, 부풀어 오른된 모기의 수 ZIKV 양성 모기 시체의 수)와 전송 속도 (TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수), 될 필요가 확인 했습니다. 모기의 국세청은 단순히 균질 화 모기는 역전사 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량)에 의해 다음에 의해 쉽게 분석 될 수 있다 ZIKV를 대상으로. 또한, 감염 모기 당 바이러스 복사본 번호를 확인 하 여 추가 특징 될 수 있습니다. 대조적으로, 전송 속도의 분석 개별 모기의 타 액에 있는 가능한 바이러스 입자의 검출에 의존합니다. 이 호스트5에 니의 분석 이어서 취약 호스트 동물에 감염 된 모기의 먹이로 달성 될 수 있다. 그러나,이 방법은 적당 한 모델 생물에 의존 하며 비용과 동물 복지 규정에 의해 제한 된. 전송 속도 분석 하기 위한 실험 동물의 사용을 방지 하 고 비용을 줄이기 위해 다시 먹이 시스템 인공 혈액 작은 물방울 되어를 사용 하 여 설명6. 그러나, 개인의 높은 숫자와 함께 개별 규모 테스트는 어렵고입니다. 개별 규모에 타 액 분 비 분석 결과의 첫 번째 설명 19667 에 출판 되었음 및 최근 몇 년 동안 강제 타 액 분 비 실험 방법의 선택 모기3,8의 벡터 역량을 평가 하 되 .
따라 중앙 유럽의 우리의 벡터 능력 연구에 모기 최근에 출판 된9, 앤더슨 외에서 보고 우리 강제 타 액 분 비를 설명. 몇 가지 수정 8 . 이 메서드는 표준화 하는 높은 처리량 높은 biosafety 수준 조건 (BSL-3)에서 실험 및 세포 기반 문화 분석 실험에 의해 활성 바이러스의 식별을 포함 수 있습니다. 여기에 설명 된 실험 856 모기를 포함 한다. 그들은 인공 혈액 식사에 의해 ZIKV에 감염 되었고 그 후 타 액에서 감염 성 바이러스 입자의 존재에 대 한 분석. 필드와 Ae aegypti 와 Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus)의 실험 구성 두 개의 오래 된 실험실 인구에 모기 잡은 Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx torrentium)와 두 개의 Ae albopictus 인구. 이탈리아에서 수집 된, 두 개의 Ae albopictus 인구 중 하나를 제외한 모든 모기 독일에서 수집 했다.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 곤충 사육 케이지</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초파리 재배 튜브</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>모기용 플라스틱 바이알</td></tr><tr>초<td>파리 재배 튜브용 플러그</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>일정한 기후 챔버</td><td>바인더</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>혈액</td><td></td><td></td><td>저장 인간 혈액, 만료, 의료용으로 사용할 수 없음</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플래시 광 흡인기</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>양면 접착 테이프</td><td></td><td></td><td>특정 공급업체 없음</td></tr><tr><td>Gammex 파우더 프리 장갑 AMT</td><td>Ansell</td><td></td>, <td>BSL3 실험실에서 찔린 것으로 작업하는 동안 필요한 안전상의 이유</td></tr><tr><td>RealStar Zika 바이러스 RT-PCR-Kit</td>, <td>알토나 진단</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax 병원체 RNA/DNA 키트</td><td>, Thermo fisher scientific</td>, <td>모기 시체의 4462359 RNA 분리</td><td></td></tr><tr><td>, Qiamp 바이러스 RNA Mini Kit</td>, <td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation, 상층액</td></tr><tr><td>필터 팁 (20 &Micro; L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>팁</td></tr><tr><td>핸드 모터 믹서</td><td>칼 로스</td> 매<td>진</td><td></td></tr> 마이크로 <tr><td>유봉 핸드 모터 믹서</td><td>칼 로스</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L 글루타민 페니실린/스트렙토마이신</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>과당</td><td>칼 로스</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루바트</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr> P0832100 <tr><td>Hemotek 피더</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>모델링 점토</td><td></td><td></td><td>특정 공급자 없음</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System ThermoFisher</td><td>scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aedes albopictus</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 조명</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

벡터 적성 척추 호스트 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus)를 전송 하는 모기의 잠재력으로 정의 됩니다. 가능한 바이러스 입자는 감염 된 모기의 타 액을 통해 혈액 식사 동안 전송 됩니다. 강제 타 액 분 비 분석 실험 동물 실험의 사용을 피하고 단일 모기 기초 벡터 잠재력을 결정 하실 수 있습니다. 메서드는 시간의 짧은 기간 내에 한 실험에서 모기의 많은 수를 분석 하는 적당 한. 강제 타 액 분 비 분석 실험 두 가지를 포함 하 여 독일에 갇혀 856 개별 모기를 분석 하는 데 사용 했다 Culex pipiens pipiens biotypes, 뿐만 아니라 실험적으로 감염 했다 Aedes albopictus Culex torrentium Zika 바이러스 (ZIKV)와 18 ° C에서 27 ° C 2, 3 주 동안 incubated 하 고. 결과 ZIKV에 대 한 다른 Culex taxa의 벡터 역량의 부족을 표시. 반면, Aedes albopictus 하지만 동시에 테스트 하는 Aedes aegypti 실험실 식민지와 유사한 전송 속도와 27 ° C에서 ZIKV에 취약 했다.

Aedes aegypti 알려져 있다 유능한 벡터로 ZIKV 이상 열 대 기후 조건12에서. 따라서, 우리 사용 Ae aegypti 긍정적인 컨트롤로 분석 결과 설정 하 고 국세청 27 ° C의 외피 온도 80%의 습도에서 TRs 분석. IR 및 TR 앞에서 설명한 포 외에 의해 정의 되었다. 13. 도전 Ae aegypti 각각 감염 (dpi), 게시 하는 IR 50%와 72%와 42%, 14, 21 일에 31%의 TR을 보여주었다 (그림 1A 및 1B). 그 후, 유럽 모기 ZIKV 감염 및 전송 뿐만 아니라 온화한 열 대 기후 조건을 사용 하 여 테스트 되었습니다.
27 ° C 부 화 온도에서 모든 모기 종 14 dpi 14 dpi만에서 긍정 했다 Cx. p. pipiens 및 Cx torrentium 개인을 제외 하 고 21 dpi에서 ZIKV 감염을 보였다. 모든 Aedes 종 높은 바이러스 성 RNA 농도 뿐만 아니라 높은 국세청 (사이 50% 및 72%)을 보였다 (106 109 RNA 복사본/모기 표본까지)는 0 사이 배열 하는 국세청을 밝혀 다른 Culex taxa에 비해 % 그리고 32%와 10 바이러스 부하3 104 RNA 복사본/모기 표본. 모든 Aedes 종 Culex taxa에서 타 액 샘플의 ZIKV (그림 1A 및 1B)을 포함 하는 반면 ZIKV 양성 침 (TR 13-42%), 표시. 흥미롭게도, 21 dpi에서 전송 속도 Ae aegypti 및 Ae albopictus 독일 (30%)에서 유사 했다 하지만 이탈리아에서 Ae albopictus 에 실질적으로 더 낮은 (13%) 했다.
인큐베이션 18 ° C의 적당 한 온도에 도전된 모기의 일반적으로 낮은 바이러스 로드 Aedes 종 (104– 106 RNA 복사본/모기) 뿐만 아니라 다른 Culex taxa (102-104 공개 RNA 복사본/모기). 18 ° C 부 화 온도에서 ZIKV의 전송 하지 조사 모기 종에 대 한 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> 그림 1: 전송 속도 ZIKV 실험적으로 감염 하는 모기의. 다른 모기 종에 ZIKV 가진 벡터 능력 학문의 결과. 6 다른 모기 taxa ZIKV에 감염 되었고 27 ° C 또는 18 ° C 14 (A) 또는 (B) 21 일 알을 품을. TR은 ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수로 정의 됩니다. 조사 하는 모기의 총 수는 856, 각 시간 포인트/온도/모기 taxa에 30 개인의 최소 이었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

이 방법은 모기 종이 특정 바이러스에 대한 유능한 매개체인지 여부와 같은 모기 매개 질병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 쥐와 같은 실험실 동물을 사용하지 않고도 많은 양의 모기를 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 연습을 통해서만 습득할 수 있는 소근육 운동 기술이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.이 기술의 시각적 시연은 핵심 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 그들은 모기와 바이러스를 다루는 경험과 소근육 운동 기술이 필요합니다. 시작하려면 바이러스 재고를 희석합니다. 그런 다음 만료된 인간 혈액을 과당, 여과된 소 혈청 및 바이러스 스톡과 혼합합니다.TCID50을 통한 추가 분석을 위해 140마이크로리터의 혈액 가루 혼합물을 동결합니다. 다음으로, 플라스틱 유리병에 50마이크로리터 크기의 혈액 가루 혼합물 두 방울을 넣고 모기가 2시간 동안 먹이를 먹도록 합니다. 모기를 마취한 후, 완전히 충혈된 모기를 세고 과당에 적신 화장솜이 들어 있는 새 유리병으로 옮깁니다.그런 다음 모기를 섭씨 27도, 습도 80%로 14일 또는 21일 동안 유지한다. 과당이 포화된 화장솜에 72시간마다 1.5ml의 과당을 보충하십시오. 먼저, 성장배지를 보충한 96웰 플레이트에 웰당 20, 000개의 Vero 세포를 파딩합니다.타액 분비 장치를 준비하려면 사각 유리판을 30도 각도로 벤치에 놓습니다. 그런 다음 유리판 상단에 양면 테이프를 붙입니다. 다음으로 모델링 점토를 직경 0.5cm가 될 때까지 굴려 양면 테이프에서 1cm 떨어진 접시에 수평으로 부착합니다.필요한 수의 10마이크로리터 필터 팁에서 팁을 잘라내고 각 팁을 10마이크로리터의 PBS로 채웁니다. 그런 다음 모델링 점토에 팁을 놓고 부드러운 압력으로 고정합니다. 다음으로, 모기의 다리와 날개를 제거하여 모기를 움직이지 못하게 합니다.필터 팁 위의 테이프에 모기를 고정하십시오. 각 모기의 주둥이를 필터 팁에 부드럽게 놓습니다. 30분 후 필터 팁을 제거하고 점토와 테이프를 버립니다.수집된 타액을 10마이크로리터의 PBS가 들어 있는 반응 튜브로 옮깁니다. 타액과 PBS를 부드럽게 혼합하고 혼합물을 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 접시를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 7일 동안 배양합니다.광학 현미경을 사용하여 세포에 세포요법 효과가 있는지 확인합니다. 웰이 세포요법 효과에 대해 양성이 되면 피펫을 사용하여 140마이크로리터의 상층액을 수확합니다. 그런 다음 상등액을 반응관으로 옮깁니다.다음으로, 140마이크로리터의 상등액과 560마이크로리터의 AVL 완충액을 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로 560마이크로리터의 에탄올을 넣고 샘플을 뒤집어 혼합합니다. 이 프로토콜을 사용하여 여러 모기 종을 대상으로 다양한 기후 조건에서 지카 바이러스 감염 및 전파를 테스트했습니다.섭씨 27도의 배양 조건에서 모든 흰줄숲모기 종은 지카 바이러스 양성 타액을 나타냈다. 반대로, Culex 분류군의 타액 샘플에는 바이러스의 증거가 포함되어 있지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간에 50마리의 모기에 대해 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 강제 타액 분비 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 감염된 모기와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 실험을 수행하는 동안 항상 BSA-3 조건에서 모기를 다루기 위한 특별한 안전 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

체외에서 성인 모기에 형광 기자를 표현하는 alphavirus transducing 시스템을 사용 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 대신 또는 기자 이외에 관심있는 단백질을 표현하는 적응 수 있습니다.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

이 문서는 모기 midgut 경작 미생물의 격리 및 식별, 모기 창자 박테리아의 항생제 고갈을 포함하여 개별 모기 창자 박테리아의 효력을 조사하고, 1개의 특정 박테리아 종을 재소개하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석

본 프로토콜은 인공 매체를 사용하여 피어싱 빨아 먹는 곤충으로부터 충분한 타액을 수집하는 방법을 설명합니다. 이것은 곤충 타액을 수집하고 곤충 먹이 기법과 벡터 매개 바이러스 전송에 타액 기능을 연구하기위한 편리한 방법입니다.

라오델파엑스 스트리아텔루스 타액 컬렉션을 위한 2층 멤브레인 샌드위치 방법

성인 모기 침샘 (SG)은 바이러스와 기생충을 포함하여 모든 모기 매개 병원균을 인간 숙주에게 전염시키는 데 필요합니다. 이 비디오는 애벌레 (L4) 단계 Anopheles 감비아모기에서 SGs의 효율적인 격리와 추가 분석을 위한 L4 SGs의 준비를 보여줍니다.

아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅

이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액 단백질을 검출하고 딱정벌레 벡터에 의해 방출되는 식물 바이러스 단백질을 검출하는 방법을 보여줍니다.

식물 숙주에서 딱정벌레 벡터의 바이러스 및 타액 단백질 검출

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

배우세요 모기의 강제 타액 분비법을 이용한 벡터 역량 분석 기술입니다. Aedes albopictus와 Culex 속 모기를 대상으로 지카바이러스 전파 능력을 평가하며, 실험동물 없이 시간당 50마리까지 고처리량 분석이 가능합니다.

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

더 많은 동영상 탐색