Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

알파바이러스(Alpha viruses)는 모기에 의해 전파되는 RNA 바이러스로, 감수성이 있는 모기 세포에 지속적으로 감염되며 세포 병리 현상은 최소한으로 나타납니다. 본 프로토콜은 벡터 감염 및 바이러스 전파를 검출하기 위해 형광 리포터를 발현하는 감염성 알파바이러스 도입 시스템의 유용성을 보여줍니다. 먼저 암컷 모기에게 목적 알파바이러스가 포함된 혈액식을 먹인 다음, 모기의 감염 효율을 결정하고 마커 유전자를 발현하는 모기만을 선택합니다.

다음으로, 감염된 모기에서 타액을 수집하고, 수집된 타액으로 배양된 모기 세포를 감염시켜 전염성을 입증합니다. 결과는 형광 현미경으로 확인합니다. GFP와 같은 보고 단백질을 시각화함으로써 모기의 에이티스(eighties) 또는 QE 종에 의한 매개체 감염 및 바이러스 전파를 추적합니다.

알파바이러스 발현 시스템 또는 ATS는 arbovirus 연구뿐만 아니라 모기 형질전환과 같은 더 까다로운 모기 조작을 수행하기 전에, 유전자 발현 및 벡터 모기를 신속하게 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 절차는 Dr.Ken Olson 연구실의 Dr.Irma Sanchez Vargas, Dr.Eric Mossel, 그리고 Aaron Phillips가 시연할 것입니다. Bhk 21 세포에서 TS 바이러스를 생성하려면, in vitro 전사 후 GFP 리포터를 발현하는 symbis 재조합 바이러스를 사용하고, 게놈 알파바이러스 전달 시스템 RNA를 bhk 21 세포에 전기천공하십시오.

그 다음, 감염 전 바이러스를 회수하여 증폭시킵니다. 인공 흡혈기로부터 효율적인 흡혈이 이루어질 수 있도록 기아 상태를 유도하여 모기를 준비시킵니다. 흡혈 24시간 전에는 당분을, 12시간 전에는 물을 제거합니다.

모기의 중장(midgut)에 효율적으로 감염시키기 위해, 상업적으로 구입한 제세동 또는 시트르산 처리된 동물 혈액을 준비된 세포 배양 유래 TS 바이러스 현탁액과 혼합합니다. 모기가 혈액을 충분히 섭취하도록 유도하기 위해 혈액 식사(blood meal)의 바이러스 역가를 mL당 10⁷ PFU로 조절합니다. TP를 최종 농도 0.02 M이 되도록 첨가합니다.

포어 사인(pore sign) 장막을 워터 재킷 유리 피더의 입구에 덮습니다. 그다음, 37 °C의 물이 순환하도록 피더를 설정합니다. 이어서 챔버에 먹이를 피펫으로 넣고 피더를 카톤 위에 단단히 고정합니다.

모기에게 10~30분 동안 흡혈시킨 후, 저온 마취된 모기들 중에서 흡혈이 완료된 개체들을 분류하여 선택된 모기 내에서 TS 바이러스의 복제와 전파가 일어나도록 합니다. 이를 28 °C, 상대 습도 75% 조건에서 8~10일 동안 배양합니다. 이는 모기를 고정시키기 위함입니다.

종이 지지 상자를 4 °C에서 약 15분 동안 둡니다. 이제 5~10마리의 모기를 형광 현미경 사용에 적합한 칠 테이블(chill table)로 옮깁니다. 형광의 유무에 따라 모기를 관찰하고 분류합니다.

선택된 모기들을 종이 상자로 옮겨 원하는 용도로 사용하십시오. 이 시점에서 형광 강도를 지표로 사용하여 감염 효율을 결정합니다. 마지막으로 중장, SIV 선, 지방체와 같은 조직을 해부하고 형광 발생 여부를 관찰하십시오.

원하는 경우, 이러한 장기와 조직들을 더 이른 시점에 적출할 수 있습니다. 급이 전 24시간 동안 모기의 당분 공급원을 차단하십시오. 가열하여 늘린 후 절단한 50 µL 모세관에 3~5 µL의 Cargill을 준비하십시오.

모기가 탈출하지 않도록 B형 침지유(immersion oil)를 넣습니다. 모기의 다리와 날개를 제거합니다. 이제 구강 proboscis를 튜브에 삽입합니다.

침샘관에서 침전액이 침지유 속으로 분비되는지 주의 깊게 관찰하십시오. 필요한 경우, 타액 분비를 촉진하기 위해 모기 흉부에 1% pilocarpine 한 방울을 떨어뜨리십시오. 60~90분 후 모기를 제거하여 향후 바이러스 분리를 위해 보관하십시오. 이제 모세관에서 용액을 수집하기 위해, 타액과 오일의 혼합물을 500 µL의 20% F-B-S-P-B-S 멸균액이 들어 있는 튜브에 배출하십시오.

접종액을 0.2 micron 시린지 필터로 여과한 후, 이 접종액을 사용하여 배양된 모기 세포를 감염시킵니다. five prime DS MRE 16 GFP 바이러스의 감염 효율은 GFP 발현을 통해 평가합니다. 시간이 경과함에 따라, 이 세포들은 0.01 multiplicity of infection의 농도로 바이러스에 감염되었습니다.

에피 형광 현미경(epi fluorescence microscope)을 이용하면 감염 후 10일째에 감염된 모기의 전체 모습뿐만 아니라 서로 다른 신체 부위 내의 GFP를 관찰할 수 있습니다. GFP의 장기 선택적 발현은 감염의 확산을 나타냅니다. 중장은 일반적으로 바이러스가 포함된 혈액 식사 섭취 직후에 뚜렷한 국소 감염 초점을 보이며, 감염 후 시간이 지남에 따라 후방 중장 전체로 확산됩니다.

이러한 이벤트는 GFP 및 DS RED 리포터에 의해 신호가 전달됩니다. 전파 분석 결과, five prime DS MRE 16 GFP 바이러스는 외인성 잠복기 동안 GFP를 안정적으로 발현하는 것으로 나타났습니다. 본 실험의 모기에서는 감염 후 이르면 8일째에 GFP와 모기 타액이 검출됩니다.

이 영상을 시청하고 나면, 모기에게 A TS 바이러스를 경구 감염시키는 방법, 모기의 바이러스 감염 여부를 시각적으로 평가하는 방법, 그리고 모기로부터의 바이러스 전파를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.