Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

알파 바이러스는 모기에서 태어난 RNA 바이러스로, 최소한의 세포 병리학으로 감수성이 있는 모기 세포를 지속적으로 감염시킵니다. 이 프로토콜은 매개체 감염 및 바이러스 전파를 감지하기 위해 형광 리포터를 발현하는 감염성 알파 바이러스 전달 시스템의 유용성을 보여줍니다. 먼저 암컷 모기에게 관심 알파 바이러스가 포함된 혈액 가루를 먹인 다음 모기 감염 효율을 확인하고 마커 유전자를 발현하는 모기만 선택합니다.

다음으로, 감염된 모기에서 타액을 채취하고 수집된 타액으로 배양된 모기 세포를 감염시켜 전염성을 입증합니다. epi 형광 현미경으로 얻은 결과. GFP와 같은 단백질에 대한 보고서를 시각화하여 80년대 또는 QE 모기 종에 의한 매개체 감염 및 바이러스 전파를 추적합니다.

알파 바이러스 발현 시스템(ATS)은 모기 유전자 이식 발생과 같은 어려운 모기 조작을 수행하기 전에 아르보바이러스 연구를 위해 유전자 발현 및 벡터 모기를 신속하게 평가하는 데 사용할 수 있습니다. Ken Olson 박사 실험실의 Irma Sanchez Vargas 박사, Eric Mossel 박사 및 Aaron Phillips가 이러한 절차를 시연할 것입니다. Bhk 21 세포에서 TS 바이러스를 생성하기 위해서는 시험관 내 전사 후 GFP 리포터를 발현하는 심비스 재조합 바이러스를 사용하여 게놈 알파 바이러스 형질 주입 시스템 RNA를 bhk 21 세포로 전기 평가합니다.

그런 다음 감염되기 전에 바이러스를 구하고 증폭하십시오. 식량 부족으로 인해 인공 먹이통에서 효율적인 혈액 공급을 위한 프라임 모기. 수유 24시간 전에 설탕을 제거하고 12시간 전에 물을 줍니다.

상업적으로 얻어진 제세동 또는 구연산 동물의 혈액을 제조된 세포 배양물과 혼합하여 TS 바이러스 현탁액을 유도하여 모기의 효율적인 중장 감염을 촉진하였다. 모기가 울혈하도록 자극하기 위해 혈액 가루에 대한 바이러스 역가 밀리리터당 10에서 7개의 플라크 형성 단위를 공식화합니다. 최종 농도 0.02 어금니에 TP를 추가합니다.

물 자켓 유리 공급기의 입에 모공 표시 장 막을 놓습니다. 다음으로, 섭씨 37도의 순환하는 물로 피더를 설정합니다. 그런 다음 음식을 챔버에 피펫으로 넣고 피더를 상자에 단단히 놓습니다.

10-30분 동안 모기에게 먹이를 준 후, 혈액이 충혈된 표본에 대해 냉장 마취 모기를 분류하여 선택한 모기에서 TS 바이러스의 복제 및 전파를 허용합니다. 섭씨 28도, 상대 습도 75%에서 8-10일 동안 배양합니다. 모기를 움직이지 못하게하기 위해.

종이 상자를 섭씨 4도에서 약 15분 동안 놓습니다. 이제 5-10마리의 모기를 형광 현미경에 사용할 수 있도록 조정된 냉장 테이블로 옮깁니다. 형광의 유무에 따라 모기를 검사하고 분류합니다.

선택한 모기를 종이 상자에 다시 넣어 원하는 대로 사용할 수 있습니다. 이 시점에서 형광 강도를 대용물로 사용하여 감염 효율을 결정합니다. 마지막으로 중간 창자, SIV 땀샘 및 지방체와 같은 조직을 절개하고 형광을 모니터링합니다.

이러한 장기와 조직은 원하는 경우 더 일찍 절개할 수 있습니다. 먹이를 주기 24시간 전에 모기의 설탕 공급원을 박탈하십시오. 50 마이크로 리터의 모세관 튜브를 준비하여 3-5 마이크로 리터의 Cargill로 가열하고 당겨 잘라냅니다.

모기가 탈출하지 않도록 하는 B형 이멀젼 오일. 다리와 날개를 제거하십시오. 이제 프로보를 튜브에 삽입합니다.

주둥이에서 침지 오일로 흘러나오는 타액 방울을 주의 깊게 모니터링하십시오. 필요한 경우 60-90 분 후에 타액 분비를 증가시키기 위해 모기 흉부에 1 % 필로 카르핀 한 방울을 떨어 뜨리고 모기를 제거하고 향후 바이러스 격리를 위해 보관하십시오. 이제 모세관 튜브에서 용액을 수확하려면 타액 오일 혼합물을 500마이크로리터의 20%F-B-S-P-B-S 멸균 튜브로 배출합니다.

0.2 미크론 주사기 필터를 통해 접종물을 여과한 다음 이 접종물을 사용하여 모기 세포의 배양된 세포를 감염시킵니다. 5개의 프라임 DS MRE 16 GFP 바이러스에 의한 감염의 효능은 GFP의 발현으로 평가됩니다. 시간이 지남에 따라 이러한 세포는 0.01의 감염 배수로 바이러스에 감염되었습니다.

epi 형광 현미경을 사용하면 감염된 모기뿐만 아니라 감염 후 10일 동안 이곳의 다른 신체 부위에서 GFP를 전신으로 볼 수 있습니다. GFP의 장기 선택적 발현은 전파된 감염을 나타냅니다. 중장은 일반적으로 바이러스가 포함된 혈액 식사를 섭취한 후 초기에 뚜렷한 병소 감염이 나타나며, 이 바이러스는 감염 후 나중에 후방 중장 전체로 퍼집니다.

이러한 이벤트는 GFP 및 DS RED 리포터에 의해 신호를 받습니다. 전염 분석은 5개의 프라임 DS MRE 16 GFP 바이러스가 외인성 잠복기 동안 GFP를 안정적으로 발현한다는 것을 나타냅니다. 이곳 모기에서 GFP와 모기 타액은 감염 후 8일 이내에 검출됩니다.

이 비디오를 시청한 후에는 A TS 바이러스를 모기에 구강으로 감염시키는 방법, 모기의 바이러스 감염을 육안으로 평가하는 방법, 모기의 바이러스 전파를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.