합성 및 특성 1, 2-Dithiolane의 수정 자가 조립 펩 티 드

초분자 구조의 기능을 증가시키는 구조가 성장함에 따라 1, 2-디티올란기를 자가 조립 펩타이드와 통합하는 이 방법은 초분자 표면의 반응성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 1, 2-디티올란 전구체 분자의 결합 및 탈보호가 최종 변형 펩타이드의 단일 정제 단계만으로 수지에서 발생한다는 것입니다. 어셈블리가 최종 초분자 구조로 성숙하는 데 걸리는 시간이 다양하기 때문에 초분자 어셈블리에 대한 특성화 방법과 결과를 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

디티올란 전구체를 합성하려면 먼저 섭씨 55도의 둥근 바닥 반응 플라스크에 약 4ml의 1몰 수산화나트륨에 3-브로모-2-프로프리온산 1g을 교반하면서 용해합니다. 모든 시약이 용액에 현탁되면 반응 플라스크를 격막으로 밀봉하고 플라스크를 질소 분위기 아래에 놓습니다. 다음으로, 1.49g의 티오 아세테이트 칼륨과 3 밀리리터의 2 몰 황산을 4 밀리리터의 탈 이온수에 첨가하여 현장에서 티오 아세트산을 생성합니다.

티오 아세트산 용액을 일회용 플라스틱 10 밀리리터 주사기에 흡입하고 주사기에 18 게이지 바늘을 장착 한 다음 바늘로 격막을 뚫어 혼합물을 반응 플라스크에 적가하고 섭씨 55도에서 밤새 반응을 계속합니다. 다음날 아침, 메탄올과 디클로로메탄의 혼합물을 사용하여 실리카겔 60 F254 플레이트에서 박층 크로마토그래피로 반응을 모니터링하고 브로모크레졸 녹색 염색에 의한 반응 진행을 시각화합니다. 완료된 반응이 실온으로 냉각되면 2몰 황산과의 혼합물을 pH 1로 산성화합니다.

노란색 오일은 용액에서 분리한 다음 40밀리리터의 차가운 클로로포름을 3회 첨가하여 제품을 추출하고 황산마그네슘 위에서 건조하기 위해 유기층을 결합하여 감압된 압력에서 클로로포름을 제거해야 합니다. 제품은 전체 수율이 83%인 황색 오일이어야 하며 추가 정제 없이 사용할 수 있습니다. 디티올란 전구체를 수지 펩타이드의 N-말단에 결합하려면 5밀리리터의 디메틸포름아미드에 4개의 등가물, 4개의 당량의 HBTU 및 10개의 DIPEA에 당량의 디티올란 전구체를 추가합니다.

커플링 혼합물을 실온에서 10분 동안 사전 활성화시킨 후 샘플을 N-terminus-resin-contained fritted syringe에 추가합니다. 커플링 반응을 2시간 동안 흔든 다음 새 디메틸포름아미드를 5밀리리터로 3회 세척하고 커플링 반응을 반복하고 밤새 흔듭니다. 두 번째 커플링 후 5밀리리터 디메틸포름아미드 세척 3회, 5밀리리터 디클로로메탄 수지 세척 3회로 수지를 세척하고 건조된 수지를 10밀리리터 마이크로파 반응 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 N-terminus dithiolane 전구체로부터 티오아세테이트 그룹을 보호하지 않으려면 튜브에 2ml의 디메틸포름아미드를 추가합니다. 수지가 팽창하도록 하고 용기에 작은 자기 교반 막대를 추가하고 저속 자기 교반으로 수지를 다시 현탁시킵니다. 15분 후 튜브에 2ml의 농축 수산화암모늄을 넣고 반응 용기를 실리콘 격막으로 덮고 용기를 마이크로파 반응기에 넣고 섭씨 75도에서 45분 동안 교반하면서 용기를 놓습니다.

마이크로파 반응이 완료되면 수지를 깨끗하고 일회용 프릿 주사기에 옮기고 5밀리리터 디메틸포름아미드 2회와 5밀리리터 메탄올 세척 2회로 수지를 세척합니다. 마지막 세척 후 레진 함유 주사기에 5ml의 분열 칵테일을 첨가하여 실온에서 부드럽게 흔들면서 1 1/2시간 동안 배양합니다. 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 정제를 위해 1ml의 미처리 펩타이드를 준비하려면 0.1%의 트리플루오로아세트산이 보충된 600마이크로리터의 물에 아세토니트릴의 농축 펩타이드 스톡 400마이크로리터를 첨가하고 22마이크로미터 주사기 필터를 통해 용액을 HPLC 바이알에 여과합니다.

펩타이드를 정제하려면 UV 검출기를 222나노미터 및 330나노미터로 설정하고 20분 내에 15-55% 아세토니트릴의 선형 그래디언트에서 분당 3밀리리터 유속으로 C18 반분취용 컬럼을 사용합니다. 그런 다음 관심 있는 피크를 수집하고 결합합니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 또는 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 펩타이드 제품 확인의 경우, 0.5마이크로리터의 2, 5-디하이드록시벤조산 매트릭스를 포함하는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 플레이트에 수집된 피크 중 0.5마이크로리터를 혼합합니다.

자가 조립 용액을 준비하려면 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 20 % 아세토 니트릴과 10 밀리 몰 HEPES의 혼합물에 동결 건조 펩타이드 분말 1 밀리그램을 용해 한 다음 조립 용액을 와류로 용해시키고 샘플을 실온에서 조립하도록 둡니다. 펩타이드 어셈블리가 성숙에 도달하면 감쇠된 총 반사 다이아몬드 결정에 박막으로 어셈블리 용액의 8-10 마이크로 리터를 건조하고 건조 필름이 형성됨에 따라 1640에서 1631 반센티미터의 크고 넓은 물 피크가 사라지는 것을 모니터링합니다. 1500에서 1800 역센티미터의 배경 및 적외선 스펙트럼을 획득하여 2센티미터 역센티미터 해상도로 평균 50회 스캔하고 각 샘플 스캔 전에 백그라운드 스캔을 뺍니다.

베타 시트 어셈블리에 대한 적외선 서명은 1625에서 1635 역 센티미터 사이의 날카로운 피크로 관찰되어야 합니다. 펩타이드 샘플이 베타 시트가 풍부한 초분자 구조로 성숙하면 10마이크로리터의 펩타이드 어셈블리 용액을 투과 전자 현미경 탄소 그리드 표면에 로드하고 어셈블리가 1-2분 동안 그리드 표면에 흡착되도록 합니다. 필터 페이퍼를 그리드 가장자리에 터치하여 여분의 샘플을 제거하고, 새로 준비된 10마이크로리터의 2%우라닐 아세테이트 염색을 그리드 표면에 추가하여 2-3분 동안 배양한 다음 여과지로 과도한 얼룩을 제거하고 그리드를 진공 데시케이터에 밤새 배치한 후 투과 전자 현미경으로 다음날 이미징합니다.

디티올란 전구체 분자의 초기 1단계 합성을 제외하고, 나머지 1,2-디티올란 변형 펩타이드 합성은 고체 지지체에서 발생합니다. 3-브로모-2-프로프리온산이 디티올란 전구체인 3-2-프로판산으로 전환되는 것은 수지에 여전히 존재하는 펩타이드의 자유 N-말단 아민에 결합되기 전에 양성자와 탄소-13 핵 자기 공명에 의해 확인됩니다. 탈보호 후, 조 펩타이드는 역상 HPLC에 의해 정제되고 제품의 질량은 MALDI-TOF 질량 분석법으로 확인됩니다.

푸리에 변환 적외선 및 원형 이색성 분광법은 정제된 1, 2-디티올란 펩타이드가 성숙한 아밀로이드 섬유로 자체 조립되는 것을 모니터링하여 확장된 베타 시트 구조를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 섬유는 투과 전자 현미경으로 이미지화할 수 있습니다. 이러한 방법은 레진에 남아 있는 모든 펩타이드 염기서열의 N-말단을 수정하는 데 사용할 수 있지만, 펩타이드-자체 조립 조건은 각 펩타이드에 대해 최적화되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

자가 조립 펩타이드에 1, 2-디티올란 그룹을 추가하는 이러한 기술을 통해 생체 재료 분야의 연구원들은 초분자 표면 반응성을 탐구할 수 있습니다.