Name: 3-Nitrotyrosine 대기 환경을 통해 고성능 액체 착 색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템에서의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 대기 중 3-nitrotyrosine을 고성능 액체 착색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템으로 정량 분석하는 민감한 방법을. 이 기술은 환경 모니터링 및 대기 오염 연구에 활용됩니다.

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저자는 그의 TSP/PM2.5 샘플링에 대 한 미국 환경 보호청의 마사유키 쿠 보 감사합니다. 이 작품 일부 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP16K15373 및 JP18H03039에 의해 지원 되었다.

1. 총의 수집 오후 단백질 입자, 오후2.5또는 오후7및 가수분해 방법 정지
<ol><li>필터당 또는 백업 필터에서 오후를 수집 합니다.<ol>
<li>총 부유 입자 (TSP)의 컬렉션에 이전 오후2.5, 그리고 오후7, 석 영 필터 무게. 참고: 주어진 오후 단백질 및 펩 티 드에 의해 오염 미치지 않습니다 티로신 nitration 감지 (로 그들은 그런 니트로 그룹 부족), 우리는 측정 하기 전에 높은 온도에 quartz 필터를 취급 하지 않았다. 또한, HPLC ECD에 의해 결정으로 검출 한계에서 석 영 필터에서 3-NT 내용이 이었습니다.</li>
		<li>입자 크기 선택기 오후7 7 d (그림 1B)에 대 한 지속적으로 1000 L/min의 유량에서 수집 하는 높은 볼륨에 어 샘플러에 quartz 필터를 설정 합니다. TSP 크기 선택 (그림 1A) 없이 석 영 필터에 수집할 수 있습니다.</li>
		<li>오후2.5 를 사용 하 여 낮은 볼륨에 어 샘플러 116 L/min의 유량에서 크기 분류 단위와 함께 지속적으로 7에 대 한 수집 d.이이 단위를 사용 하 여 입자 오후4.5-2.5, 오후7.3-4.5, 오후15-7.3및 TSP-오후15로 분류 될 수 있다 석 영 필터 분류에 수집. 오후2.5 백업 필터 (그림 1C)에 수집할 수 있습니다.</li>
		<li>레코드 필터 컬렉션의 시간에 흐름 총 볼륨입니다. TSP의 무게 측정 오후2.5, 그리고 오후7 postcollection 무게에서 precollection 무게를 빼서 필터에. 필터 비닐 봉지에 밀봉 하 고 단계 (섹션 2 참조)까지-30 ° C에서 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteolyze 샘플.<ol>
<li>0.1 m M 아세테이트 버퍼 (pH 7.4)와 일반적인 효소 칵테일을 디졸브. 투 석 막에 넣어 솔루션 (분자량 컷오프 = 5000 다) 4 ° c.에 감동으로 0.1 m M 아세테이트 버퍼의 1 L에 젖어 모든 12 h x 2 버퍼를 교체 하 고 생 3-NT와 질산염 (없음2-)를 제거 하기 위해 투 석 하룻밤을 수행. 투 석 후 솔루션을 수집 하 고 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 의해 단백질 농도 측정 합니다.</li>
		<li>펀치는 prefilter 또는 백업 필터 6 m m의 둥근 동그라미 하 고 microtubes에 넣어. 최대 6 mm 분수의 5 조각 (그림 2) 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>50 µ g 칵테일 일반적인 효소의 단백질 (단계 1.2.1에서에서 준비) 16 h 회전 50 ° C에서 오후 단백질은 튜브를 포함 하는 0.1 m M 아세테이트 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 참고: 생 빼기 3-NT 일반적인 효소 칵테일 솔루션에서 그것은 준비 하 고 일반적인 효소 칵테일 전용 샘플을 소화 하는 데 필요한.</li>
		<li>0.1 m M 아세테이트 버퍼를 추가 하 고 centrifuging 여 외 막의 공급된 튜브 함께 린스 (10000 x g 30 초;에 대 한 정확한 속도 멤브레인에 따라 다릅니다), 막에 있는 3-NT와 비슷한 화학 물질 오염으로 인해. 반복 린스 1 x.</li>
		<li>게시물 베이스, 외 막으로 10 분 부하는 상쾌한 2500 x g에서 샘플을 원심 및 10000 x g와 적용에 대 한 4 ° C에서 원심 (MWCO = 10000), 차입의 충분 한 볼륨 수집 될 때까지. 어둠 속에서 4 ° C에 있다를 저장 합니다. 주의: 3-NT 스핀 열의 비슷한 피크의 검출, 때문에 그것은 HPLC 물 같은 버퍼 및 이전 0.1 M 아세테이트 버퍼 사용 또는 깨끗 한 물으로 잘 세척 하는 데 필요한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 3-NT 콘텐츠 TSP, 오후2.5, 및 오후7통해 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC-ECD) 전기 화학 탐지 시스템의 결정
주: 그림 3을 참조 하십시오.
<ol><li>모바일 단계를 준비 합니다.<ol>
<li>0.2 M 인산 버퍼 (pH 2.5) 포함 50 mg/L EDTA를 준비 합니다. 버퍼의 98 볼륨과 이기 (HPLC 등급)의 두 개의 볼륨을 측정 하 고 깨끗 한 유리병에 붓고 모자와 함께 적극적으로 혼합.</li>
		<li>녹은 공기 플랫 때까지 몇 시간 동안 실 온에서 모바일 단계를 정착. 참고: 시스템 이전을 시작 하는 경우 모바일 단계 sonicated 고 진공에서 degassed. 그러나, 이상 기체 제거 물과 유기 단계를 통해 증발 사이의 비율을 변경 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펌프, HPLC 열, 한 degasser, 한 ECD와는 인젝터 ECD HPLC 시스템에 의하여 이루어져 있다. 모바일 단계를 equilibrate 하 고 배경 및 잡음을 줄이기 위해 시스템을 안정화.<ol>
<li>모바일 위상 및 HPLC 열 HPLC 시스템에 설치 합니다. HPLC 펌프를 켜고 시작 하루 전날에서 열 온도 25 ° C에서 500 µ L/min 흐름 속도로 모바일 단계와 열 안정.</li>
		<li>다음 날에는 ECD를 점화 하 고 매개 변수를 설정 (-900에서 감소 전압 mV와 400 여기 전압 mV). 적어도 3 시간 그것을 고정 시켜야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오후7에서 3-NT 농도 측정 합니다.<ol>
<li>0.1 m M 아세테이트 버퍼에 3-NT 표준 (5-500 nM)와 빈의 다양 한 농도 (3-NT 표준 및 특이 효소 칵테일, 유리병도 버퍼 확인 하는 오염) 없이 준비 합니다.</li>
		<li>HPLC 데이터 프로세서를 실행 합니다.</li>
		<li>자동-인젝터에 설정 샘플 튜브를 넣어 25 µ L. 사출 볼륨 작동 모바일 위상 및 유량 단계 2.2.1에서에서 설명한 대로 동일한 조건. 참고: 샘플 준비 완료 되는 경우 이어야 한다 샘플, 표준 (5-500 nM), 일반적인 효소 칵테일 전용 샘플 및 빈 유리병.</li>
		<li>크로마에 기준 평면 인지 확인 하 고 샘플 주입을 시작 합니다. 참고: 일반적으로, 3-NT에서에서 검색 된 20-21 분; 그러나, 약 30 분 샘플 주입 당 실행 시간으로 권장 됩니다. 그렇지 않으면, 오염 물질 봉우리 다음 실행에 포함 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Chromatograms 및 오후7 에서 3-NT 콘텐츠의 정량화 분석
<ol><li>3-NT 피크는 chromatograms에서 확인 하 고 콘텐츠를 계산.<ol>
<li>데이터 수집 후 분석 소프트웨어와 크로마 데이터 파일을 엽니다.</li>
		<li>플랫 베이스 라인에서 3-NT 피크 맞은편에 선을 인출 하 고 그려진된 라인에서 피크 높이 읽고. 참고: 양적 한계는 약 5 nM (125 fmol 25 µ L 주입에서). 주의: 전극은 ECD에서 천천히, 고갈 되 고 제한 때문에 S/N 비율 높은 것.</li>
		<li>3-NT 표준 봉우리에서 회귀선을 준비, 기울기를 계산 하 고 차단.</li>
		<li>다음 방정식으로 이러한 상수에 할당 하 고 샘플에서 3-NT 콘텐츠를 다음과 같이 계산. 샘플 3-NT (nM) = [피크 샘플-차단] / 경사 식 (1) 참고: 표준 곡선 잘 나타내야 5 사이 직선으로 및 500 nM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공기 환경 및 샘플 유리병에서 오후7 에서 3-NT를 계산 합니다.<ol>
<li>증식로 반응 (희석 비율, 있는 경우), 3-NT 농도 그리고 오후7 원형에서 절대 3-NT 콘텐츠 평가.</li>
		<li>수집 된 필터 영역을 측정 하 고 3-NT 콘텐츠 총 오후에 계산 다음 방정식으로7 필터. 총 오후7 [원의 오후7 에서 3-NT 콘텐츠] = [원형 지역에 오후7 필터 영역의 비율] x x 226.19 (그램 두더지를 변환)의 경우 식 (2)</li>
		<li>나누어 총 오후7 총 공기 흐름 볼륨 또는 오후 공기 환경 또는 오후7 에서 3-NT 콘텐츠 평가7 무게 (단계 1.1.3에에서 기록).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서는 매우 중요 한 HPLC ECD 기법을 사용 하 여 석 영 필터에 수집 하는 공 수 오후에 3-NT를 평가 하는 정량화 방법을 설명 합니다.
일반적으로 3-NT 측정 방법 인간 질병에 있는 산화 긴장의 biomarkers로 개발 되었습니다. 항 체 기반 방법 (예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과) 있기 때문에 엄격한 분석 결과 유효성 테스트의 신뢰성을 평가 하기가 반 정량적으로 간주 됩니다. 전기 화학 탐지 (ECD)와 질량 분석 기반 분석 HPLC 3-NT13의 정량화에 대 한 적절 한 감도 있다. 들은 민감한, GC-MS 같은 질량 분석 기반 방법 또는 GC-MS/MS 필요한 아미노산, derivatization 그리고 derivatization 수시로 과정 유물14의 형성에 결과.
GC와 LC 기법에 비해 HPLC ECD 상대적으로 저렴 하며 측정 3 충분 한 감도가지고-NT. 또한, GC-MS와 LC-MS derivatization 단계 종종 추가 시간이 필요 합니다. 여기에 제시 된 방법 단백질 소화 단계에 대 한 16 시간을 필요로, 하지만 그것은, 그럼에도 불구 하 고, 실시 될 수 있습니다 하룻밤 (위에서 설명한 대로 실습 시간 약 30 분이 필요 샘플 당). 자동 반복 측정 한 autosampler를 사용 하 여 높은 처리량 측정 시스템을 제공할 수 있습니다. 이전 연구는 면역 방법 측정 하 보고 오후2,7; 3-NT 그러나, 이러한 방법을 감지할 수 없습니다 3-NT 오후153-NT의 낮은 수준 때문에 겨울 시즌에.
HPLC ECD 메서드는 추가 이점이 다른 표준 방법; 예를 들어 추출 과정 (i)는이 메서드가 필요 하지 않습니다, (ii) 그것은 완전히 세제 무료, (iii) 그것은 최소한의 샘플 요구 사항, 그리고, 중요 한 것은, (iv) 그것이 높은 감도. 입자 필터에 수집 된 다양 한 구성의 정량화를 포함 하 여 추가 조사에 대 한 쥡니다 자주 구분 됩니다. 세제 또한 필터에서 오후-바인딩 단백질을 분리 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 이러한 추가 단계 오염, 샘플 손실, 및 과소 추출 효율 때문의 위험을 증가 하 고 또한, 대부분의 세제가 LC/MS와 호환 되지 않습니다. 현재 ECD HPLC 방법에서 HPLC 샘플 쉽게 분리 수 있습니다 필터에서 간단한 빈 펀치를 사용 하 여 및 추가 샘플 준비 과정의 요구 사항 없이. 라운드 모양의 샘플의 영역은 28.3 m m2는 원래 석 영 필터의 크기에 비해 매우 작은은 (8 × 10 인치 = 203.2 x 254 m m = 51,600 m m2).
HPLC ECD 조건 3-NT 신호에 간섭을 유발 하지 않도록 신중 하 게 검토 되어 앞에서 설명한12. 모바일 위상의 강한 산 성 pH 및 이기의 적절 한 농도 감지에 대 한 중요 하다. 이러한 조건을 사용 하 여, 다른 화합물을 니트로 기본를 포함 하 여 nitrotyrosine에서 분리 수 있습니다. 현재 상태 3-NT에서 다른 실제 속성 (예: 미 립 자 물질 및 플라즈마) 샘플의 탐지를 위해 적당 하다.
평가 하는 공기에 3-NT 필터 무게의 측정 및 배경 제거 중요 한 단계가 있습니다. 일반적으로 오후7 의 약 100 밀리 그램은 수집; 4-7 일의 기간 동안 그러나, 몇 가지 요소는 오후7 컬렉션, 습도 및 정적 전기 충전을 포함 하 여 전후 필터 무게에 영향을. 이러한 효과 방지 하려면 오랜 기간 동안 필터의 안정화는 subequal 온도 습도에서 필요 합니다. 전자 저울 설치 위치는 안정적인 환경에서 유지 되어야 합니다. 샘플 준비, 그것은 종종 3-nt 비슷한 피크를 표시 하는 일반적인 효소 칵테일에서 배경 효과 및 외 막 수정 하는 것이 중요.
이 메서드는 실내 환경에 포함 하 여, 다른 입자에 적용할 수 있습니다. 단백질의 nitration 그들의 극성 잠재적인2증가할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 환경 청결 평가 및 nitrosative 스트레스를 방지 도움이 됩니다.
이 연구에서 우리는 쉬운 손잡이 및 저렴 한 기구와 공기 샘플러 필터의 대기 3-NT에 대 한 매우 중요 한 측정 방법을 보고합니다. 3-NT 대기에서의 생성은 O3,2, 오후 단백질, 및 인간의 allergenicity에 영향을 미치는 기상 요소 등 환경 오염 물질에 연관 된다. 결론적으로, 현재 조사에서 개발 하는 방법 O3, 다양 한 오염 물질, 그리고 다양 한 기상 조건 하에서 오후 단백질의 대기 반응 평가 하는 데 도움이 있습니다. 3-nitrotyrosine는 분위기에서의 추정을 위한 HPLC ECD 개발의 이러한 노력으로 우리는 인간의 건강을 향상 더 나은 환경 청결, 예상.

에 어로 졸 또는 공 수 오후 바이러스, 원핵생물, 곰 팡이, 식물 (화분), 동물 (곤충, 인간)1등 다양 한 생물학 근원에서 단백질을 포함 되어 있습니다. 오후에 단백질 함량의 비율 공 수 알레르기2로 서 주요 역할 연루 되어 거의 5%로 추정 된다. 최근 보고서는 도시 주변에 어로 졸의 다양 한 제안 크기 비율 0.5%와 23까지인 아미노산 포함. 또한, 오후 단백질의 화학 수정 O3, 질소 이산화 (아무2), 이산화 황 (이렇게2)4등 다양 한 오염 물질 단백질의 반응에 의해 생성 될 제안 있다.
3-NT-단백질 수정-티로신 잔류물의 nitration에 의해 생성 됩니다. 아니2 O3 의 높은 농도 의사 대기 공간5,6분 자가 단백질의 nitration 홍보 하 보였다. Polypeptide 사슬에 티로신 잔류물의 nitration 꽃가루 단백질7의 알레르기 잠재력을 향상 시킵니다. 따라서, 정량화 및 공 수 3-NT의 평가 환경 건강의 문제 해결에 중요 한 측면 이다.
3-NT로 알려진 또한 산화의 바이오 마커 이며 nitrosative 스트레스8. 증거의 신흥 시체 여러 가지 인간의 질병9,103-NT 콘텐츠의 중요 한 협회를 보이고 있다. 때문에 그것의 해로운 효과, 검색 및 3-NT 생물학 견본에서의 양적 평가 개인의 건강 상태를 결정 큰 관련성 개최. 최근 몇 년 동안, 다양 한 방법을 도입 되었습니다 추정 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험, HPLC를 포함 하 여 3-NT 콘텐츠 및 LC/MS11. 이전 학문에서는, 우리는 이전 방법에 비해 여러 가지 장점을 수 여 하는 HPLC ECD 기술을 사용 하 여 탐지 방법을 보고 있다. 예를 들어 HPLC ECD는 상대적으로 간단한 분석 결과 시스템12는 추출 또는 derivatization 절차를 필요 하지 않습니다. 우리는이 방법을 생물 학적 샘플 (인간에서 플라즈마와 쥐)에서 3-NT 검색에 적용 됩니다 확인 했습니다.
비록 많은 조사 3-NT 생물학 견본에서의 검출 강조, nonbiological 샘플에 그것의 감지 애매, 고 따라서 현재 연구 추진 하고있다. 사실, 공 수의 해로운 효과 평가 하기 위해 3-NT, 양적 방법 3-NT 공중 입자에서 직접 검색 하는 데 유용 하는 필요; 따라서, 우리 감지 기존 HPLC ECD 메서드 적용 3-NT 오후에서2.5 유리 섬유 필터에 대 한 수집. 사용 하 여 기술, 3-NT 작은에서 직접 검출 될 수 조각 (6 m m 직경 둥근 구멍) 오후 컬렉션 필터에서 샘플. 우리는 더 다양 한 오후 크기에 대 한 3-NT의 콘텐츠를 평가 하 고 3-NT의 검출 한계를 측정. 현재 문서 제안 3-NT nonbiological 및 생물 학적 샘플에서 직접 검색 하 고 구분 및 높은 처리량 방법.

<table><tbody><tr><td>석영 필터, 백업 석영 필터</td><td>PALL 생명 과학</td><td>7204</td><td>Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in</td></tr><tr><td>대용량 공기 샘플러</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>HV-1000F</td><td></td></tr><tr>SPM <td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>080130-061용 입자</td> <td>크기 선택기</td><td>SPM (부유 미립자 물질)은 일본에서 10 um의 100% 컷오프 직경을 가진 입자로 정의됩니다.&nbsp; SPM은 PM7과 거의 동일합니다.</td></tr><tr><td>저용량 공기 샘플러</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>AH-600F</td><td></td></tr><tr><td>PM2.5용 크기 분류 단위</td><td>SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY</td><td>AH-600</td><td></td></tr><tr><td>분류용 석영 필터 (PM4.5&ndash; 2.5, PM7.3&ndash; 4.5, PM15&ndash; 7.3, 및 TSP-PM15)</td><td>Tokyo Dylec</td><td>AHQ-630</td><td></td></tr><tr><td>비특이적 프로테아제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>Pronase from Streptomyces griseus&nbsp;</td></tr><tr><td>3-니트로티로신</td><td>SIGMA</td><td>N7389</td><td></td></tr><tr><td>한외여과막</td><td>Millipore</td><td>UFC5010BK</td><td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa 컷오프</td></tr><tr><td>ECD</td><td>Eicom</td><td>HTEC-500, PEC-510</td><td>독립형 HPLC-ECD 장치(HTEC-510) 및 사전 전기분해 셀(PEC-510), 펌프</td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>포함 Eicom</td><td>SC-5ODS</td><td></td></tr><tr><td>데이터 프로세서</td><td>Eicom</td><td>EPC-300</td><td></td></tr><tr><td>인젝터</td><td>Hitachi High-Tech Science&nbsp;</td><td>L-7200</td><td>자동 샘플러</td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>eDAQ Japan</td><td>ES280&nbsp;</td><td>PowerChrom 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

3-nitrotyrosine 대기 환경을 통해 고성능 액체 착 색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템에서의 탐지

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

3-nitrotyrosine (3-NT) 대기 바이오-에 어로 졸 단백질을 통해 오존 (O3)와 질소 이산화 (아무2) 반응에 티로신 잔류물에서 생성 됩니다. 안정적인 3-NT 산화 손상에 대 한 특정 마커 이며 알레르기를 유도 하는 promotive 효과를 보고 됩니다. 현재 연구에서 우리는 바이오-에 어로 졸을 포함 하 여 도시 환경 공기에서 척도 3-NT를 미 립 자 물질 (PM2.5)의 < 2.5 µ m를 수집 공기 샘플러 필터에 매우 민감한 분석 결과 개발을 보고 합니다. 이 방법에서는, 6 m m 직경 둥근 구멍은 공기 샘플러의 필터에서 잘라내어 단백질은 위해 일반적인 효소 칵테일을 혼합. 아미노산 수준으로 소화 하는 단백질 견본 3-nt-고성능 액체 크로마토그래피-전기 화학 검출기 (HPLC-ECD)를 사용 하 여 테스트 되었습니다. 최대 3-NT 콘텐츠 1.13 pg/m3의 탐지 한계를 가진 4.5에서 7.3 μ m 크기의 오후는 prefilter에서 발견 되었다.

HPLC ECD 원리는 간단 하다. 대상 포함 된 샘플 HPLC 및 모바일 단계 구분 하 고 분리 된 대상 화합물은 감소 전기 화학 검출기에서 산화.
ECD HPLC 시스템에서 약 22 분에서 3-NT 피크 감지 됩니다. (PEC-510와 HTEC-500) ECDs HPLC 줄에서에 연결 됩니다. 첫 번째 ECD는 화합물에서 수 산 기 그룹 그리고 산화 감소 된 화학 물질. ECDs를 매우 민감한 탐지의 범위가 10-15 M. ECD HPLC 시스템의 검출 한계 1.13 pg/m3, 10 부품 x 3의 평균 기저 신호 (mV)으로 계산 했다.
대표 chromatograms는 그림 4에 나와 있습니다. 순수한 3-NT 표준 분석 하 여 안정적인 기준과 명확한 피크 수 감지 (그림 4A). 오후에 3-NT7 또한 측정 했다 6 m m, 라운드 모양의 샘플 (그림 4B)를 사용 하 여.
3-NT 탐지 능력의 정확성에 관한 3-NT 표준 HPLC에 주사 3-NT에 해당 하는 피크 20 분의 보존 기간에 검색 되었습니다. 오후 샘플 3-NT 다른 물질 로부터 분리 되었다 그리고 독립적인 피크 표준으로 보존 동시에 발견 되었다. 일반 표준 곡선 그림 5, 5, 40 nM 사이 선형성은 관찰 하는 어디에 표시 됩니다. 선형성 500 볼 수 있다 nM (데이터 표시 되지 않음).
표 1 pg/m3 에 어로 분위기에서 3-NT 내용을 보여준다. 3-오후2.5 prefilter에 NT의 #3 (오후7.3-4.5)에서 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig1.jpg"> 그림 1 : TSP, 수집 체계 오후7및 오후2.5. (A) 총 부유 입자 (TSP) (1000 L/min의 유량)에 컬렉션 필터에 직접 수집 됩니다. (B) 오후7 수집 큰 입자 크기 선택 (1000 L/min의 유량)에 의해 제외 됩니다. (C) 오후2.5 (116 L/min의 유량)에 4 개의 prefilters을 통해 수집 됩니다. 석 영 필터는 통용 오후7 와 오후2.5 에 대 한 백업 필터 또는 TSP에 대 한 컬렉션 필터가이 그림에 표시 된 대로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig2.jpg"> 그림 2 : 6 mm-라운드의 준비. 컬렉션 필터 6 m m 직경을 가진 빈 펀치 도구를 사용 하 여 절단 했다. 그런 다음, 예제 1.5 mL microtube에 저장 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig3.jpg"> 그림 3 : HPLC ECD 시스템의 회로도. 삽입 된 샘플에서 3-NT는 모바일 단계 흐름 통해 HPLC 칼럼에서 분리 되었다. 3-NT aminotyrosine로 감소, iminotyrosine로 산화 되었고 화학적 검출기에서 검출. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig4.jpg"> 그림 4 : HPLC ECD 시스템에서 전형적인 chromatograms. (A) 순수 3-NT ECD HPLC 시스템에 의해 분석. 오후7 필터에서 (B) 6mm 원형 샘플 3-NT를 감지 하는 데 사용. 3-NT 피크는 화살표로 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58371/58371fig5.jpg"> 그림 5 : 순수한 3-NT 샘플의 표준 곡선. 낮은 농도에서 결과 다른 그래프에 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58371/58371fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">제목</td>
			<td>일 컬렉션</td>
			<td>스팟</td>
			<td>3-NT (pg/m3 공기)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM2.5</td>
			<td>필터당 # 1</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>8.25 ± 0.37</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>필터당 # 2</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>29.66 ± 1.94</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>필터당 # 3</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>74.37 ± 4.09</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>필터당 # 4</td>
			<td>27</td>
			<td>4</td>
			<td>32.70 ± 0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>4.21 ± 0.91</td>
		</tr>
<tr>
<td>PM7</td>
			<td>Backfilter</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>89.16 ± 6.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSP</td>
			<td>필터</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>10.34 ± 2.09</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 3-NT ECD HPLC 시스템에 의해 측정 하는 분위기에서. 각 필터에서 6mm 원형 반점 HPLC ECD 시스템을 사용 하 여 측정 되었다. Prefilters #1-# 4는 같은 기간에 수집 되었다. 참고 3-NT 공기에서의 농도 수집 된 날짜, 년, 위치 등 다양 한 요인에 의해 영향을 받습니다. 데이터 (n = 3-10)는 평균 ± 표준 오차 표현.

우리는 6 mm 직경 라운드-고성능 액체 크로마토그래피-전기 화학 검출기 (HPLC-ECD)를 사용 하 여 공기 샘플러 prefilters에서 잘라와 대기 단백질의 화학 수정 3-nitrotyrosine를 검색 하는 방법을 제시.

3-Nitrotyrosine 대기 환경을 통해 고성능 액체 착 색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템에서의 탐지

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

이 방법은 니트라피린과 3 니트로티로신에 대한 환경 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 공기 샘플 필터에서 3 니트로티로신을 검출하는 독특하고 매우 민감한 방법입니다. 7미크론 미만의 총 부유 입자 또는 미립자 물질을 수집하기 위해 먼저 바인더 3 석영 필터의 무게를 측정하고 대량 공기 샘플러에 고정합니다. PM7을 수집하거나 수집된 총 일시 중단 된 입자에 대해 필터를 덮으십시오. 공기 샘플러를 분당 1,000리터로 7일 동안 지속적으로 실행합니다. 사전 필터를 크기 분류 장치에 로드하고 저용량 공기 샘플러에 크기 분류 장치 및 백업 필터를 설치합니다. 7일 동안 분당 116개의 쓰레기에서 공기 샘플러를 실행하여 백업 필터에서 PM2.5를 수집합니다. 샘플링이 완료되면 총 유량 볼륨을 기록합니다. 필터의 무게를 측정하고 수집된 파티클의 무게를 계산합니다. 필터를 비닐 봉지에 밀봉하여 섭씨 30도에 보관하십시오.Next는 6X 비특이적 프로테아제 칵테일과 아세테이트 버퍼 500마이크로리터를 준비하고 5000달톤의 분자량 차단으로 달라시스 멤브레인에 놓습니다. 채워진 멤브레인을 아세테이트 완충제의 1L에 담그고 24~36시간 동안 섭씨 4도에서 저어주며, 12시간마다 완충제를 교체하여 인인성 3-니트로티로신과 질산염을 제거합니다.그런 다음 투석 된 프로테아제용의 단백질 농도를 아빅콘시닌산 단백질 분석으로 측정합니다. 그 후 냉동실에서 필터를 제거하고 가방에 밀봉하면서 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. 그런 다음 필터의 미립자 커버 영역에서 최대 5 6 밀리미터 너비의 원을 펀치하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 원을 배치합니다. 50을 포함하는 아세테이트 버퍼 300마이크로리터 준비

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환경

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