Name: 척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 학습하세요 고내용 이미징을 활용한 마이크로플레이트 CETSA 프로토콜로 약물-표적 결합을 측정하는 방법을. 화학생물학 및 신약개발에서 화학적 프로브 검증에 필수적인 기술입니다.

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저자는 과학 생활 연구소와 카롤 린스 카 Institutet 위한 인프라 지원을 인정합니다. 저자는 또한 입력과 Michaela Vallin, 막달레나 Otrocka와 토마스 Lundbäck 토론을 인정합니다.

1. 셀의 시드
참고: 워크플로 대 한 일반적인 개요에 대 한 그림 1을 참조 하십시오. 재료 및 시 약의 상세 목록 테이블의 재료에서 사용할 수 있습니다.
<ol><li>셀의 시드, 이전 나중 단계에서 난방 접시 아래 갇혀 공기 방울을 피하기 위해 검은 384-잘 이미징 분석 결과 접시의 프레임에 표준 드릴 구멍을 드릴 합니다. 플라스틱 입자가이 단계 동안 우물을 입력을 방지 하 고 살 균 조건을 유지 하기 위해 밀봉 접착제 알루미늄 호 일 접시 또는 조직 문화 후드에 드릴링 전에 접시 커버. 일반적으로, 각 접시 (짧은 가장자리)의 측면에 3.5 m m의 직경을 가진 3 구멍 충분.</li>
	<li>70% 에탄올으로 청소 하 여 층 류 벤치를 준비 합니다. 표준 무 균 조직 배양 기술, 다음 셀 플라스 크 또는 접시에서 미디어를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5-10 mL로 세포 세척 하 고 플라스 크에 트립 신 2 mL를 추가 합니다. A-431 셀 분리 될 때까지 플라스 크에서 37 ° C를 품 어. Haemocytometer 또는 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 문화 매체에 50, 000 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.</li>
	<li>벌크 시 약 디스펜서 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (주는 잘 당 2000 셀 마지막 셀 밀도)의 40 µ L을 분배. 짧게 사이드-투-측면에서 접시의 바닥에 세포를 균일 하 게 분산 하는 접시를 이동 합니다.</li>
	<li>접시 가장자리 효과 최소화 하기 위해 층 류 두건 뒤 실 온에서 20 분에 대 한 분석 결과 접시의 하단에 정착을 셀 수 있습니다. 다음, 다습 한 대기권을 보장 하기 위해 젖은 종이 타월로 플라스틱 용기에 접시를 놓습니다. 사용 전에 70% 에탄올과 플라스틱 용기를 닦아.</li>
	<li>기존의 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 2-3 일에 대 한 분석 결과 플레이트 상자를 품 어. 가벼운 현미경으로 검사 하 여 평가는 50-75%까지 셀의 confluency를 모니터링 합니다.</li>
</ol>2. 복합 치료
<ol><li>실험 당일, 잘 사용 하 여 각 접시 세탁기에서 중간 발음. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다. 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우에, 액체 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 제거할 수 있습니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 어떤 초과 액체 다음 종이 타월로 dabbing에 의해 제거 됩니다.</li>
	<li>자동 분배를 사용 하 여 세포 배양 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피 펫 적절된 농도를 희석 하는 화합물의 30 µ L를 추가 합니다. 각 분석 결과 접시에 여러 우물을 네거티브 (DMSO)와 긍정적인 (알려진된 ligand) 컨트롤을 추가 하려면 확인 하십시오. 이후이 열 교대 분석 실험, 화합물 농도 분리 상수 관찰 단백질 안정화를 초과 하는 것이 필요 하다. 따라서, 화합물 농도 대 한 대략적인 가이드라인은 50-100 번 IC50, 하지만 화합물 농도 대 한 더 많은 세부 사항 설명을 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다. 참고: 셀 라인의 DMSO 내성 실험 전에 시험 되어야 한다.</li>
	<li>인감 숨 플레이트 화합물 처리 분석 결과 플레이트 밀봉 하 고 30 분 동안 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.</li>
</ol>3. 열 도전
<ol><li>먼저, 원하는 온도에 물 목욕을 설정 합니다. 참고 분석 결과 접시의 우물 내부에 도달 최종 온도 물 목욕에 최종 온도에서 다를 수 있습니다. 더미 플레이트 및 열전대 온도계와 오프셋을 미리 조사. 그것은 일반적으로 원하는 온도에서 안정화 목욕 30 분 걸립니다.</li>
	<li>원하는 온도 난방 단계 분석 결과 격판덮개의 우물에서에 도달 확인, 분석 결과 접시와 매체의 동일한 볼륨을 포함 하는 봉인 되지 않은 더미 플레이트를 준비 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 숨 봉인 해제 하 고 다시 물 물 목욕에 연속적인 난방 동안 우물에 누설 것 이다 되도록 꽉 접착제 알루미늄 호 일 화합물 취급 셀을 포함 하는 분석 결과 접시를 봉인. 플레이트 프레임에 드릴된 구멍 액세스할 수 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>접시 아래에서 밖으로 남아 있는 공기를 물 표면으로 각도 판의 아래쪽 물 목욕에 분석 결과 접시와 접시 더미를 놓습니다.</li>
	<li>열전대 온도계를 사용 하 여 새로운 더미 격판덮개의 우물 내부 온도 모니터링 합니다.</li>
	<li>분석 결과 접시 물 욕조에 3 분 동안 열. 즉시 다른 물 목욕을 5 분 동안 방 강화 물 분석 결과 및 더미 플레이트 전송. 분석 결과 격판덮개는 이제 추가 처리에 대 한 준비 이다.</li>
</ol>4입니다. 고정
<ol><li>벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 접시에 직접 10 µ L 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA)을 분배. 20 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: 일부 fixatives 발암으로 분류 되 고 기관 안전 규정을 따라야 한다.</li>
	<li>PFA 솔루션 발음 하 고 접시 와셔를 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 씻어. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다. 참고:이 절차는 최적화 되어 있는 액체는 동시에 적절 하 게 하 고 제거 접시 세탁기에 오버플로 프로토콜을 사용 하. 접시 와셔 또는 유사한 절차를 사용할 수 없는 경우 세척 단계 수동으로 수행할 수도 있습니다.</li>
	<li>
수동 세척 절차: 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 우물에서 액체를 제거 합니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 멀티 채널 피 펫으로 PBS의 80 µ L을 추가 및 위에서 설명한 대로 다시 접시를 반전, 세척 절차를 두 번 반복. 마지막 세척 후 깨끗 한 종이 수건을 초과 액체를 제거에 대 한 접시를 되 리.</li>
</ol>5입니다. permeabilization
<ol><li>0.1% (v/v) NP 40를 멀티 채널 피펫으로와 웰 스의 20 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어. (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 셀을 씻어.</li>
	<li>또는 적절 한 경우 적용 한 항 원 검색 프로토콜, 예를 들면:<ol>
<li>멀티 채널 피펫으로와 우물에 1 %SDS 20 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 고 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 씻어.</li>
		<li>PH 7.2에서 10 mM 글리신의 80 μ를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 글리신 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 차단
<ol><li>벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 PBS에서 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 15 µ L를 추가 합니다. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.</li>
</ol>7. 1 차 항 체
<ol><li>접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 차단 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.</li>
	<li>1 차적인 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.</li>
</ol>8. 2 차 항 체
<ol><li>1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 (단계 4.2) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 우물을 세척.</li>
	<li>알 렉 사 488 이차 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에. 1 시간 동안 실 온에서 품 어. 빛 으로부터 보호 하기 위해 접착제 알루미늄 호 일 인감과 접시를 봉인. 참고:이 빛에서 접시와 후속 단계를 보호 합니다.</li>
</ol>9. 핵 얼룩 및 셀 마스크
<ol><li>멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물 PBS에 0.05 mg/mL를 희석 하는 핵 염색의 10 µ L를 추가 합니다. 추가 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>이차 항 체 및 Hoechst 솔루션 aspirate과 웰 스 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.</li>
	<li>셀 마스크 200 ng/mL PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 희석의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>셀 마스크 솔루션을 발음 하 고 우물 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.</li>
	<li>접시 와셔, 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 모든 우물에 PBS의 60 µ L를 분배 하 고 밀봉 접착제 알루미늄 호 일로 접시.</li>
</ol>10. 이미지 수집 및 분석
<ol><li>3 형광 채널을 사용 하 여 높은 콘텐츠 영상에 이미지 캡처: DAPI (387/447), GFP (472/520) 및 TexasRed (562/624). 10 X 목표를 사용 하 여 잘 당 4 이미지를 취득 합니다. 자동된 레이저 자동 초점을 사용 하 고 범주화 2 중 적용. 16 비트, 회색 스케일 tiff 파일로 메타 데이터와 함께 이미지를 저장 합니다.</li>
	<li>사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. DAPI (핵)와 TexasRed (세포질) 셀 점수 알고리즘을 사용 하 여 셀 경계를 식별 합니다.</li>
	<li>추가 데이터 분석에 대 한 모든 인수 파장에 대 한 평균 강도 추출 합니다.</li>
	<li>분석 결과의 안정성을 보장 하기 위해 Z 요소를 계산 합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 % 안정화 계산: 100 * (1-(잘 강도-평균 잘 휘도 부정적인 제어) / (평균 휘도 긍정적인 제어 평균 강도 부정적인 제어)). 여기 부정적인 제어 DMSO 이며 긍정적인 컨트롤 참조 물질 이다. 각 화합물에 대 한 최대 및 최소 안정화 농도 제어 우물의 강도 값 대신 가끔 사용 됩니다 이후 최대 안정화 화합물 사이 다를 수 있으며 실제로 ITDRF 곡선에 대 한 긍정적인 통제 보다 클 수, .</li>
</ol>

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<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li>
</ol>

저자 아무 공개 보고 있다.

결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그림 2C 와 같이 분석 결과 신호 방해 하는 화합물에 대 한 카운터 검사는 매우 좋습니다. ligand의 존재에 있는 감소 된 신호를 관찰 하는 때 단계 5.2에서에서 설명한 대로 항 원 검색 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 플레이트의 고르지 못한 난방 관찰된 데이터 변동 및 격판덮개 변형을 일으킬 수 있습니다. 접시 부분적으로 (3.4 단계) 과도 열 도전 하는 동안 물 욕조에 잠긴 이후 플레이트의 외부 우물 외부 벽을 통해 뿐만 아니라 우물의 바닥에서 뿐만 아니라 뜨거운 물에 노출 됩니다. 이...

때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.
마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된8, 9,10. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (Tagg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.
이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경12immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가13를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>세포</td><td>분리 및 16</td></tr><tr><td>% 파라포름알데히드(PFA)</td> 외배양 12604013 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>고정성</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG (H+L), Alexa Fluor 488 접합 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>HCS CellMask Red stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H32712</td><td>세포질 염색</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56741</td><td>투과성</td></tr><tr><td>Hoechst stain 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 배지(DMEM) - 고포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>6429</td><td>세포 배양 배지 구성 요소</td></tr>, <tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청(FBS),</td> <td>시그마-알드리치</td><td>F9665</td><td>세포 배양 배지 구성</td></tr><tr><td>요소, 페니실린-스트렙토마이신</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>P4333</td><td>세포 배양 배지 구성 요소</td></tr>, <tr><td>코닝, 코</td>파운드 배양 단계를 위한 통기성 플레이트 씰 <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3345</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-p38 항체 [E229]</td><td>Abcam</td><td>ab170099</td><td>primary antibody, LOT:GR305364-16</td></tr><tr><td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td><td>VWR</td><td>736-2044</td><td>imaging plates</td></tr><tr><td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td><td>VWR</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>adhesive aluminum foil</td><td>VWR</td><td>30127790</td><td></td></tr><tr><td>peelable aluminium seal</td><td></td><td></td><td>PlateLoc</td></tr><tr><td>LY2228820</td><td>Selleckchem</td><td>S1494</td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>PH797804</td><td>Selleckchem</td><td>PH797804</td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Selleckchem</td><td>S1574</td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>SB203580</td><td>Tocris</td><td>1202</td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>AMG 548</td><td>Tocris</td><td>3920</td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>RWJ 67657</td><td>Tocris</td><td>2999</td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>L-Skepinone</td><td>CBCS compound collection</td><td></td><td>p38&alpha; 억제제</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>차단제</td></tr><tr><td>SDS(sodium dodecyl sulfate)</td><td>BDH</td><td>44244</td><td>항원 검색에 사용</td></tr><tr><td>항원 검색에 사용되는</td> <td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td></tr><tr><td>A-431 세포</td><td>ATCC</td><td>ATC-CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>복합 플레이트 제조용</td></tr><tr><td>플레이트 실러</td><td>Agilent</td><td></td><td>PlateLoc</td></tr><tr><td>벌크 시약 디스펜서</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td>Multidrop Combi</td></tr><tr><td>Automated liquid 핸들링</td><td>Agilent</td><td></td><td>Bravo 액체 취급 플랫폼; 복합 플레이트 준비에 사용되는</td></tr><tr><td>플레이트 와셔</td><td>Tecan</td><td></td><td>Hydrospeed</td></tr><tr><td>수조</td><td>Julabo</td><td>TW12</td><td></td></tr><tr><td>열전대</td><td>VWR</td><td></td><td>열전대 추적 가능한 실험실 온도계</td></tr><tr><td>고함량 이미저</td><td>분자 장치</td><td></td><td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content 분석 시스템</td></tr></tbody></table>

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.

그림 1 에 설명 된 프로토콜에서는 높은 콘텐츠 영상으로 남아 있는 수용 성 단백질의 탐지와 부착 세포에 CETSA 분석 실험을 실행 하기 위한 기본 워크플로 설명 합니다. 이 워크플로 화합물 또는 약14의 격판덮개 레이아웃을 수정 하 여 쉽게 분석 결과 개발의 모든 단계에 맞게 수 있습니다. 우리 선발 예상된 결과 예상 몇 가지 사용 하는 경우 아래.
항 체 식별 및 분석 결과 개발입니다. 성공적인 결과 대 한 필수 구성 요소는 기본 항 체 또는 선택적으로 열 동안 집계 및 침전 된 단백질의 단백질의 기본 형태를 인식 하는 다른 적합 한 선호도 시 약의 식별 3 단계에 도전 한다. 설정 하려면 여기에 설명 된 CETSA 이미징 분석 결과, 우리는 긍정...

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

이 방법은 화학 생물학 및 약물 발견의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 화합물은 표적 단백질에 결합합니까? 이 기술의 주요 장점은 부착 된 세포의 분리 요구 사항이 없다는 것입니다.그리고 공간 국소화는 이미징에 의해 결정될 수 있다. 우리는 세포주에서 이 방법을 적용했습니다, 1 차적인 배양 및 동배와 같은 그밖 세포 시스템에 이 방법을 적용하는 것은 또한 가능합니다. 세포를 파종하기 전에, 조직 배양 후드에 검은 색 384 웰 이미징 분석 플레이트를 배치하고, 각 플레이트의 양쪽 끝에 세 개의 3.5 밀리미터 직경 구멍을 만들기 위해 표준 드릴을 사용하기 전에 알루미늄 호일로 플레이트를 덮어.플레이트가 준비되면 무균 기술을 사용하여 PBS의 5~10밀리리터로 A-431 세포 배양을 세척합니다. 그리고 세포가 분리 될 때까지 섭씨 37도에서 트립신의 2 밀리리터로 세포를 배양합니다. 세고 후, 배양 배지에서 밀리리터당 4번째 세포로 세포를 5배 10배, 각 분석판의 각 웰에 40마이크로리터의 종자하였다.시드 후 각 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 우물 바닥을 가로질러 세포의 균질한 분포를 보장합니다. 플레이트 엣지 효과를 최소화하기 위해, 세포가 라미나르 유동 후드 뒤쪽의 실온에서 20분 동안 분석 플레이트의 바닥에 정착한 후 37°C와 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 사용자 지정 가습 챔버에 플레이트를 배치하도록 한다. 실험 당일, 플레이트 와셔를 사용하여 각 우물에서 배지를 흡인시합니다.그리고 적절한 실험적 우물에 적절한 실험 농도에 관심 있는 화합물의 30 마이크로리터를 첨가한다. 통기성 플레이트 씰로 화합물 처리 분석 플레이트를 밀봉하십시오. 그리고 30 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.열 과제에 세포를 노출하려면 먼저 수조를 적절한 실험 온도로 설정하고, 우물 내온도를 모니터링하기 위한 온도대 온도계와 함께 분석 플레이트와 동일한 양의 매체를 포함하는 밀봉되지 않은 더미 플레이트를 욕조에 배치합니다. 적절한 실험 온도에 도달하면 각 분석 판에서 통기성 씰을 제거하고 단단한 접착제 알루미늄 호일로 플레이트를 다시 밀봉하여 수조에서 후속 가열 중에 우물에 물이 누출되지 않도록하십시오. 플레이트 프레임 내에서 드릴링된 구멍을 액세스할 수 있도록 유지합니다.분석 플레이트와 새로운 더미 플레이트를 수조에 넣고 플레이트의 바닥이 수면쪽으로 기울어져 플레이트 아래에서 남은 공기를 강제로 밀어 내고 새로운 더미 플레이트의 온도를 모니터링합니다. 접시의 균일 한 가열은 분석 성능에 매우 중요합니다. 밑에 기포가 갇혀 있지 않습니다 있도록 수조에 접시를 배치주의하십시오.3분 후, 분석 전에 5분 동안 실온 수의 두 번째 수조에서 플레이트를 즉시 식힙니다. 세포를 이미지화하기 위해 먼저 16%의 파라포름알데히드 10마이크로리터를 실온에서 20분 배양하기 위해 분석 판에 직접 추가합니다. 고정 기간이 끝나면 플레이트 세탁기에 PBS 300 마이크로리터로 셀을 세척하고 실온에서 10분 동안 0.1%NP40의 마이크로리터 20을 추가합니다.인큐베이션의 끝에서, 입증 된 대로 세포를 씻어. 그리고 실온에서 1시간 동안 1%소 세럼 알부민 또는 BSA의 15 마이크로리터로 세포를 차단한다. 다음으로, 플레이트 와셔를 사용하여 차단 혈청을 흡인시키고, 1차 항체의 마이크로리터를 실온에서 1시간 배양에 적합한 우물에 첨가한다.인큐베이션이 끝나면 PBS 300 마이크로리터로 각각 잘 세척하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 항체의 10 마이크로리터로 세포를 라벨로 부착한다. 세포의 핵 염색의 경우 실온에서 10 분 동안 각 우물에 적절한 핵 염료 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 입증 된 바와 같이 PBS에서 세포를 씻어.실온에서 30분 동안 셀 마스크 10마이크로리터로 셀에 라벨을 부착합니다. 다음에 PBS와 마지막 세척. 그런 다음 60 마이크로리터의 신선한 PBS를 각 우물에 분배하고 이미징이 될 때까지 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉합니다.세포를 이미지화하기 위해 자동 레이저 자동 초점을 사용하여 10배 의 목표에 따라 적절한 형광 채널을 사용하여 고함량 이미저에 4개의 이미지를 캡처하고 획득 하는 동안 비닝을 적용합니다. 그런 다음 이미지를 메타데이터와 함께 16비트 그레이스케일 도트-티프 파일로 저장합니다. 항체 인식은 리간드 결합에 의해 유도될 수 있는 표적 단백질의 형성 변화에 의해 중단되어서는 안 된다.예를 들어, BIRB796은 긴 오프 레이트를 가지며, 표적 교합의 정량화는 항원 검색 단계를 적용하여서만 가능하다. 양성 및 음극성 대조군 화합물로 처리된 세포를 위한 대표적인 열 응집 곡선 실험은 다양한 온도에서 화합물을 가진 세포의 처리 후 전형적인 단백질 안정화 범위를 보여줍니다. 여기서 전형적인 이더스말 투여량 반응 지문 실험은 실험 화합물의 상이한 투여량에 반응하여 단백질 안정화의 대표적인 범위를 입증하는 것으로 나타났다.표적 단백질의 새로운 바인더를 식별하기 위한 화합물 스크리닝을 위한 이더말 열 과제의 적용은 표적 단백질 안정화를 확인하기 위해 안타의 더체말 투여 응답 지문 전에 한 번에 한 농도로 많은 수의 화합물을 분석할 수 있게 한다. 이 절차를 시도하는 동안, 열 도전의 길이 및 온도와 같은 정확한 실험 조건이 화합물의 관찰 된 효능에 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 파라포름알데히드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.그리고 이 절차를 수행하는 동안 제도적 안전 지침을 따르는 것과 같은 예방 조치는 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

우리는 섭동에 반응하여 이종 세포 집단 역학을 연구하기위한 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 원고는 heterocellular population의 여러 세포 phenotypes의 강력한 특성화를위한 정량적 인 데이터 세트를 견고한 방식으로 생산하는 이미징 기반 플랫폼을 설명합니다.

정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

여기서, 우리는 림프절 (LN) 저온 절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. LN 부착 종양 세포는 가벼운 현미경 검사법에 의해 용이하게 규각되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 종양 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공합니다.

림프절 저온 절에서 종양 세포 접착의 정량화

이 기사는 1) 초점 접착의 크기와 수 및 2) 세포 형상 지수및 MCF7 세포의 컨런트 단층의 공초점 이미지로부터의 분포를 정량화하는 것을 설명합니다.

MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

TGT 표면은 성장 인자 - 인테그린 누화를 연구하는 혁신적인 플랫폼입니다. 유연한 프로브 설계, 부착 리간드의 특이성, 자극 조건의 정밀한 조절은 EGFR-인테그린 인터플레이의 강력한 정량적 평가를 가능하게 한다. 결과는 EGFR을 '메카노-조직자' 튜닝 인테그린 역학으로 강조하여 초점 접착 어셈블리 및 세포 확산에 영향을 미칩니다.

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

학습하세요 고내용 이미징을 활용한 마이크로플레이트 CETSA 프로토콜로 약물-표적 결합을 측정하는 방법을. 화학생물학 및 신약개발에서 화학적 프로브 검증에 필수적인 기술입니다.

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

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