Name: 정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 학습하세요 정량적 이미징 기법을 이용하여 이종 세포 집단의 동적 표현형 반응을 평가하고 하위 집단을 식별하는 방법을. H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포를 사용하여 세포 간 상호작용과 약물 반응을 분석합니다.

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이 연구는 국립 암 연구소 (NCI) 보조금 U54CA143798 및 U54CA143907에 의해 자금 지원을 받아 Dana-Farber Cancer Institute 및 Southern California 대학에서 물리 과학 종양 센터 (PS-OC)를 설립했습니다. SM Mumenthaler는이 작업 중 일부를 지원하는 PS-OC 트랜스 네트워크 상을 수상했습니다. 우리는 Operetta HCS 플랫폼을 기부 한 박애주 의자, 특히 Stephenson 가족, Emmet, Toni 및 Tessa에게 깊은 감사의 말을 전합니다. J. Foo 교수와 응용 분자 과학 센터 팀 : D. 임상 지침 및 멘토링을위한 Agus, 실험 디자인과의 의미있는 토론을위한 Patsch, R. Rawat, 이미지 분석 프로토콜 지원 , Operetta와의 기술 지원에 대한 J. Katz, 그리고 도움이되는 토론과 피드백을위한 P. Macklin과 D. Ruderman.

1. 세포 배양 참고 : 여기서 폐 섬유 아세포 (CCD - 19Lu GFP)와 공동 배양했을 때 EGFR 표적 제제 인 erlotinib에 대한 NSCLC 세포 (H3255)의 표현형 반응을 조사했습니다. 동일한 데이터 세트의 경우, 두 개의 세포 집단 (H3255 및 CCD-19Lu GFP)의 형광성 및 형태 학적 분류를 통해 일치도를 예시했습니다. 그러나 하나의 분류 방법 만 사용해야하고 응용 프로그램을 기반으로 선택해야합니다. <ol><li> 10 % 열 불 활성화 FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI - 1640 500 ML을 준비합니다. 참고 : 성장 매체와 보충제는 다른 세포 유형에 따라 필요에 따라 교체 할 수 있습니다. </li><li> 37 ℃에서 5 % CO 2의 순수한 개체로 10cm 3 판에 배양 한 다음 3-4 일마다 적절한 비율로 통과시킵니다. </li></ol> 2. 세포의 준비 <ol><li> 세포 현탁액을 준비하려면 c배지를 말리고 5 ML 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS에서 대기음을 제거하고 37 ° C로 가온 한 0.05 % 트립신 1 mL를 넣고 37 ° C에서 5 분간 (또는 세포가 더 이상 플레이트에 붙지 않을 때까지) 품어 둔다. </li><li> 트립신을 중화시키기 위해 H3255와 CCD-19Lu GFP 플레이트에 RPMI 4 mL를 넣고 세포 용액을 15 mL 원추형 튜브에 넣으십시오. </li><li> RT에서 5 분 150 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 상등액을 대기음으로 옮기고 원추형 튜브에 RPMI 배지 10 mL에 resuspend cell pellets를 뿌려 시딩 준비를하십시오. </li></ol> 3. 셀 도금 <ol><li> 씨 뿌리기를 표준화하기 위해 세포 수를 세십시오. <ol><li> 튜브를 반전시켜 용액에서 세포를 혼합합니다. microcentrifuge 튜브에 각 세포 현탁액 10 μL 피펫과 10 μL trypan 파란색을 추가합니다. </li><li> 이 용액 10 μL를 셀 계수 슬라이드에 넣고 자동 셀 카운터에 넣습니다. 참고 : 세포 계수의 다른 방법 ( 즉. 혈구 계)를 사용할 수있다. </li><li> 적어도 세 번이나 셀 카운트가 일치 할 때까지 셀 카운트를 반복하십시오. </li></ol></li><li> 멀티 웰 판에 씨앗 세포를 뿌린다. 참고 : 시드 할 플레이트 수는 이미지화 할 시점 수에 따라 다릅니다. 또는 세포가 histone-2B-GFP (또는 적절한 핵 분할을 제공하는 기타 안정한 렌티 바이러스 핵 염색제)로 형질 전환되면 한 번에 한 장의 플레이트를 재 이미징 할 수 있습니다. <ol><li> RPMI 100 μL에 총 1,500 세포 / 웰을 씨닝하십시오. H3255, CCD - 19Lu GFP 및 50 % H3255 + 50 % CCD - 19Lu GFP 세 세포 인구를 판금 세 세포 현탁액을 준비합니다. 각 시점마다 동일한 플레이트 셋업을 사용하여 각각을 3 번씩 수행하십시오. 참고 : 초기 시딩 밀도는 각 세포주 및 플레이트 크기에 맞게 최적화해야합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 3 x 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드. 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포 O / N을 품어. </li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> 4. 약물 투약 <ol><li> erlotinib 분말에 DMSO를 넣어 10mM 농도의 최종 erlotinib 저장 용액을 만듭니다. 참고 : 약물은 원하는대로 대체 할 수 있습니다. </li><li> 세포 배양 배지로 약물을 희석하여 10 μM에서 가장 높은 최종 농도의 최종 농도로 만들고 1:10 비율로 4 회 연속 희석하여 총 5 가지 약물 농도와 약물 관리 없음으로합니다. 참고 : DMSO의 농도가 가장 높은 약물 용량에서 0.1 % v / v와 같거나 초과하는 경우 관찰 된 효과가 DMSO 독성으로 인한 것이 아닌지 확인하기 위해 무 약물 대조군에 DMSO가 동량 포함되어야합니다. </li><li> 약 100 μL의 약물 용액을 적절한 웰에 피펫 팅하여 최종 약물 농도를 1 배로 희석한다. </li></ol> 5. 이미지 수집 참고 : 이미지는 0 일, 2 일 및 3 일에 획득했습니다. 세포 유형과 세포 과정에 따라 연구 할 때,원하는 시점들이 연구 될 수있다. <ol><li> 이미징을 준비하기 위해 세포를 얼룩지게하십시오. <ol><li> 염료 용액을 다음 최종 농도로 보충하십시오. <ol><li> 형광 기반 분류의 경우, 5 μg / ML 핵 얼룩과 PBS에 5 μm의 죽은 세포 얼룩을 준비합니다 ( 재료 표 참조). </li><li> 형태학 기반 분류의 경우, 5 μg / mL의 핵 염색, 5 μM의 죽은 세포 얼룩 및 PBS에서 5 μM의 세포 얼룩을 준비하십시오 ( 재료 표 참조). </li></ol></li><li> 각 우물에 20 μL 염료 솔루션을 추가하십시오. 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 30 분 동안 품어 낸다. </li></ol></li><li> 이미지 최적화 및 획득. <ol><li> 인큐베이터에서 잘 플레이트를 제거하고, 70 % EtOH와 플레이트의 하단을 닦아 및 이미징 챔버에 접시를 놓습니다. </li><li> &#39;설정&#39;탭에서 &#39;채널 선택&#39;아래의 &#39;+&#39;버튼을 클릭하여 채널을 추가하십시오.이미지 ( 즉, brightfield, 핵 얼룩, 죽은 세포 얼룩, GFP 및 RFP 신호). </li><li> &#39;레이아웃 선택&#39;을 클릭하고 초점 평면을 확인하기 위해 0 μm에서 시작하여 20 μm에서 끝나는 2 μm마다 z- 스택 테스트 이미지를 가져옵니다. &#39;높이&#39;아래의 모든 채널에 대해이 거리를 입력하십시오. </li><li> 강도를 평가하고 노출 시간을 최적화하려면 각 채널 아래의 &#39;Snapshot (스냅 샷)&#39;을 클릭하십시오. 필요에 따라 &#39;시간&#39;아래에서 더 높거나 낮은 값을 입력하십시오. </li><li> 화면의 오른쪽에서 플레이트 구조도의 적절한 우물 (이미지 할 수 있음)을 강조 표시합니다. 아래의 우물 도식에서 유사한 방식으로 이미지화 할 25 개의 필드를 강조 표시하십시오. </li><li> &#39;실험 실행&#39;에서 왼쪽 탭의 &#39;플레이트 이름&#39;에있는 플레이트를 식별하고 &#39;시작&#39;버튼 (아래)을 클릭하여 전술 한 채널에서 그레이 스케일 TIFF 이미지를 생성하는 10X 대물 렌즈로 이미지 수집 프로토콜을 실행합니다. 참고 : 단계별 설치이미징 프로토콜의 폐색은 계측기마다 다를 수 있지만 매개 변수 값은 여전히 ​​최적화되어야합니다. </li><li> 2 일과 3 일에 이미징을 반복하십시오. </li></ol></li></ol> 6. 이미지 분석 참고 : 모든 이미지 분석은 독점 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 그러나 공개적으로 사용할 수 없기 때문에 CellProfiler 2.2 및 CellProfiler Analyst 2.0에 대한 간략한 프로토콜과 자세한 프로토콜이 보충 자료로 제공됩니다 (테스트 이미지는 이미 워크 플로를 테스트하기 위해 파이프 라인으로로드 됨). 이 실험의 이미지를 각 웰을 개별적으로로드 할 수 있도록 웰 단위로 그룹화했습니다. 아래의 CellProfiler 파이프 라인에는 각 이미지 파일 이름의 메타 데이터 정보를 구문 분석하는 정규 표현식이 포함되어있어 채널별로 이미지를 그룹화 할 수 있습니다. <ol><li> 오픈 소스 소프트웨어 다운로드 및 설치 : &#39;CellProfiler9; 및 &#39;CellProfiler Analyst&#39;. 설치 중에 모든 기본 옵션 및 애드온을 수락하십시오. </li><li> heterocellular 문화를 subpopulations로 분류하십시오. <ol><li> &#39;CellProfiler&#39;소프트웨어를 열고 &#39;파일&#39;| &#39;파이프 라인 가져 오기&#39;| &#39;From File&#39;을 선택하고 적절한 파일 (형광 기반 분류의 경우 &quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; , 형태 기반 분류의 경우 &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot;)을 선택하십시오. 참고 :이 파일에는 기본 이미지 처리 및 핵 / 셀 세분화를위한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이 세포들 사이에 고르지 않은 Hoechst 염색이 있었기 때문에 핵을 분할하고 확대 한 다음 낮은 강도의 핵을 분할 할 수 있도록 이미지를 가면 사용했습니다. <ol><li> 형광 기반 분류 파이프 라인을 선택하여 세포를 eGFP 강도에 따라 H3255 또는 CCD-19Lu로 분류하고 형태 특징을 계산합니다. 참고 : CCD-19Lu 세포는 GFP로 형질 도입되었다. </li><li> 모폴로지 기반 분류 파이프 라인을 선택하여 핵과 셀을 분류하고 모폴로지 기능을 계산합니다. 참고 : 분류를 위해서는 &#39;CellProfiler Analyst&#39;의 추가 다운 스트림 분석이 필요합니다. 죽은 세포는 형광에 기초한 분류를 통해 분류됩니다. </li></ol></li><li> 화면 왼쪽 하단의 &#39;출력 설정보기&#39;를 클릭하십시오. 분석 할 이미지 파일의 위치 ( &#39;기본 입력 폴더&#39;)와 추출 된 데이터의 대상 ( &#39;기본 출력 폴더&#39;)을 선택하십시오. </li><li> &#39;Analyze Images&#39;를 클릭하여 분석을 시작하십시오. 분석이 완료되면 &#39;확인&#39;을 클릭하고 &#39;기본 출력 폴더&#39;로 이동하여 계산 된 데이터를보십시오. 참고 : 예제 매개 변수 값 및 이미지는 Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf 에서 볼 수 있습니다. </li><li> 형태학 기반 분류 (only)의 경우 다음을 수행하십시오. <ol><li> &#39;CellProfiler Analyst&#39;소프트웨어를 열고 CellProfiler에서 생성 된 데이터베이스 속성 파일을 선택하고 &#39;열기&#39;를 클릭하십시오. </li><li> 화면 왼쪽 상단의 &#39;분류 자&#39;탭을 클릭하십시오. 실험에서 임의의 셀 이미지를 호출하려면 &#39;가져 오기&#39;를 클릭하십시오. 이미지가 분류되지 않은 창에 나타납니다. </li></ol></li><li> 세포를 적절한 bin으로 선택하고 끌어서 세포를 양성 (H3255) 또는 음성 (CCD-19Lu)으로 수동 분류합니다 ( 보충 파일 2-Pipeline.pdf : 그림 B 참조 ). 하위 집단 당 적어도 50 개의 세포를 분류 한 후 &#39;Train Classifier&#39;를 클릭 한 다음 &#39;Check Progress&#39;를 클릭하십시오. 참고 : 셀은 사용자가 감독하는 무작위 포리스트 시스템 학습 알고리즘 12 를 통해 분류됩니다. 정확도가 승인 된 임계 값 (&gt; 90 %)을 초과하지 않으면 &#39;CellProfiler&#39;에서 셀 세분화를 최적화하거나 셀을 classi에 적합하지 않을 수 있습니다형태학에 의해 fying. </li><li> 각 하위 집단에 대한 세포 계수가있는 표를 생성하려면 &#39;점수 모두&#39;를 클릭하십시오. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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위에서 설명한 프로토콜은 감소된 시약과 시간을 사용하면서 환경 교란에 대한 반응으로 여러 세포 유형의 표현형 역학에 대한 보다 포괄적인 통찰력을 제공함으로써 현재의 세포 생물학 분석을 개선합니다. 이 실험 설계의 주요 장점은 단일 설정으로 여러 표현형을 분석하고 단일 세포 수준에서 이러한 표현형을 특성화하는 정량적 데이터를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 플랫폼의 기술적 이점 중 하나는 다른 분석에 비해 초기 문제 해결이 쉽다는 것입니다. 이 방법은 이미지 기반이기 때문에 명백한 과잉/과소 파종에 대해 우물을 시각화할 수 있습니다. 실험 기간 동안 세포를 기하급수적인 성장 단계에 두는 것이 좋으며 영양 또는 공간적 제약에 의해 제한되거나 파종 부족으로 인한 노화로 인해 혼란스럽지 않습니다. 그렇지 않으면 실험 간에 출생률과 사망률을 재현하지 못할 수 있습니다. 참고로 CellPD는 출생률 및 사망률 계산을 위해 공개적으로 사용 가능한 프로그램입니다14. 또한 각 웰에 적절한 농도의 염료가 추가되었는지 여부를 시각화할 수 있습니다. 개별 웰의 피펫팅 문제로 인해 잘못된 분할 및 왜곡된 데이터가 발생할 수 있지만 앞서 언급한 프로토콜을 사용하면 쉽게 감지할 수 있습니다.
불행히도 모든 세포 유형이 이 응용 프로그램에 적합한 것은 아닙니다. 핵과 세포를 정확하게 분할할 수 있는 것이 중요하므로 보다 구형이거나 뭉친 구조로 조직된 세포의 분석은 적합하지 않을 수 있습니다. 일부 세포의 경우, 단일 세포의 초기 파종을 보장하기 위해 파종 전에 세포 여과기를 사용하는 것이 유리할 수도 있습니다. 또한 선형 분류기 기술은 형태학적 특징을 기반으로 쉽게 구별할 수 있는 세포 유형에만 적용할 수 있습니다. 
프로토콜의 성공을 위해서는 다운스트림 분석의 타당성이 이미지 품질에 따라 달라지기 때문에 먼저 이미징 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. 여기서는 고함량 스크리닝 플랫폼을 사용하여 실험을 수행했지만 모든 형광 현미경을 사용하여 이미지 획득을 수행할 수도 있습니다(자동화된 이미징 플랫폼은 처리량이 많은 접근 방식에 이상적임). 현미경이나 프로토콜에 문제가 없는지 확인하기 위해 각 이미징 시점 전에 테스트 이미지를 촬영해야 합니다. 신호 대 잡음비는 특히 분할에 사용될 채널(즉, 핵, 세포 염색)의 경우 높아야 합니다. 또한 최적의 초점면에서 이미지를 촬영하는 것이 중요합니다. 이미지의 초점이 맞지 않으면 분할이 훨씬 더 어려워지고 계산된 형태학적 특징이 부정확할 수 있습니다. 필드 간의 조명 차이는 이미지 분할에도 문제를 일으킬 수 있습니다. 밝기의 차이가 크면 임계값을 자동으로 선택하기가 어렵습니다. 또한 세포 사이에 이질적인 형광 강도가 있는 경우 단일 임계값이 이미지의 모든 세포를 충분히 분할하지 못할 수 있습니다. 이 분석에서 이러한 문제는 더 밝고 어두운 세포 집단 주위에 마스크를 만들고 각 집단을 개별적으로 분할함으로써 극복되었습니다. 
이 프로토콜에서 조사 중인 표현형은 살아있는, 죽은 표현형 및 형태학적 특성화로 제한되지만 다른 특징을 조사하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 기능적 유전 연구는 RNAi, 과발현 또는 기타 화학적 교란과 함께 추가될 수 있습니다. 
이 논문에서는 CAF의 존재 및 부재 하에서 엘로티닙에 대한 비소세포폐암 세포의 반응을 측정하는 프로토콜의 기능을 입증했습니다. 그러나 이것은 테스트할 수 있는 많은 세포 유형과 미세 환경 매개변수 중 하나의 예일 뿐입니다. 우리는 환자 종양에서 분리된 1차 세포를 포함하여 다른 세포 유형 및 약물 연구와 함께 사용하도록 이 프로토콜을 확장했습니다13,15.

세포 기반 분석은 기초 연구 및 약물 개발 환경에서 중요한 역할을했습니다. 그러나 이러한 표준 분석법의 한계는 시험관 내 및 임상 데이터 간의 불일치와 대부분의 약물이 FDA 승인을받지 못함에 따라 점차 명백해졌습니다. 여기에서, 우리는 관련있는 공동 발생 환경 자극에 대한 응답으로 heterocellular phenotypes를 동시에 분석하기 위해 정량 이미징을 이용하는 새로운 방법을 제시한다. 세포 생존 능력을 측정하는 데 사용되는 전통적인 세포 기반 분석에는 trypan blue exclusion assay, MTT / MTS 및 Annexin V-FITC 유동 세포 계측법 염색이 있습니다. Trypan Blue 배제 분석은 간단하면서도 저렴하면서 많은 수의 세포가 필요하며 시간이 많이 걸리고 사용자 편향 1의 영향을 받는다. MTT 및 MTS는 미토콘드리아 신진 대사 속도 측정을 통해 간접적으로 세포 생존력을 측정합니다. 그러나, 대사 활성세포의 종류는 다른 배양 조건 (배지 또는 산소 농도)에 의해 영향을받을 수 있으며 부정확 한 결과를 초래하고 세포 유형 및 조건 2 , 3에서의 표준화를 방지합니다. 이 기술의 또 다른 주요 단점은 여러 세포 유형을 구별 할 수 없다는 것입니다. 대부분의 생물학적 시스템은 이종 세포입니다. 유동 세포 계측법은 여러 세포 집단을 구별 할 수있는 능력을 가지고 있지만 세포 표지가 필요하고 동적 시료 채취가 어려우며 부착 세포를 사용할 때이 응용 프로그램은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉽습니다. 형태 학적 변화를 포함하여 다른 중요한 세포 표현형은 환경 적 자극에 반응하여 발생하지만 전통적인 세포 기반 검정법에 의해 포착되지 않는다. 형태 학적 특성화 및 샘플 간의 유사성 매핑을 통해 셀 상태를 프로파일 링하는 것은 강력하고 편향되지 않은 도구로서기본 세포 생물학 및 약물 발견을 포함하여 기본 및 번역 연구의 여러 측면에 대한 새로운 통찰력 제공 4 . 또한, 종양 세포 형태는 종양 아형 5 및 공격성 6 과 상관 관계가있는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 세포의 특징을 연구하고 특정 환경 섭동과 관련되는 방법을 연구하는 것은 큰 관심사입니다. 또한, 형태 학적 특징의 차이를 이용하여 공동 배양 시스템에서 부분 집단을 구별 할 수있다. 형광 라벨링 세포는 고유 한 세포 특성을 변경하고 시간이 오래 걸리므로 세포 유형을 분류하는 추가 방법이 유리합니다. 현미경 기반 이미징은 다중화되고 정량적이며 견고한 방식으로 세포 표현형을 프로파일 링하는 대체 방법입니다. 이 원고에서는 Evolutio를 강조하기 위해 양적 이미징 파이프 라인을 적용합니다종양 내 이종 세포 집단의 역 동성 우리는 비소 세포 폐암 (NSCLC) 세포와 종양에서 발견되는 가장 흔한 간질 세포 유형 인 암 관련 섬유 아세포 (CAF) 간의 상호 작용에 중점을 둡니다. CAF는 종양 발생, 진행 및 치료 반응에 관련되어왔다. 따라서 CAF가없는 경우 종양 세포에서 표현형 검사를 수행하는 것은 오해의 소지가있을 수 있습니다 ( 7 , 8 , 9) . 특히 우리는 NSCLC의 임상 치료에 종종 사용되는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적으로하는 작은 분자 인 erlotinib에 대한 반응으로 종양 세포에 대한 CAF의 효과를 평가했다. 우리는 평가를 위해 고화질 심사 플랫폼 및 관련 이미지 분석 소프트웨어를 활용했습니다. 그러나이 방법론을 다른 연구자가 이용할 수 있도록하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용하는 유사한 다운 스트림 프로토콜을 개발했습니다.CellProfiler 10 및 CellProfiler Analyst 11 . 대부분의 이미지 기반 고감도 스크리닝 분석은 특정 기기 모델에 특화된 상용 소프트웨어로 분석됩니다. 기본 알고리즘이 종종 독점적이기 때문에 다른 소프트웨어를 사용하는 다른 랩에서 결과를 복제하기가 어렵습니다. 이 이미지 기반 파이프 라인을 사용하여 형광 및 형태 기반 분류를 사용하는 약물 치료에 대한 이종 세포 배양의 각 하위 집단의 세포 증식, 사망 및 형태를 측정했습니다. 다음 프로토콜은 복잡한 셀룰러 프로세스를 프로빙하는 강력한 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>배지 보충제</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>배지 보충제</td></tr><tr><td>TC20</td><td>Biorad</td><td>1450102</td>세포 <td>계수기</td></tr><tr><td>TC20 슬라이드(트리판 블루</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td>세포 포함) 카운터 슬라이드</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>투명 바닥 검은색 플레이트</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>317275-100ML</td><td>용액</td></tr><tr><td>약물 Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H21491</td><td>핵 염료</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td>dead cell stain</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td>전장세포 염색</td></tr><tr><td>Operetta 고함량 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institue</td><td>버전 2.2.0 (rev 9969f42)</td><td>http://cellprofiler.org/releases/</td></tr> <tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td></td><td></td><td>모든 세포 배양 인큐베이터가 적합할 것입니다 - 세포는 37 &ordm 하에서 배양되었습니다. 5% CO2.</sub</td></tr><tr><td>>15mL Falcon 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>10cm2 세포 배양 플레이트</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr></tbody></table>

정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

세포 과정은 복잡하고 여러 세포 유형과 환경 사이의 상호 작용으로 발생합니다. 현존하는 세포 생물학 기술은 종종이 상호 작용의 정확한 해석을 허용하지 않습니다. 정량적 이미징 기반 접근법을 사용하여, 우리는 환경 적 자극의 변화에 ​​대한 이종 세포 집단의 동적 표현형 반응 ( 즉, 형태학 변화, 증식, 세포 사멸)을 특성화하기위한 고 내용 프로토콜을 제시한다. 우리는 형광 강도 또는 응용 프로그램에 따라 고유의 형태학 기능을 기반으로 세포 유형을 구별하는 우리의 능력을 강조 표시합니다. 이 플랫폼은 전통적인 세포 생물학 분석보다 짧은 시간, 적은 양의 시약 및 오류 가능성을 활용하면서 섭동에 대한 하위 집단 반응의보다 포괄적 인 특성 분석을 가능하게합니다. 그러나 어떤 경우에는 세포 집단이 복잡한 cellu를 기준으로 확인 및 정량하기가 어려울 수 있습니다lar 기능과 추가 문제 해결이 필요합니다; 우리는 프로토콜에서 이러한 상황의 일부를 강조합니다. 우리는 암 모델에서 약물에 대한 반응을 사용하여이 응용 프로그램을 시연합니다. 그러나, 그것은 다른 생리적 인 과정에 더 넓게 쉽게 적용될 수있다. 이 프로토콜은 공동 문화 시스템 내에서 하위 집단을 식별하고 각각 외부 자극에 대한 특정 반응을 특성화 할 수있게합니다.

우리는 총 4,050 개의 개별 이미지를 위해 3 개의 플레이트에서 25 개 / 웰, 54 웰 / 플레이트 (3 개 세포 집단 x 6 약물 농도 x 3 복제본)로 구성된 이미지 세트를 생성했습니다. 실험 과정 동안 생성 된 이미지 세트는 독점 소프트웨어 (물질 표 참조)를 사용하여 세포의 다양한 양적 특성 ( 즉 형태, 형광)을 추출하여 세포 부분 집단을 분류하는 데 사용할 수있었습니다. 그러나 사용 된 상업용 소프트웨어에는 액세스가 제한되어 있기 때문에 CellProfiler 및 CellProfiler Analyst의 유사한 다운 스트림 파이프 라인이 만들어졌습니다. 부분 집단으로의 이종 세포 분류 핵은 DNA 염색 (여기에서는 Hoechst)을 기반으로 확인되고 분절화되었으며 세포 집단은 형광 또는 MO( 그림 1 ). 형광 기반 분류의 경우, 섬유 아세포 (CCD-19Lu)는 이전에 GFP- 렌티 바이러스로 형질 도입되었다. GFP 강도 수준은 각각의 핵에 대해 측정되었고, 허용 된 문턱 값 (배경 신호에 기초) 이상으로 계산 된 것들은 CCD-19Lu로 분류되었지만 아래의 것들은 종양 세포 (H3255)로 분류되었다. 형태학 기반의 분류를 위해, 세포는 이전에 무독성 세포 염색 (물질 표 참조)으로 염색되었으며 이것은 세포질을 확인하고 분할하는 데 사용되었습니다. 기계 학습 알고리즘은 각 집단으로부터 ~ 50-100 개의 세포로 훈련되었다. 형태 학적 특징은 개체군간에 현저히 다르며, CCD-19Lu와 H3255 세포를 구별하기 위해 선형 분류기를 설계하는 데 사용되었다. 형광 및 형태 분류 프로토콜은 두 세포 포퓰을 구별하는데있어서 97.4 % (n = 1403) 일치 하였다약물 치료 조건 (1μM erlotinib)에서 92.5 % (n = 916)의 일치 성을 보였다 ( 그림 2 ). 부분 집단의 표현형 분석 세포 유형을 구별하는 것 외에도 우리는 각 하위 집단의 표현형 특성을 특성화하는 것을 목표로했다. 멀티 플렉스 분석은 시간과 시약을 절약하고, 일관성을 추가하며, 연구중인 시스템에 관한 추가 정보를 제공합니다. 많은 잠재적 인 표현형 산출물이 있으며, 관심있는 질문에 따라 선택해야한다. 여기 erlotinib 치료에 대한 반응으로 세포 형태와 생존력의 변화가 조사되었다. 3 일간의 약물 치료 후 핵 영역의 감소와 H3255 세포 ( 도 3A )의 세포 면적의 증가가 관찰되었다. 핵 면적의 평균 차이&quot;약물 없음&quot;및 &quot;약물 치료&quot;집단은 양면성 2 형 (균등 변이) t 검사 ( p = 7.92 x 10 -16 )를 통해 통계적으로 유의미한 것으로 나타났다. 우리는이 관찰이 약물 치료에 의해 부과 된 스트레스에 대한 세포 반응이라는 가설을 세웠다. 그것은 또한 임상 적으로 심각한 영향을 미치기 때문에 약물이 세포 독성 ( 즉 , 시간에 따라 죽은 세포의 수가 증가 함) 또는 세포 분열 ( 즉 , 시간에 따른 세포 출생의 수를 감소 시킴) 효과를 갖는지 여부를 연구하는 것도 중요합니다. 예를 들어, 세포 증식 억제 약물 효과는 성장 정지를 유도하지만 종양에서 세포를 제거하지 않으므로 일단 약물이 제거되면 암세포가 세포 증식을 재개 할 가능성이 있습니다. 약물 효과는 종종 문맥, 농도 및 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 이전에 erlotinib가 하나의 세포 유형에서 세포 독성 반응을 이끌어내는 것을 관찰하면서 ac다른 13 에서의 반응. 전통적인 생존 능력 분석은 상대적 세포 수를 산출하므로 성장 정지와 세포사를 구별하지 않습니다. 여기에서, 죽은 세포는 propidium iodide stain을 기반으로 확인되었다 ( 그림 3B ). H3255 세포에 대한 erlotinib의 세포 독성 및 세포 증식 억제 효과는 약물 치료 후 사망 수의 증가와 출생 수의 감소와 함께 관찰되었다 ( 그림 3C ). 죽은 세포의 수가 1 일 후에 세포 누출로 인해 떨어지게된다는 사실은 주목할 가치가있다. CCD-19Lu 세포는 약물에 의해 영향을받지 않았다. 이 플랫폼의 또 다른 이점은 정량적 데이터 생성입니다. 예를 들어, 우리의 공동 배양 실험에서, H1155 세포를 함유하지 않은 3 일 동안, 또는 erlotin으로 H3255 세포의 초기 부 집단이 2,817 (87.9 %) 또는 396 (57.2 %) 인 것으로 밝혀졌다( 그림 4 ). 우리는 상대적인 비율 대신에 실제 세포 수를 산출 할 수 있기 때문에 (유동 세포 계측법에서와 같이), 약물 치료 동안의 조성의 변화는 H3255 세포의 감소 때문이고 CCD-19Lu의 증가는 아니라고 결론 지었다. 실험적으로 평가하기 어렵고 세포 유형에 따라 다를 수있는 세포 허가 (cell clearance)로 인해 사망률이 과소 평가 될 수 있다는 것은 아무 가치가 없습니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> 그림 1 : 이미지 분석 프로토콜 개요. 형태 기반 분류 또는 형광 기반 분류를 사용하여 이종 세포 집단을 분류 할 수있는 두 가지 잠재적 다운 스트림 이미지 분석 파이프 라인. 스케일 바 = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하십시오.</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 e를 누르십시오. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> 도표 2 : 형태학과 형광 근거한 분류 사이의 일치. ( A ) 두 분류 프로토콜의 중첩을 나타내는 일치도 그림. 동일한 세포는 형태학 및 형광 기반 분류를 사용하여 H3255로 분류되었다. 두 가지 프로토콜은 치료되지 않은 세포의 97.4 % (n = 1403)와 erlotinib로 치료 한 세포의 92.5 % (n = 916) (참고 : 흰색 영역은 너무 작아서 시각화 할 수 없음)에 대해 일치했다. ( B ) 형광 기반 및 형태 기반 분류 사이의 양호 및 불량 일치의 예를 묘사하는 10X 이미지. 흰색 화살표는 플랫폼간에 불일치하게 분류 된 셀을 가리 킵니다. 입력 이미지 : 파란색 - 핵 (Hoechst); 녹색 - CCD19Lu (GFP). Classi약물 이미지 : 적색 - H3255; 녹색 - CCD-19Lu. 스케일 바 = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> 그림 3 : 단일 실험 설정에서 멀티 플렉스 된 표현형 측정. ( A ) 핵 및 세포 면적과 같은 형태 학적 특징은 약물의 존재 및 부재하에 단일 세포 수준에서 계산되었다. 참고 : 100 μm 2 보다 작은 셀 면적은 잔해로 간주되어 분석에서 제외됩니다. 상자 플롯은 1 분위 및 3 분위 범위와 95 % 신뢰 구간 오차 막대를 갖는 중앙값을 나타냅니다. ( B ) H3255 (청색) 및 CCD-19Lu (녹색) 세포를 공동 배양하고 프로피트의 강도에 따라 사균을 확인 하였다ium iodide stain (적색)으로하고 10X 대물 렌즈를 사용하여 이미지화합니다. 눈금 막대 = 1 mm (상단 패널); 100 μm (하단 이미지). ( C ) 살아있는 세포와 죽은 세포의 총 수는 약물 치료 여부에 관계없이 3 일 동안 계산되었으며, erlotinib의 추가로 생존 세포 수와 죽은 세포의 양이 현저히 감소했다. 오차 막대는 세 번의 반복을 바탕으로 한 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> 그림 4 : 시간의 경과에 따른 집단 기반의 역학. 약물 사용 여부에 따라 0 일 또는 3 일째에 H3255 (파란색) 및 CCD-19Lu (녹색)가 포함 된 우물의 대표적인 10X 이미지. 각 하위 집단에 속하는 세포를 세었고 비례 원형 차트는표본 전체의 인구 구성 변화. 스케일 바 = 1 mm (중간 패널, shpwn in, eftmost 패널), 1 mm (상단 이미지), 100 μm (하단 이미지). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 섭동에 반응하여 이종 세포 집단 역학을 연구하기위한 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 원고는 heterocellular population의 여러 세포 phenotypes의 강력한 특성화를위한 정량적 인 데이터 세트를 견고한 방식으로 생산하는 이미징 기반 플랫폼을 설명합니다.

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

본 방법론의 전반적인 목표는 하위 집단을 구분하면서, 섭동에 대한 이종 세포 집단의 역동적인 표현형 반응을 정량적으로 평가하는 것입니다. 대부분의 생리적 상호작용은 여러 세포 유형이 존재하는 환경에서 일어납니다. 이 방법은 세포 생물학자가 이질적인 세포들이 동일한 환경적 압력에 어떻게 반응하는지, 그리고 서로 다른 세포들이 서로에게 어떤 영향을 미치는지 평가하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술은 여러 가지 장점이 있는데, 다양한 세포 유형을 구분할 수 있으며 출생률, 사망률 및 형태학적 역동성을 포함한 하위 집단의 동시 분석이 가능합니다. 본 프로토콜은 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있지만, 여기서는 화학요법제인 Erlotinib으로 처리한 H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포 세포를 사용하여 작업 흐름을 시연하겠습니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 따라 튜브에 세포 현탁액을 준비한 후, 튜브를 반전시켜 용액 내 세포를 혼합함으로써 파종을 표준화하십시오.그런 다음 각 세포 현탁액 10 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, trypan blue 10 µL를 첨가합니다. 이 용액 10 µL를 세포 계수 슬라이드에 넣고 슬라이드를 자동 세포 계수기에 삽입합니다. 세포 계수를 최소 3회 반복하거나, 얻어진 수치가 일관될 때까지 반복합니다.멀티 채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 RPMI에 현탁된 총 1,500개의 세포를 분주합니다. 각 시점별로 동일한 플레이트 설정을 적용하여 각 세포 현탁액을 3반복으로 플레이팅합니다. 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.DMSO를 Erlotinib 분말에 첨가하여 10 millimolar Erlotinib 스탁 용액을 제조합니다. 그 다음, 세포 배양 배지를 사용하여 약물을 최종 최고 농도인 10 micromolar의 2배 농도로 희석합니다. 약물을 1:10 비율로 4회 연속 희석하여, 총 5가지의 약물 농도와 약물 무처리 대조군을 준비합니다.배지 내 최종 약물 농도가 1x 희석 농도가 되도록, 96-웰 플레이트의 해당 웰에 약물 용액 100 µL를 피펫팅합니다. 그다음 형광 기반 분류를 위해 세포를 염색하려면, PBS에서 5 µg/mL의 핵 염색액과 5 µM의 사멸 세포 염색액을 준비합니다. 형태학 기반 분류의 경우, PBS에서 5 µg/mL의 핵 염색액, 5 µM의 사멸 세포 염색액 및 5 µM의 세포 염색액을 준비합니다.각 웰에 염료 용액 20 µL를 첨가합니다. 그런 다음, 빛이 차단된 상태에서 샘플을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이미지를 얻으려면 70% ethanol로 플레이트 바닥을 닦고 플레이트를 이미징 챔버에 넣습니다.설정 탭의 채널 선택 항목에서 플러스 버튼을 클릭하여 이미지에 적절한 채널을 추가합니다. 레이아웃 선택 항목에서 0 µm부터 시작하여 20 µm에서 끝날 때까지 2 µm 간격으로 테스트 이미지의 z-stack을 설정하여 초점 평면을 확인합니다. 각 채널의 snapshot을 클릭하여 강도를 평가하고 노출 시간을 최적화합니다.필요에 따라 시간 항목에 더 높거나 낮은 값을 입력하십시오. 후속 분석의 정확성을 보장하기 위해 세포 내 핵이 초점에 맞아야 합니다. 플레이트 도식에서 적절한 웰을 강조 표시하십시오.그런 다음 웰 도식에서 이미징할 25개 영역을 유사한 방식으로 강조 표시합니다. 실험 실행 항목에서 플레이트 이름에 해당 플레이트를 지정한 후, 시작 버튼을 클릭하여 10배 대물렌즈로 이미지 획득 프로토콜을 실행함으로써 선택한 채널의 그레이스케일 TIFF 이미지를 생성합니다. 오픈 소스 소프트웨어인 CellProfiler와 CellProfiler analysis를 설치한 후, CellProfiler를 열고 파일, 가져오기, 파일에서 파이프라인을 클릭하여 적절한 파일을 선택합니다.형광 기반 분류 파이프라인을 선택하여 EGFP 강도에 따라 세포를 H3255 또는 CCD19LU로 분류하고 형태학적 특징을 계산합니다. '출력 설정 보기'를 클릭한 후, 분석할 이미지 파일의 위치와 추출된 데이터의 저장 경로를 선택합니다. 분석을 실행하기 전에, 파라미터 값을 확인하기 위해 테스트 모드에서 프로토콜을 검증해야 합니다.핵과 세포 분할을 정확하게 수행하는 것이 중요합니다. 본 프로토콜은 다양한 핵 염색 강도를 가진 세포를 식별하고, 핵 확장 시 적용되는 픽셀 값이 가장 강한 DNA 염색을 가진 핵까지 마스킹할 수 있을 만큼 충분히 크면서도, 주변의 다른 핵까지 마스킹하지 않을 정도로 작게 설정되도록 설계되었습니다. 형광을 기반으로 세포군을 분류하려면, 먼저 GFP 강도 범위를 재조정(rescale)한 다음, 식별된 각 핵의 GFP 강도를 측정하고 사용자가 정의한 임계값에 따라 객체를 분류하십시오.다음으로, 분석을 시작하려면 이미지 분석(analyze images)을 클릭하십시오. 분석이 완료되면 기본 출력 폴더로 이동하여 계산된 데이터를 확인하십시오. 형태학 기반 분류의 경우, Cell Profiler에서 적절한 프로토콜을 실행하여 전체 세포 형태학적 특징을 생성하십시오.Open Cell Profiler Analysis 소프트웨어를 실행하고, Cell Profiler에서 생성된 데이터베이스 속성 파일을 선택한 후 열기를 클릭합니다. 화면 왼쪽 상단의 Classifier 탭을 클릭합니다. 실험에서 무작위로 세포 이미지를 불러오려면 fetch를 클릭하십시오. 그러면 미분류(unclassified) 창에 이미지가 나타납니다.세포를 적절한 빈으로 선택하여 드래그함으로써, 여기서는 H3255 또는 CCD19LU를 나타내는 양성 또는 음성으로 수동 분류합니다. 하위 집단당 최소 50개의 세포를 분류한 후, Train Classifier를 클릭하고 Check Progress를 클릭하십시오. 마지막으로 Score All을 클릭하여 각 하위 집단의 세포 수가 포함된 표를 생성합니다.H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포의 이종세포 저온 배양에서, DNA 염색을 기반으로 핵을 식별하고 분할하였습니다. 세포 집단은 인위적으로 유도된 형광 또는 형태학적 차이에 기반하여 세포 유형을 식별하는 머신러닝 알고리즘 학습을 통해 분류되었습니다. 형광 기반 방법론과 형태학 기반 방법론 사이에는 높은 일치도가 나타났습니다.두 가지 분류 방법이 동일한 이미지에 독립적으로 적용되었으며, 처리되지 않은 군과 처리된 군에서 각각 97.4%와 92.5%의 일치율을 보였습니다. 본 연구에서는 세포 형태의 변화와 Erlotinib 처리에 대한 반응을 조사하였습니다. 약물 처리 3일 후, H3255 세포에서 핵 면적의 감소와 세포 면적의 증가가 관찰되었습니다.이는 세포 사멸로 인한 결과일 가능성이 있었습니다. Erlotinib이 세포에 세포독성(cytotoxic) 또는 세포정지(cytostatic) 효과를 나타내는지 테스트하기 위해, propidium iodide 염색을 기반으로 사멸된 세포를 식별하였습니다. H3255 세포에 대한 Erlotinib의 세포독성 및 세포정지 효과가 모두 관찰되었으며, 약물 처리 후 사멸 세포 수는 증가하고 생성 세포 수는 감소하였습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 연속되지 않은 두 시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 기능 유전체학을 조사하는 추가적인 질문을 해결하기 위해 RA 간섭이나 CRISPR와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 암 생물학 분야의 연구자들이 여러 암 유형에서 기질 세포가 종양 진행에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.이 영상을 시청한 후에는 환경 자극에 대한 이종 세포 반응을 연구하는 방법, 특히 현미경 기반 이미징 데이터를 고처리량 방식으로 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

명시야와 미분 간섭 대비 이미지의 조합을 통해 세포 질량, 부피 및 밀도의 정량적 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

이 연구는 신경계 구조 및 복구를 위한 장기 생체 내 이식 연구에 적용하기 전에 조작된 줄기 세포와 그 행동을 신속하게 특성화하는 실험 플랫폼을 설명합니다.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

우리는 세포 수를 식별하기 위해 일반화 가능한 영역 기반 이미지 분석 접근법을 활용하는 방법을 제시합니다. 상이한 세포 집단의 분석은 적응형 알고리즘 내에서 별개의 세포 유형 사이의 유의한 세포 높이 및 구조 차이를 이용하였다.

대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

학습하세요 정량적 이미징 기법을 이용하여 이종 세포 집단의 동적 표현형 반응을 평가하고 하위 집단을 식별하는 방법을. H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포를 사용하여 세포 간 상호작용과 약물 반응을 분석합니다.

정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

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