정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

이 방법론의 전반적인 목표는 subpopulation을 구별하면서 tubation에 대한 heterocellular population의 동적 표현형 반응을 정량적으로 평가하는 것입니다. 대부분의 생리적 상호 작용은 여러 세포 유형이 있을 때 발생합니다. 이 방법은 세포 생물학자가 이종 세포가 동일한 환경 압력에 어떻게 반응하는지, 그리고 서로 다른 세포가 서로 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술은 여러 세포 유형을 구별하고 출생률과 사망률 및 형태학적 역학을 포함한 하위 집단에 대한 동시 분석을 가능하게 하는 몇 가지 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있지만, 화학요법제인 Erlotinib으로 처리된 H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포 세포를 사용하여 작업 흐름을 시연할 것입니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 튜브에서 세포 현탁액을 준비한 후 튜브를 반전시켜 용액에서 세포를 혼합하여 파종을 표준화합니다.

그런 다음 각 세포 현탁액 10마이크로리터를 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅하고 10마이크로리터의 트리판 블루를 추가합니다. 10마이크로리터의 용액을 세포 계수 슬라이드에 피펫팅하고 슬라이드를 자동화된 세포 카운터에 삽입합니다. 셀 개수를 세 번 이상 반복하거나 얻은 개수가 일치할 때까지 반복합니다.

멀티 채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 웰에 있는 100마이크로리터의 RPMI에 총 1, 500개의 세포를 파종합니다. 각 시점에 대해 동일한 플레이트 설정으로 각 cell suspension을 3회씩 플레이트화합니다. 세포를 밤새 배양합니다.

Erlotinib 분말에 DMSO를 첨가하여 10 밀리몰 Erlotinib 원액을 만듭니다. 그런 다음 세포 배양 배지를 사용하여 약물을 가장 높은 최종 농도인 10마이크로몰의 2배로 희석합니다. 약물을 1:10 비율로 4회 연속 희석하여 총 5개의 약물 농도와 약물 통제를 제공합니다.

배지에서 희석된 1x의 최종 약물 농도를 위해 96웰 세포 플레이트의 적절한 웰에 100마이크로리터의 약물 용액을 피펫팅합니다. 그런 다음 형광 기반 분류를 위해 세포를 염색하기 위해 PBS에서 밀리리터당 5마이크로그램의 핵 염색과 5마이크로몰의 사세포 염색을 준비합니다. 형태학 기반 분류를 위해 PBS에서 핵 염색 밀리리터당 5마이크로그램, 5마이크로몰 사체 염색 5마이크로몰 및 5마이크로몰 세포 염색을 준비합니다.

각 웰에 20마이크로리터의 염료 용액을 추가합니다. 그런 다음 빛을 차단한 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 이미지를 획득하려면 70% 에탄올을 사용하여 플레이트의 바닥을 닦고 플레이트를 이미징 챔버에 넣습니다.

채널 선택 아래의 설정 탭에서 더하기 버튼을 클릭하여 이미지에 적절한 채널을 추가합니다. 레이아웃 선택에서 0미크론에서 시작하여 20미크론에서 끝나는 2미크론마다 테스트 이미지의 z 스택을 설정하여 초점면을 식별합니다. 각 채널 아래의 스냅샷을 클릭하여 강도를 평가하고 노출 시간을 최적화합니다.

필요에 따라 시간 아래에 더 높거나 더 낮은 값을 입력합니다. 다운스트림 분석의 정확성을 보장하기 위해 세포의 핵에 초점이 맞춰져야 합니다. 플레이트 회로도에서 적절한 웰을 강조 표시합니다.

그런 다음 우물 회로도에서 유사한 방식으로 이미지화할 25개의 필드를 강조 표시합니다. run experiment(실험 실행)에서 plate name(플레이트 이름)에서 플레이트를 식별한 다음 시작 버튼을 클릭하여 10x objective로 이미지 획득 프로토콜을 실행하여 선택한 채널에서 그레이스케일 TIFF 이미지를 생성합니다. 오픈 소스 소프트웨어, CellProfiler 및 CellProfiler 분석을 설치한 후 CellProfiler를 열고 파일, 가져오기, 파일에서 파이프라인을 클릭하고 적절한 파일을 선택합니다.

형광 기반 분류 파이프라인을 선택하여 EGFP 강도에 따라 세포를 H3255 또는 CCD19LU로 분류하고 형태학적 특징을 계산할 수 있습니다. , 출력 설정 보기를 클릭한 다음 분석할 이미지 파일의 위치와 추출된 데이터의 대상을 선택합니다. 분석을 실행하기 전에 테스트 모드에서 프로토콜을 테스트하여 매개변수 값을 확인해야 합니다.

핵 및 세포 분할이 정확해야 합니다. 이 프로토콜은 다양한 핵 염색을 가진 세포를 식별하고, 핵이 확장되는 픽셀 값이 DNA 염색이 가장 높은 핵을 마스킹할 수 있을 만큼 충분히 크지만 주변 핵을 마스킹하지 않을 만큼 작은지 확인하도록 설계되었습니다. 형광을 기반으로 집단을 분류하려면 먼저 GFP intensity range를 재조정한 다음 식별된 각 핵의 GFP intensity를 측정하고 사용자 정의 임계값에 따라 개체를 분류합니다.

그런 다음 이미지 분석을 클릭하여 분석을 시작합니다. 분석이 완료되면 기본 출력 폴더로 이동하여 계산된 데이터를 확인합니다. 형태학 기반 분류의 경우 세포 프로파일러에서 적절한 프로토콜을 실행하여 전체 세포 형태학 특징을 생성합니다.

Cell Profiler Analysis 소프트웨어를 열고 Cell Profiler에서 생성된 데이터베이스 속성 파일을 선택한 다음 열기를 클릭합니다. 화면 왼쪽 위에 있는 Classifier 탭을 클릭합니다. 실험에서 임의의 셀 이미지를 호출하려면 가져오기를 클릭하면 이미지가 분류되지 않은 창에 나타납니다.

셀을 양수 또는 음수로 수동으로 분류하며, 여기서는 셀을 선택하고 적절한 bin으로 드래그하여 H3255 또는 CCD19LU 나타냅니다. 하위 모집단당 최소 50개의 셀을 분류한 후 Train Classifier를 클릭한 다음 Check Progress를 클릭합니다. 마지막으로 Score All을 클릭하여 각 하위 모집단에 대한 셀 수가 있는 테이블을 생성합니다.

H3255 종양 및 CCD19LU 섬유아세포 세포의 이종세포 저온 배양에서 DNA 염색을 기반으로 핵을 식별하고 분할했습니다. 세포 집단은 인위적으로 유도된 형광 또는 형태학적 차이에 따라 세포 유형을 식별하기 위한 기계 학습 알고리즘 훈련을 통해 분류되었습니다. 형광과 형태학 기반 방법론 사이에는 높은 일치점이 있습니다.

두 가지 분류 방법은 동일한 이미지에 독립적으로 암시되었으며 치료되지 않은 인구와 치료된 인구 집단에 대해 각각 97.4%와 92.5%가 일치했습니다. 여기에서는 세포 형태의 변화와 Erlotinib 치료에 대한 반응을 조사했습니다. 약물 치료 3일 후, H3255 세포에서 핵 면적의 감소와 세포 면적의 증가가 관찰되었습니다.

이것은 아마도 세포의 사멸 때문일 것입니다. Erlotinib이 세포에 세포독성 또는 세포증식 효과가 있는지 여부를 테스트하기 위해 프로피듐 요오드화물 염색을 기반으로 죽은 세포를 식별했습니다. H3255 세포에 대한 Erlotinib의 세포독성 및 세포증식 억제 효과가 모두 관찰되었으며, 약물 치료 후 사망자 수가 증가하고 출생 수가 감소했습니다.

일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 연속되지 않은 두 시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 RA 간섭 또는 CRISPR과 같은 다른 방법을 수행하여 기능 유전체학을 조사하는 추가 질문을 해결할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 여러 암 유형의 종양 진행에 대한 기질 세포의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 환경 자극에 대한 이종세포 반응을 연구하는 방법, 특히 고처리량 방식으로 현미경 기반 이미징 데이터를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.