정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

본 방법론의 전반적인 목표는 하위 집단을 구분하면서, 섭동에 대한 이종 세포 집단의 역동적인 표현형 반응을 정량적으로 평가하는 것입니다. 대부분의 생리적 상호작용은 여러 세포 유형이 존재하는 환경에서 일어납니다. 이 방법은 세포 생물학자가 이질적인 세포들이 동일한 환경적 압력에 어떻게 반응하는지, 그리고 서로 다른 세포들이 서로에게 어떤 영향을 미치는지 평가하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술은 여러 가지 장점이 있는데, 다양한 세포 유형을 구분할 수 있으며 출생률, 사망률 및 형태학적 역동성을 포함한 하위 집단의 동시 분석이 가능합니다. 본 프로토콜은 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있지만, 여기서는 화학요법제인 Erlotinib으로 처리한 H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포 세포를 사용하여 작업 흐름을 시연하겠습니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 따라 튜브에 세포 현탁액을 준비한 후, 튜브를 반전시켜 용액 내 세포를 혼합함으로써 파종을 표준화하십시오.

그런 다음 각 세포 현탁액 10 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, trypan blue 10 µL를 첨가합니다. 이 용액 10 µL를 세포 계수 슬라이드에 넣고 슬라이드를 자동 세포 계수기에 삽입합니다. 세포 계수를 최소 3회 반복하거나, 얻어진 수치가 일관될 때까지 반복합니다.

멀티 채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 RPMI에 현탁된 총 1,500개의 세포를 분주합니다. 각 시점별로 동일한 플레이트 설정을 적용하여 각 세포 현탁액을 3반복으로 플레이팅합니다. 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.

DMSO를 Erlotinib 분말에 첨가하여 10 millimolar Erlotinib 스탁 용액을 제조합니다. 그 다음, 세포 배양 배지를 사용하여 약물을 최종 최고 농도인 10 micromolar의 2배 농도로 희석합니다. 약물을 1:10 비율로 4회 연속 희석하여, 총 5가지의 약물 농도와 약물 무처리 대조군을 준비합니다.

배지 내 최종 약물 농도가 1x 희석 농도가 되도록, 96-웰 플레이트의 해당 웰에 약물 용액 100 µL를 피펫팅합니다. 그다음 형광 기반 분류를 위해 세포를 염색하려면, PBS에서 5 µg/mL의 핵 염색액과 5 µM의 사멸 세포 염색액을 준비합니다. 형태학 기반 분류의 경우, PBS에서 5 µg/mL의 핵 염색액, 5 µM의 사멸 세포 염색액 및 5 µM의 세포 염색액을 준비합니다.

각 웰에 염료 용액 20 µL를 첨가합니다. 그런 다음, 빛이 차단된 상태에서 샘플을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이미지를 얻으려면 70% ethanol로 플레이트 바닥을 닦고 플레이트를 이미징 챔버에 넣습니다.

설정 탭의 채널 선택 항목에서 플러스 버튼을 클릭하여 이미지에 적절한 채널을 추가합니다. 레이아웃 선택 항목에서 0 µm부터 시작하여 20 µm에서 끝날 때까지 2 µm 간격으로 테스트 이미지의 z-stack을 설정하여 초점 평면을 확인합니다. 각 채널의 snapshot을 클릭하여 강도를 평가하고 노출 시간을 최적화합니다.

필요에 따라 시간 항목에 더 높거나 낮은 값을 입력하십시오. 후속 분석의 정확성을 보장하기 위해 세포 내 핵이 초점에 맞아야 합니다. 플레이트 도식에서 적절한 웰을 강조 표시하십시오.

그런 다음 웰 도식에서 이미징할 25개 영역을 유사한 방식으로 강조 표시합니다. 실험 실행 항목에서 플레이트 이름에 해당 플레이트를 지정한 후, 시작 버튼을 클릭하여 10배 대물렌즈로 이미지 획득 프로토콜을 실행함으로써 선택한 채널의 그레이스케일 TIFF 이미지를 생성합니다. 오픈 소스 소프트웨어인 CellProfiler와 CellProfiler analysis를 설치한 후, CellProfiler를 열고 파일, 가져오기, 파일에서 파이프라인을 클릭하여 적절한 파일을 선택합니다.

형광 기반 분류 파이프라인을 선택하여 EGFP 강도에 따라 세포를 H3255 또는 CCD19LU로 분류하고 형태학적 특징을 계산합니다. '출력 설정 보기'를 클릭한 후, 분석할 이미지 파일의 위치와 추출된 데이터의 저장 경로를 선택합니다. 분석을 실행하기 전에, 파라미터 값을 확인하기 위해 테스트 모드에서 프로토콜을 검증해야 합니다.

핵과 세포 분할을 정확하게 수행하는 것이 중요합니다. 본 프로토콜은 다양한 핵 염색 강도를 가진 세포를 식별하고, 핵 확장 시 적용되는 픽셀 값이 가장 강한 DNA 염색을 가진 핵까지 마스킹할 수 있을 만큼 충분히 크면서도, 주변의 다른 핵까지 마스킹하지 않을 정도로 작게 설정되도록 설계되었습니다. 형광을 기반으로 세포군을 분류하려면, 먼저 GFP 강도 범위를 재조정(rescale)한 다음, 식별된 각 핵의 GFP 강도를 측정하고 사용자가 정의한 임계값에 따라 객체를 분류하십시오.

다음으로, 분석을 시작하려면 이미지 분석(analyze images)을 클릭하십시오. 분석이 완료되면 기본 출력 폴더로 이동하여 계산된 데이터를 확인하십시오. 형태학 기반 분류의 경우, Cell Profiler에서 적절한 프로토콜을 실행하여 전체 세포 형태학적 특징을 생성하십시오.

Open Cell Profiler Analysis 소프트웨어를 실행하고, Cell Profiler에서 생성된 데이터베이스 속성 파일을 선택한 후 열기를 클릭합니다. 화면 왼쪽 상단의 Classifier 탭을 클릭합니다. 실험에서 무작위로 세포 이미지를 불러오려면 fetch를 클릭하십시오. 그러면 미분류(unclassified) 창에 이미지가 나타납니다.

세포를 적절한 빈으로 선택하여 드래그함으로써, 여기서는 H3255 또는 CCD19LU를 나타내는 양성 또는 음성으로 수동 분류합니다. 하위 집단당 최소 50개의 세포를 분류한 후, Train Classifier를 클릭하고 Check Progress를 클릭하십시오. 마지막으로 Score All을 클릭하여 각 하위 집단의 세포 수가 포함된 표를 생성합니다.

H3255 종양 세포와 CCD19LU 섬유아세포의 이종세포 저온 배양에서, DNA 염색을 기반으로 핵을 식별하고 분할하였습니다. 세포 집단은 인위적으로 유도된 형광 또는 형태학적 차이에 기반하여 세포 유형을 식별하는 머신러닝 알고리즘 학습을 통해 분류되었습니다. 형광 기반 방법론과 형태학 기반 방법론 사이에는 높은 일치도가 나타났습니다.

두 가지 분류 방법이 동일한 이미지에 독립적으로 적용되었으며, 처리되지 않은 군과 처리된 군에서 각각 97.4%와 92.5%의 일치율을 보였습니다. 본 연구에서는 세포 형태의 변화와 Erlotinib 처리에 대한 반응을 조사하였습니다. 약물 처리 3일 후, H3255 세포에서 핵 면적의 감소와 세포 면적의 증가가 관찰되었습니다.

이는 세포 사멸로 인한 결과일 가능성이 있었습니다. Erlotinib이 세포에 세포독성(cytotoxic) 또는 세포정지(cytostatic) 효과를 나타내는지 테스트하기 위해, propidium iodide 염색을 기반으로 사멸된 세포를 식별하였습니다. H3255 세포에 대한 Erlotinib의 세포독성 및 세포정지 효과가 모두 관찰되었으며, 약물 처리 후 사멸 세포 수는 증가하고 생성 세포 수는 감소하였습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 연속되지 않은 두 시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 기능 유전체학을 조사하는 추가적인 질문을 해결하기 위해 RA 간섭이나 CRISPR와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 암 생물학 분야의 연구자들이 여러 암 유형에서 기질 세포가 종양 진행에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.

이 영상을 시청한 후에는 환경 자극에 대한 이종 세포 반응을 연구하는 방법, 특히 현미경 기반 이미징 데이터를 고처리량 방식으로 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.