마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가
2019년 5월 10일
이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.
1차 보고서는 시냅스 숫자가 변경되고 기능을 분석할 수 있는 대부분의 모델에서 바실라 막의 특정 주파수 영역을 정확하게 찾는 스트레스 중요성입니다. 특정 주파수 영역의 달팽이관 국소화는 코클레오그램 데이터와 함께 주파수 맵을 사용하여 안정적으로 수행됩니다. 현미경은 몇몇 연구 결과에 통찰력을 제공합니다.
그것은 달팽이관 신경 병증이 특히 청력 감소, 이명 및 hyperacusis의 앞에 1 차적인 초기 사건이다는 개념을 지원합니다. 마취 된 8 주 된 성인 C57 블랙 6J 남성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후. 전기및 음향 차폐실에 37도 섭씨 열패드에 마우스를 놓습니다.
다음으로, 두개골정골의 피부 밑에 3밀리미터의 깊이를 가진 피하 20 밀리미터 28 게이지 바늘 기록 전극을 놓습니다. ipsilateral parotid 영역의 기준 전극, 측정된 귀의 정점에, 그리고 모순된 parotid 영역에서 지상 전극. 마우스 옆에 원뿔 모양의 팁이 있는 2센티미터 플라스틱 튜브가 장착된 폐쇄된 필드 스피커를 배치하고 팁을 외부 외이도에 맞춥니다.
청각 브레인스템 응답 또는 ABR 레코딩의 경우 5~10데시벨의 음압 레벨 단계에서 음압 레벨을 90에서 10데시벨로 낮추는 톤 주사위를 생성합니다. 이 단계에서 응답은 증폭, 필터링 및 평균화됩니다. 각 주파수에서, ABR 임계값을 결정, 이는 시각적 검사에 의해 명확하게 식별 할 수있는 하나 이상의 구별 파도와 신뢰할 수있는 ABR 레코딩을 초래 최소한의 음압 수준입니다.
ABR 녹음 후, 복부 측에서 황소를 노출하고 달팽이관에 액세스 할 수있는 날카로운 가위로 황소를 엽니 다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 측두골 뼈를 제거 하 고 stapes 동맥을 분리. 그런 다음 타원형 창에서 스테이프를 제거하고 둥근 창 막을 파열시킵니다.
13밀리미터 27 게이지 바늘의 끝을 부드럽게 회전하여 달팽이관 정점에 작은 구멍을 뚫은 후, 미세한 기울어진 파이펫을 사용하여 창을 통해 4%의 파라포름알데히드를 부드럽게 세척 공간으로 플러리림프공간으로 플러시합니다. 다음으로, 세척당 차가운 신선한 0.1 어어 PBS로 세척당 5분 동안 뼈를 세 번 헹구습니다. 그 다음에는 실온에서 4시간 동안 10%EDTA를, 수평 셰이커에서 분당 20회 회전하는 뼈를 탈화합니다.
잠복이 끝나면 해부 된 현미경으로 탈하된 측두골을 신선한 0.1 어금니 PBS로 옮기습니다. 3및 5 듀몬트 집게와 27 게이지 바늘을 사용하여 정압, 중간 및 기저 달팽이 영역을 차례로 해부하십시오. 면도날을 사용하여 나선형 인대를 따라 작은 일련의 컷을 만들고 지각 막과 Reissner의 막을 제거하십시오.
또한 나선형 림푸스를 포함한 나머지 청각 상피를 개별 달팽이관으로 해부하여 전체 마운트 준비를 위해 회전합니다. 그런 다음 광 현미경의 40X 오일 목표를 사용하여 눈조각에 250 마이크로미터 스케일로 바실라 멤브레인 길이를 측정합니다. 그것은 내부 머리 세포의 스테레오실리아를 따라 조정할 수 있습니다.
해부 후 각 달팽이관은 개별 2.5 밀리리터 원심분리관으로 변합니다. 회전기의 실온에서 1시간 동안 PBS에서 10%의 염소 세럼으로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션이 끝나면 200 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 해부 현미경하에서 용액을 제거하십시오.
1차 항문체로 5%염소 세럼과 PBS를 0.1%트리톤 X-100으로 1회 회전기에서 4도에서 배양한다. 다음 날 아침, 세척당 0.1 대구어 PBS로 5분간 조직 샘플을 3회 헹구어 잔류 1차 항체를 제거한다. 그런 다음 PBS에서 5%염소 세럼으로 희석된 적절한 이차 항체로 시편을 0.1%트리톤 X-100에서 0.1%트리톤 X-100으로 표시하여 회전기의 실온에서 2~3시간 동안 빛으로부터 보호한다.
인큐베이션이 끝나면 시료를 0.1 mm PBS로 세 번 세척하고 표본을 0.1 mmm PBS를 포함하는 개별 35 mm 플레이트로 옮겨냅니다. DAPI 보충 장착 매체를 슬라이드에 놓고 PBS에서 장착 매체로 시편을 전송합니다. 커버의 가장자리 한 개를 각 슬라이드에 놓고 놓아 커버가 부드럽게 떨어지게 합니다.
그런 다음 슬라이드를 밤새 섭씨 4도에서 슬라이드 상자에 건조시십시오. 표본을 이미지화하려면 적절한 레이저와 63X 고해상도 오일 침수 렌즈가 있는 공초점 현미경을 사용하여 각 달팽이관 회전에서 8마이크로미터 공초점 Z 스택을 획득합니다. 시냅스 말장난 카운트의 경우, 0.3 마이크로미터 스텝 크기로 Z 스택을 설정하여 내부 모발 세포의 전체 길이에 걸쳐 모든 시냅스 말장난을 이미지화하고 Z 스택에 포함된 puncta를 병합하여 Z 액세스 프로젝션을 얻습니다.
병합된 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램으로 가져옵니다. 각 세포에 대한 시냅스 말크타 수를 계산하기 위해 특정 주파수 영역에서 각 Z 스택의 시냅스 총 수를 DAPI 양성 내부 모발 세포의 수로 나눕니다. 각 특정 주파수 영역에서, 9~11개의 내부 모발 세포를 포함하는 상이한 현미경 필드의 3개의 심상에서 시냅스 말크타를 평균합니다.
사이토셀레탈 아키텍처와 시냅스 지역화를 더 잘 시각화하려면 브러시 도구를 사용하여 개별 내부 모발 세포의 시냅스 구조 및 분포를 시각적으로 평가합니다. 사전 시냅스 리본과 포스트냅스 수용체 패치의 병치를 검사하려면 직사각형 윤곽 도구를 사용하여 리본 주변의 복셀 공간을 추출하고 이미지 커팅을 사용하여 개별 리본을 분리합니다. 그런 다음 이미지 및 이미지 크기를 클릭하여 쌍이 있는 시냅스와 고아 리본을 식별하는 데 사용할 수 있는 이 미니어처 프로젝션의 축소판 배열을 얻습니다.
이 대표적인 실험에서 마우스의 모든 10개는 자극의 주파수에 따라 음압 수준당 25 및 70 데시벨 사이의 톤 버스트에 대한 응답으로 ABR 임계값을 나타냈다. 이 실험에 대한 청력 임계값은 달팽이관 정점으로부터의 거리의 약 43%에 해당하는 16킬로헤르츠에서 가장 낮았으며, 이는 다른 달팽이관 지역에서 음향 감도가 현저히 감소한다는 것을 시사합니다. 청각 상피의 전체 탈것은 세 조각으로 해부되고 길이는 달팽이관 정점에서 백분율 거리로 측정되고 변환됩니다.
각 달팽이관 회전의 바실라 멤브레인의 주파수 위치는 로그리스믹 기능을 사용하여 계산됩니다. 성인 마우스의 정상적인 귀에서 면역 염색은 시냅스 리본과 글루타민트 수용체 패치의 병치 쌍을 보여줍니다. 세포 당 8 ~20 쌍의 내부 모발 세포의 바소포 측막 표면을 연구합니다.
말장난의 대부분은 정상적인 귀에 나란히 배치 된 쌍으로 나타나지만 고아 리본은 높은 배율에서 드물게 관찰되지 않습니다. 내부 헤어 셀 리본 시냅스의 수는 16킬로헤르츠 지역에서 가장 높으며, 이 위치에서의 거리가 증가함에 따라 현저히 감소한다. 이 절차 동안 기억해야 할 가장 중요한 것은 달팽이관 기저막의 무결성을 보장해야한다는 것입니다.
우리는 기술적 숙련도에 도달할 때까지 정확성을 강조해야 합니다. 이 절차에 따라, 진통 신경병증이 측정에 의해 복구 될 수 있는지 여부를 대답하기 위해 유전자 치료를 수행 할 수 있습니다. 이 측정은 달팽이관 신경병증을 탐구하기 위한 더 넓은 기술입니다, 1 차적인 초기 사건이 청력 손실, 이명 및 hyperacusis를 가진 것과 연관되는 경우에.
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개요
이 연구는 정상 마우스의 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 상세히 설명하며, 노이즈 유도 및 연령 관련 코클레아 시냅스병증 모델에 적용 가능합니다. 시냅스 수와 기능의 변화를 평가하기 위해 달리기 코클레아의 특정 주파수 영역을 정확히 위치 파악하는 것의 중요성을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 코클레아 시냅스병증
- 청각 뇌간 반응
배경
- 리본 시냅스를 이해하는 것은 청각 과정과 청력 상실을 연구하는 데 중요합니다.
- 코클레아 신경병증은 종종 이명과 고민감과 같은 상태를 앞서갑니다.
- 기존 방법론은 코클레아 구조와 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.
연구 목적
- 마우스 모델에서 리본 시냅스의 형태학 및 기능성을 평가합니다.
- 기존 문헌과 코클레아 상태에 대한 연구 결과를 상관시킵니다.
- 청각 반응을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발합니다.
사용된 방법
- 이 연구는 C57BL/6J 마우스에서 청각 뇌간 반응(ABR)의 생체 내 측정을 사용합니다.
- 마우스는 코클레아에 접근하고 시냅스 점을 측정하기 위해 일련의 수술 및 실험 절차를 거칩니다.
- 조직학적 기술에는 항체 라벨링 및 세부 이미지를 위한 콘포컬 현미경 사용이 포함됩니다.
- 주요 단계에는 ABR 기록, 코클레아 해부 및 시냅스 계산이 포함됩니다.
주요 결과
- 이 프로토콜은 내이 유모세포의 시냅스 변화를 정량화할 수 있게 합니다.
- 기능성을 평가하기 위해 시냅스 구조의 상세한 시각화를 가능하게 합니다.
- 연구 결과는 관심 있는 특정 주파수 영역에서 중요한 시냅스 생리학적 변화를 나타냅니다.
결론
- 이 연구는 코클레아 리본 시냅스 변화를 평가하는 효과적인 방법을 보여줍니다.
- 청각 질환의 기저에 있는 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움을 줍니다.
- 얻은 통찰은 청력 관련 장애에 대한 표적 중재에 기여할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding cochlear ribbon synapse integrity is critical for identifying early biomarkers of sensorineural hearing loss and related auditory disorders. This protocol enables frequency-specific assessment of synaptic structure and function, supporting target validation in preclinical models of cochlear synaptopathy. By linking morphological changes to functional auditory readouts, it enhances predictive confidence in de-risking therapeutic interventions for hearing-related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic density and structural integrity as a functional readout for cochlear neuropathy.
- Operational Value: Provides a standardized method to quantify synaptic puncta per inner hair cell across defined cochlear regions.
- Translational Value: Supports hypothesis testing for gene therapy or pharmacological interventions aimed at rescuing synaptic function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative synaptic puncta counts that can be normalized to inner hair cell numbers for comparative analysis.
- Reproducibility: Uses confocal imaging and Z-stack projection to ensure consistent visualization and counting of synaptic structures.
- Scalability: Applicable to multiple cochlear turns and frequency regions, enabling regional mapping of synaptic changes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early events in sensorineural hearing loss where synaptopathy precedes threshold shifts.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of synaptic loss with auditory brainstem response wave I amplitudes to assess functional impact.
- Preclinical Continuity: Supports longitudinal evaluation from discovery through validation stages of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing a quantifiable, histology-based endpoint that complements functional auditory testing in preclinical studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven evaluation of synaptic alterations in response to genetic, pharmacological, or environmental perturbations.
- Screening: Enables development of standardized assays for synaptic density that support compound screening in ototoxic or noise-exposed models.
- Analytics: Delivers quantitative outputs (synaptic puncta per cell, ABR wave I amplitude) that allow dose-response and genotype-phenotype correlations.
- Translational Research: Bridges structural and functional data to support go/no-go decisions in preclinical advancement of hearing loss therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing synaptic integrity across diverse models of cochlear neuropathy.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by providing direct evidence of synaptic preservation or loss in vivo.
- Operational Value: Standardizes synaptic evaluation through immunostaining, confocal imaging, and normalized counting protocols.
- Strategic Value: Improves risk-adjusted decision-making by identifying early biomarkers of synaptic dysfunction before hearing threshold changes.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of candidates based on synaptic rescue potential, reducing late-stage failure in auditory indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cochlear dissection, immunostaining, and confocal microscopy for accurate synaptic visualization.
- Dependent on specialized instrumentation including microtomes, cryostats, and high-resolution oil immersion lenses.
- Necessitates standardization across teams for tissue preparation, antibody incubation, and imaging parameters to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cochlear anatomy and frequency mapping when extrapolating data across models or strains.
- Limited by the need for terminal procedures, restricting longitudinal sampling in the same animal.
