Name: 마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 배우세요 마우스 달팽이관 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가 방법을. ABR 측정과 공초점 현미경을 활용하여 특정 주파수 영역의 시냅스 변화를 정량 분석하고 청각 질환의 기전을 규명합니다.

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이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (81770997, 81771016, 81830030); 베이징 자연 과학 재단과 베이징 교육위원회 (KZ201810025040)의 공동 자금 조달 프로젝트; 베이징 자연 과학 재단 (7174291); 중국 박사 후 과학 재단 (2016M601067).

모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NRC / ILAR 가이드 (8 판)에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 자본 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다, 베이징, 중국.
1. 동물 선택
<ol><li>모든 실험에서 성인 C57BL/6J 수컷 마우스(8주 령)를 동물 모델로 사용하십시오. 참고: C57BL/6J 마우스는 Cdh23 전시의 스플라이스 변이체를 운반하는 청각 시스템에서 가속된 노화를 나타내며, 달팽이관의 기저 회전시 리본 시냅스의 40% 손실과 6개월의 중간 회전에서 10%의 손실로 반영되고, 그 다음에 는 급속한 감소가 뒤따랐습니다. 18세,19세의 전체 달팽이관에서이 손실의 증가 . 따라서, 우리는 청각 연구에 대 한 6 개월 이상 오래 된 C57BL/6J 마우스를 사용 하는 경우 주의 하는 것이 좋습니다. 마우스의 다른 균주는 특정 실험 목표에 따라 사용될 수있다.</li>
	<li>청력 평가 전에 외부 또는 중이 병리학을 배제하기 위해 전문 진단 포켓 이경을 사용하여 마우스를 검사합니다. 잠재적인 표시는 외부 청각 운하에 있는 액체 또는 고름, 현지 조직에 있는 빨갛게 그리고 팽윤, 및 고막 천공포함할 수 있습니다. 참고: 이것은 드물게 발생하더라도, 일단 확인된, 외부 또는 중이 질병을 가진 마우스는 제외되어야 합니다.</li>
</ol>2. 청력 평가
<ol><li>케타민 염산염 (100 mg / kg)과 자일라진 염산염 (10 mg / kg)의 혼합물의 복강 내 주입을 사용하여 마우스를 마취. 고통스러운 자극 (예 : 발가락 꼬집반사)을 통해 마취의 깊이를 판단하십시오. 참고: 발가락 꼬집반사가 완전히 결석하면, 동물은 청각 검사를 위한 마취의 적당한 깊이에 도달했습니다. 양측 ABR 기록에 더 많은 시간이 필요한 경우, 원래 마취면을 복원하기 위해 마취제의 낮은 복용량 (원래 복용량의 5 분의 1)을 투여하십시오. 마취 과다 복용을 피하기 위해주의, 이 쥐에 죽음으로 이어질 수 있습니다.</li>
	<li>마취된 동물의 체온을 37.5°C에서 유지하여 더모어굴링 가열 패드를 사용한다. 마취된 동물을 청력 검사 전반에 걸쳐 간섭을 피하기 위해 전기 및 음향 차폐실에 놓습니다. 참고: 마취 후 저체온증으로 인한 사망을 방지하기 위해 동물이 완전히 깨어날 때까지 전체 절차 동안 생리적 온도를 유지하십시오.</li>
	<li>두개골의 정점에 피상 바늘 전극 (20mm, 28 G)을 놓고, 측정 된 귀 (기준 전극)의 피나 아래 의 원소 쪽 지각 영역과 경측 parotid 영역 (접지 전극)에 3mm 깊이를 배치합니다. 마우스 헤드의 피부 아래, 각각20.</li>
	<li>밀폐형 스피커를 사용하여 원뿔 모양의 팁이 있는 2cm 플라스틱 튜브를 통해 음향 자극을 수행합니다. 팁을 외부 외이도21에맞춥게 합니다. 참고: 기록 및 기준 전극의 전기 임피던스가 3km(보통 1kohm) 미만인지 확인합니다. 임피던스가 높으면 전극의 삽입 부위를 변경하거나, 전극을 알코올로 청소하거나, ABR 파진폭의 변경을 피하기 위해 전극을 교체하십시오.</li>
	<li>ABR 레코딩의 경우 톤 핍(3ms 지속 시간, 1ms 상승/하강 시간, 21.1/s, 주파수: 4-48kHz)을 생성하고 5\u201210 dB SPL 단계20에서90dB에서 10dB로 SPL을 감소시로 표시합니다. 이 단계에서 응답은 증폭(10,000배), 필터링(0.1-3 kHz), 평균(1,024개의 샘플/자극 수준)입니다. 참고: A벌은 10dB 단계에서 각 자극 수준에 대해 수집되며 임계값 근처의 추가 5dB 단계가 있습니다.</li>
	<li>각 주파수에서, ABR 임계값을 결정하며, 이는 최소한의 SPL을 지칭하여 육안 검사에 의해 명확하게 식별될수 있는 하나 이상의 구별가능한 파를 가진 신뢰할 수 있는 ABR 기록을 초래한다(도 1). 참고: 일반적으로 파형의 일관성을 보장하기 위해 임계값 주위의 낮은 SPL에 대한 프로세스를 반복해야 합니다. 응답 임계값은 파형이 관찰될 수 있는 가장 낮은 자극 수준이며, 5dB의 감소가 파형의 실종으로 이어질 때.</li>
</ol>3. 달팽이관 조직 처리
<ol><li>ABR 기록 후, 자궁 경부 탈구를 통해 마취 된 마우스를 안락사시키고, 그들을 참수하고, 복부 쪽에서 불라를 노출시키고, 날카로운 가위로 열어 달팽이관에 접근하십시오.</li>
	<li>미세 한 집게를 사용하여 측두엽 뼈를 제거하고, 테이프 동맥을 분리하고, 타원형 창에서 테이프를 제거하고, 둥근 창 막을 파열시킵니다. 바늘 끝(13mm, 27G)을 부드럽게 회전시켜 달팽이관 의 정점에 작은 구멍을 만듭니다.</li>
	<li>4°C에서 하룻밤 동안 0.1M 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에 4% (wt/vol) 파라포름알데히드로 분리된 뼈를 고정합니다. 미세 팁 파이펫을 사용하여, 부드럽게 타원형 또는 둥근 창 (입구로) 및 정점 (출구로)에서 개구부를 응용 프로그램을 통해 주위 공간을 통해 고정을 플러시. 참고: 몇몇 단백질은 면역 표지를 위한 그들의 epitopes의 파괴를 피하기 위하여 고정의 짧은 기간을 요구합니다. 이러한 경우, 면역 성 화학에 대한 제조업체의 지침에 따라 실온 (RT)에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 뼈를 2 시간 동안 배양합니다. 고정은 또한 달팽이관피의 마우스 모형에서, 특히 나중 단계에서 비특이적인 염색 때문에 배경 잡음을 피하기 위하여 달팽이관 혈액을 제거하기 위하여 심장 관류를 통해 수행될 수 있습니다.</li>
	<li>0.1 M 차가운 PBS로 뼈를 5 분 동안 세 번 헹구어 잔류 파라 포름 알데히드를 제거합니다. 20 rpm에서 수평 셰이커에서 부드럽게 흔들어 서 4 시간 동안 RT또는 4 °C에서 24 시간 동안 10 % 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA)으로 뼈를 데칼합니다. EDTA는 중간에 새로 고칠 수 있습니다. 참고: Decalcification 시간은 EDTA및 사용자의 선호도의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. Decalcified 조직은 어느 정도의 인성을 유지해야하며, 이는 이후 단계에서 달팽이관 전체 마운트를 분리하는 것을 용이하게합니다. 시간뼈는 회전을 통해 10% EDTA에서 탈석될 수 있으므로 연구원들은 ABR 테스트 및 고정 실험에 따라 실험실을 떠날 수 있습니다. 탈석화 시간은 4°C에서 20~30시간 범위 내에서 유연하다.</li>
	<li>EDTA에서 0.1 M PBS로 1개의 데칼화된 측두골을 옮김. #3 #5, dumont 집게 및 27 G 바늘을 사용하여 상피, 중간 및 기저 달팽이관 영역을 차례로 해부한 다음 스테레오 해부 현미경으로 뼈에서 달팽이관을 해부합니다 (앞에서 설명한대로22). 면도날을 사용하여 나선형 인대를 따라 일련의 작은 상처를 만들고 지막과 Reissner의 멤브레인을 제거합니다(그림2). 참고: 해부된 달팽이관이 손상되지 않는 한, 이 프로세스는 개별 운영자의 일반적인 프로토콜에 따라 수정될 수 있습니다.</li>
	<li>또한 전체 마운트 준비를 위한 개별 달팽이관 회전 (정점, 중간 및 후크 영역이있는 베이스)로 나선형 사지를 포함한 나머지 청각 상피를 해부하십시오.</li>
	<li>가벼운 현미경의 40x 오일 목표하에서, IHCs의 스테레오실리아를 따라 조정할 수 있는 접안 렌즈에 배치된 250 μm 스케일로 바실라 멤브레인 길이를 측정합니다.</li>
	<li>모든 세그먼트 길이(세그먼트당 250 μm)를 추가하여 각 달팽이관 회전의 길이를 계산하고 각 회전의 길이를 합산하여 바실러 멤브레인의 총 길이를 이에 따라 계산합니다.</li>
	<li>후크 영역을 포함한 바실멤브레인의 총 길이를 달팽이관 정점으로부터의 거리에 따라 백분율로 변환합니다(0%는 달팽이관 정점, 100%를 달팽이관 염기로 의미함).</li>
	<li>이 거리를 로그개믹 함수(d(%)=1 - 156.5 + 82.5 × log(f)를 사용하여 달팽이관 특성 주파수로 변환하고, 주파수의 경사가 1.25 mm/옥타브인 데, 여기서 d는 달팽이관 정점으로부터 정규화된 거리가 퍼센트인 경우, f는 kHz의 주파수), 앞에서 설명한 대로5,6. 따라서 각 달팽이관 회전에 대한 바실러 멤브레인의 상응하는 영역에서의 주파수 범위를 획득할 수 있다.</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>해부 후, 각 달팽이관을 별도의 2.5 mL 원심분리기 튜브에 놓고 인큐베이터 달팽이관을 10% 염소 혈청/PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 회전자 에서 RT에서 1시간 동안 회전합니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 각 튜브에서 위의 차단/투과 솔루션을 제거하고 로터의 4 °C에서 하룻밤 동안 5% 염소 혈청/PBS/0.1% 트리톤 X-100에서 희석된 1차 항체로 시편을 배양합니다. 참고: 달팽이관 시냅스 리본의 면역 라벨링을 위해, 시냅스 마커 마우스 항-카르복실 말단 결합 단백질 2 IgG1(CtBP2, RIBEYE 스캐폴딩 단백질의 B 도메인 에 라벨링, 1:400) 및 후세포 마커 마우스 항글루타산 수용체 2를 사용하십시오. IgG2a (GluR2, AMPA 수용체의 소단위 라벨링, 1:200)23.</li>
	<li>0.1 M 차가운 PBS로 5 분 동안 3 회 헹구어 잔류 원발 항체를 제거하고 5 % 염소 혈청 / PBS / 0.1 % 트리톤 X-100에서 희석 된 이차 항체로 표본을 배양하여 회전자의 어둠 속에서 2 \u20123 h에 대한 RT. 참고: 염소 항 마우스 알렉사 플루어 568(IgG1, 1:500) 및 염소 항 마우스 알렉사 플루어 488(IgG2a, 1:500)을 사용하여 적절한 이차 항체 혼합물을 준비하며, 이는 단계 4.2에서 사용되는 1차 항체에 상보적이다. 시냅스 리본의 라벨링 효율을 향상하려면 특정 이차 항체를 선택하는 것이 좋습니다. 몇몇 실험실은 GluR2 면역 표지24를증가시키기 위하여 이차 항체로 인큐베이션을 확장합니다.</li>
	<li>0.1 M PBS로 5분 동안 3회 헹구어 잔류 이차 항체를 제거하고 시편을 2.5 mL 원심분리기 튜브에서 0.1 M PBS를 함유한 35mm 플레이트로 옮니다.</li>
	<li>4',6-디아미디노-2-페니린들올레(DAPI)를 포함하는 마운팅 매체를 슬라이드에 놓고 PBS에서 마운팅 매체로 시편을 옮니다. 슬라이드에 커버슬립의 한 쪽 가장자리를 놓고 놓아 커버슬립이 부드럽게 떨어지도록 합니다. 참고: 모발 세포가 위쪽으로 향하도록 하고 절차 중에 달팽이관 시편의 접거나 비틀림이 발생하지 않도록 하기 위해 스테레오 해부 현미경으로 달팽이관 시편을 장착합니다.</li>
	<li>슬라이드를 슬라이드를 밤새 4°C의 슬라이드 상자에 넣고 슬라이드를 건조시키고 레이저 공초점 현미경 으로 이미지화합니다.</li>
</ol>5. 달팽이관 리본 시냅스의 형태학적 평가
<ol><li>3개의 레이저를 이용한 공초점 현미경을 사용하는 이미지 슬라이드(405 nm UV 다이오드, 488 nm 아르곤 레이저, 561 nm 다이오드 펌핑 솔리드 스테이트(DPSS) 레이저로 DAPI(여기 스펙트럼 409-464 nm), Alexa Fluor 488(흥분 스펙트럼 496-599n9) (여기 스펙트럼 573-631 nm), 각각.</li>
	<li>63x 고해상도 오일 침지 렌즈를 사용하여 각 달팽이관 회전에서 8 μm의 거리에 걸쳐 공초점 z 스택을 획득합니다. 참고: 일단 정의되면, 포토마이크로그래프를 디지털화하기 위한 모든 파라미터를 저장하고 모든 슬라이드에 균일하게 적용해야 합니다.</li>
	<li>시냅스 펑크 카운트의 경우 z-스택(0.3 μm 스텝 크기)을 IHC 의 전체 길이에 걸쳐 설정하여 모든 시냅스 펀타를 이미지화할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>z 축 투영을 가져오고 이미지 처리 소프트웨어로 가져오기 위해 z 스택에 puncta가 포함된 이미지를 병합합니다.</li>
	<li>
각 IHC에 대한 시냅스 펀타 수를 계산하기 위해 특정 주파수 영역에서 각 z-stack의 시냅스 총 카운트수를 IHC 수(DAPI 핵 수동 카운트와 동일)로 나눕니다. 각 특정 주파수 영역에서, 9-11 IC를 포함하는 다른 현미경 필드의 세 가지 이미지에서 모든 시냅스 풍조를 평균.
	<ol>
<li>자유형 선택 단추를 사용하여 각 IHC의 basolateral 영역을 포함한 관심 영역(ROI)을 간략하게 설명합니다. puncta의 자동 정량화를 위한 측정 함수와 유역 함수를 사용하여 밀접하게 인접한 지점을 구별합니다.</li>
		<li>각 자동 계수 후, 수동 보정으로 육안으로 육안으로 검사를 수행하여 puncta 계수를 신뢰할 수 있도록 합니다. 참고: 실험자는 슬라이드가 달팽이관의 정점, 중간 또는 기저 회전에서 왔는지 여부에 대해 눈을 멀게 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시냅스 구조 및 분포를 시각적으로 평가하고, 연필 도구(M)를 통해 개별IHC를 이웃으로부터 수동으로 분리하여 세포골격 구조 및 시냅스 국소화를 더 잘 시각화합니다.</li>
	<li>시냅스 전 리본(CtBP2) 및 후시냅스 수용체 패치(GluR2)의 병치를 검사하려면 직사각형 선택 윤곽 도구로 리본 주위의 복셀 공간을 추출하고 개별 리본을 자르기로분리합니다. 이미지 > 이미지 크기를클릭하여 이러한 미니어처 프로젝션의 축소판 배열을 획득한 다음 쌍을 이루는 시냅스를 식별하는 데 사용할 수 있습니다(CtBP2 양성 및 GluR2 양성 puncta의 밀접하게 병치된 쌍으로 나타났다) 대 고아 리본 (포스트 나피제 글루타메이트 수용체패치 부족) (그림 3). 참고: 정상 달팽이관 시냅스는 청각 신경 말단(anti-GluR2)(anti-GluR2)에 모발 세포 내의 시냅스 전 리본(anti-CtBP2) 및 후약성 글루타메이트 수용체 패치의 결합된 면역라벨링으로 나타난다. 일부 실험실에서는 3D 모델링과 함께 공초점 프로젝션을 사용하여 시냅스 패치 크기 또는 볼륨26,27을정량화합니다. 리본 시냅스의 현저한 손실 이전에, 쌍글루타메이트 수용체 패치없이 크기 변화를 나타내는 리본은 시냅스 기능장애(27,28)를나타낼 가능성이 있다.</li>
</ol>6. 달팽이관 리본 시냅스의 기능 평가
<ol><li>90 dB의 SPL에서 제시된 각 주파수 자극에 대한 모든 ABR 파를 수집하여 상한ABR 파I 진폭의 분석을 위해. 참고: 신경생리학적 및 형태학적 연구는 낮은 자발적 비율, 높은 임계값 섬유가 노화 및 소음 노출에 특히 취약하다는 것을 입증했다29,30. 리본 시냅스의 간단한 손실이 ABR 임계값에 영향을 미칠 수 없지만, 그것은 일반적으로 ABR 파 I 진폭에 상당한 감소를 초래, 낮은 자발적 인 속도, 높은 임계 값 섬유와 높은 자발적 비율을 포함하는 이러한 구심성 때문에, 낮은 임계값 섬유는 달팽이관 신경 섬유28,29,31의합산 된 활동에 크게 기여합니다. 90dB SPL의 상한강도가 여기에서 선택됩니다.</li>
	<li>오프라인 분석 프로그램을 사용하여 피크 대 피크 파 I진폭을 결정합니다(그림 4). ABR 시험의 각 파I는 시작 양성(p) 편향과 후속 음의(n) 편향으로 구성된다. ABR 파 I 진폭은 IP (웨이브 I의 양수 피크)와 In (파 I의 음수 피크)29사이의 전압 차이로 정의됩니다. 참고: 병리학적 조건에서, 달팽이관 시냅토병증은 소리에 의해 유발되는 SGN의 합산된 개시 반응을 반영하는 ABR 파 I의 상분기준 진폭에 기초하여 결정될 수 있다. 그러나 OHC 기능 장애로 인해 손상되지 않는 달팽이관 감도는 이 방법의 전제 조건입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+notched+audiograms+in+a+cross-sectional+study+of+12%2C055+railway+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+and+Hearing%22%5BJournal%5D)">The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers.</a> Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).</li>
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<li>Kane, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+effects+on+age-related+hearing+loss+associated+with+Cdh23+variants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice.</a> Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).</li>
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<li>Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+brainstem+responses+in+10+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice.</a> Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).</li>
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<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%22temporary%22+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Valero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+in+rhesus+monkeys+%28Macaca+mulatta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta).</a> Hearing Research. 353, 213-223 (2017).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aging+and+Noise+Exposure+on+Auditory+Brainstem+Responses+and+Number+of+Presynaptic+Ribbons+in+Inner+Hair+Cells+of+C57BL%2F6J+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Mehraei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+brainstem+response+latency+in+noise+as+a+marker+of+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy.</a> Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

달팽이관 시냅스병증은 100dB SPL에서 8\u201216 kHz 옥타브 대역 소음에 의해 유도된 일시적인 임계값 시프트(TTS)를 가진 성인 마우스를 처음 특징으로 하기 때문에, 연구자들은 다양한 시냅스병증의 효과를 점점 더 조사하고 있다. 원숭이와 인간을 포함한 포유류32,33. 소음 노출 이외에, 몇몇 그밖 조건은 달팽이관 synaptopathy (예를 들면, 노화, 이독성 약의 사용 및 유전 돌연변이)와 연관되었습니다, suprathreshold 오디션의 단기 중단으로 이끌어 내고, 돌이킬 수 없는 선행합니다 청각 신경의 변성. 달팽이관 모욕의 초기 단계에서, 시냅스 병증은 종종 특정 주파수 위치에서 발생, 특히 IHC 시냅스에 손상이 주파수 영역을 선택으로 제한되는 실험 모델에서24,<sup class="xre...

약 20\u201220,000 Hz의 범위의 주파수는 인간에 의해 청각 자극으로 인식 될 수있다. 인간의 청력은 일반적으로 1,000 Hz 근처에서 가장 민감하며, 젊은 성인의 평균 음압 수준은 20 μPa입니다 (즉, 음압 레벨의 0 데시벨 [dB SPL]). 일부 병리학 적 조건에서 청력 상실은 특정 주파수로 제한됩니다. 예를 들어, 소음 유발 난청(NIHL)의 초기 단계에서, 4 kHz 1에서 청력도에서 "노치"(즉, 청력임계값 고도)를 관찰할 수 있다. 포유류 달팽이관 파티션을 따라 강성과 대량의 그라데이션은 달팽이관의 기지에서 고주파 사운드 감지와 정점 2의 저주파 감지와 함께지수 주파수 맵을 생성합니다. 실제로, 바실라 멤브레인을 따라 달팽이관 장소 주파수지도가 있다, 토노토피 조직으로 알려진 선도2,3. 바실라 멤브레인에 주어진 각 장소는 일반적으로 특성 주파수3,4라고불리는 하나의 특정 사운드 주파수에 대한 가장 높은 감도를 가지며, 다른 주파수에 대한 반응도 관찰할 수 있습니다.
현재까지, 다양한 마우스 모델은 청각 시스템에서 정상적인 기능, 병리학 적 과정 및 치료 효능을 조사하기 위해 사용되었습니다. 마우스 달팽이관에 있는 생리적 매개변수의 정확한 지식은 청력 감소의 그 같은 연구 결과를 위한 전제조건입니다. 마우스 달팽이관은 해부학적으로 상체, 중간 및 기저 회전으로 나누어져 있으며, 이는 다른 주파수 영역에 해당합니다. 달팽이관 핵에서 청각 신경 구심을 라벨링하여 달팽이관에서 이들의 상응하는 말초 내분 부위를 분석함으로써, 뮐러 외는 생체 내에서 정상 마우스에서 달팽이관 장소-주파수맵을 확립하는 데 성공했다 5. 7.2-61.8 kHz의 간격으로, 이는 바실라 멤브레인의 전체 길이의 90%와 10% 사이의 위치에 대응하는, 마우스 달팽이관 장소 주파수 맵은 간단한 선형 회귀 함수에 의해 설명될 수 있으며, 이는 달팽이관 베이스와 특성 주파수 5의 로거심에서 정규화된 거리. 실험실 마우스에서, 장소 주파수 지도는 바실라 막을 따라 상대적인 지역에서 누락된 모발 세포의 수를 보여주는 특정 주파수 범위 내의 청력 임계값과 코클레오그램 사이의 관계를 탐구하는데 사용될 수있다6. 중요한 것은, 장소 주파수 맵은 말초 청각 외상이 있는 마우스의 특정 달팽이관 주파수 위치에서 모발 세포의 리본 시냅스 손상과 같은 최소한의 구조적 손상에 대한 조사를 위한 포지셔닝 시스템을 제공한다7 ,8.
포유류 달팽이관에서, 리본 시냅스는 시냅스 전 리본, IHC 내에서 글루타민산염을 포함하는 방출 준비 시냅스 소포의 후광을 묶는 전자 조밀한 돌기, 및 SGN의 신경 말단에 의한 심호흡 밀도로 구성됩니다. 글루타민산염 수용체9. 달팽이관 소리 변환 도중, 모발 세포 번들의 편향은 IHC 탈분극을 초래하고, 이는 IcHC에서 후성 구심성 단말으로 글루타메이트 방출로 이끌어 내고, 따라서 청각 통로를 활성화합니다. 이 통로의 활성화는 SGN10에서속도 코드로 소리 유도 된 기계적 신호의 변환으로 이어집니다. 실제로 IHC 리본 시냅스는 시간적 정밀도가 높은 수백 헤르츠의 속도로 헤아릴 수 없는 사운드 전송에 매우 특화되어 있으며, 사운드 인코딩의 시냅스 전 메커니즘에 매우 중요합니다. 이전 연구는 리본 시냅스가 성인 마우스 달팽이관11,12의다른 주파수 영역에서 크기와 숫자가 크게 다르다는 것을 밝혔으며, 특정 사운드 코딩에 대한 구조적 적응을 반영할 가능성이 있음은 생존이 필요합니다. 최근 실험 동물 연구에 따르면 인공와우 시냅토병증은 소음 유발 난청, 노화 관련 청력 상실 및 유전성 난청을포함한 여러 형태의 청각 장애에 기여하는 것으로 13, 14.따라서, 특정 주파수 지역에서 시냅스 수, 구조 및 기능의 상관 변화를 식별하는 방법은 점점 청각 발달 및 내이 질환의 연구에 사용되고있다, 통해 생성 된 모델을 사용하여 유전 적 또는 환경 변수의 실험 조작15,16,17.
현재 보고서에서, 우리는 성인 마우스에서 바실라 막의 특정 주파수 영역에서 시냅스 수, 구조 및 기능을 분석하기 위한 프로토콜을 제시한다. 달팽이관 주파수 현지화는 코클리오그램과 함께 주어진 장소 주파수 맵을 사용하여 수행됩니다. 달팽이관 리본 시냅스의 일반적인 형태학적 특성은 시냅스 전 및 후진성 면역 염색을 통해 평가됩니다. 달팽이관 리본 시냅스의 기능 상태는 ABR 파 I의 상한임계값진폭에 기초하여 결정된다. 사소한 변경으로, 이 프로토콜은 쥐, 기니 피그 및 gerbils를 포함하여 그밖 동물 모형에 있는 생리적 또는 병리학적인 조건을 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>케타민 염산염</td><td>Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China</td><td>H35020148</td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>X-1251</td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>TDT 생리학 기구</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td><td>청각 생리학 시스템 III</td><td></td></tr><tr><td>SigGen/BioSig 소프트웨어</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA</td><td>청각 생리학 시스템 III</td><td></td></tr><tr><td>전기 패드</td><td>애완 동물 재미</td><td>11072931136</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게 3#</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td><td>0203-3-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게 5#</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada</td><td>0209-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissection microscope</td><td>Nikon Corp., Tokyo, Japan</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>ZSGB-BIO, 베이징, 중국</td><td>ZLI-9021</td><td></td></tr><tr><td>항-글루타메이트 수용체 2, 세포외, 클론 6C4</td><td>Millipore Corp., Billerica, MA, USA</td><td>MAB397</td><td>마우스&nbsp;</td></tr><tr><td>정제 마우스 Anti-CtBP2</td><td>BD Biosciences, Billerica, MA, USA</td><td>612044</td><td>마우스&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 염소 안티 마우스 IgG1항체</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>A21124</td><td>염소</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG2a 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>A21131</td><td></td></tr><tr><td>염소 마운팅 매체 DAPI</td><td>ZSGB-BIO, BEIJING, CHINA</td><td>ZLI-9557</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 형광 현미경</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, 독일</td><td>TCS SP8 II</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus 소프트웨어</td><td>미디어 사이버네틱스, 베데스다, 메릴랜드, 미국</td><td>버전 6.0</td><td></td></tr><tr><td>전문 진단 포켓 검이경</td><td>Lude 의료 기기 및 기기 무역 유한 회사, 상하이, 중국</td><td>HS-OT10</td><td></td></tr><tr><td>바늘 전극</td><td>우정 의료 전자 유한 회사, 시안, 중국</td><td>1029</td><td>20mm, 28G</td></tr><tr><td>폐쇄 필드 발표</td><td>자 Tucker-Davis Technologies, 미국 플로리다주 앨라추아</td><td>CF1</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

달팽이관 내부 모발 세포 (IHCs)는 리본 시냅스를 통해 나선형 신경절 뉴런 (SGNs)에 음향 신호를 전송합니다. 몇몇 실험적인 연구 결과는 모발 세포 시냅스가 감각신경성 난청 (SNHL)에 있는 초기 표적이 될 수 있다는 것을 표시했습니다. 이러한 연구는 IHCs와 SGNs 사이의 비정상적인 시냅스 전송을 초래하는 리본 시냅스 수, 구조 또는 기능의 변경을 의미하는 달팽이관 "시냅토 병증"의 개념을 제안했습니다. 달팽이관 시냅토병증은 돌이킬 수 없지만 청력 임계값에는 영향을 미치지 않습니다. 소음 유발 실험 모델에서 일부 주파수 영역에서 IHC 시냅스의 제한된 손상은 시냅스병을 유발하는 환경 적 요인과 이 내이를 방해하는 생리적 결과를 식별하기 위해 사용됩니다. 회로. 여기에서, 우리는 성인 마우스에 있는 특정 주파수 지구에 달팽이관 시냅스 형태 및 기능을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 특정 주파수 영역의 달팽이관 현지화가 코클리오그램 데이터와 함께 장소 주파수 맵을 사용하여 수행되며, 그 다음에는 리본 시냅스의 형태학적 특성이 시냅스를 통해 평가됩니다. 면역 염색. 리본 시냅스의 기능 상태는 청각 뇌간 반응(ABR) 파I의 진폭에 기초하여 결정된다. 본 보고서는 이 접근이 새로운 치료 내정간섭의 발달에서 도울 수 있는 달팽이관에 있는 시냅스 역기능의 병인 그리고 기계장치의 우리의 이해를 심화하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

ABR 청력 검사는 마취하에 10 C57BL/6J 마우스(8주)에 대해 수행되었습니다. AV는 4, 8, 16, 32 및 48 kHz에서 톤 버스트 자극을 사용하여 유도되었다. 각 동물의 청력 임계값은 ABR에서 적어도 하나의 명확한 파형을 구별함으로써 시각적으로 검출되었다. 모든 마우스는 자극의 주파수에 따라 25 및 70 dB SPL 사이에 이르는 톤 버스트에 반응하여 ABR 임계값을 나타내었다. 우리의 결과는 청각 임계값이 16 kHz(그림1)에서 가장 낮았다는 것을 나타내었으며, 달팽이관 정점으로부터 약 43 % 거리에 해당 (그림2)다른 달팽이관에서 음향 감도가 현저히 감소한다는 것을 시사합니다. 지역.
달팽이관 전체 마운트는 스테레오 해부 현미경하에 성인 마우스에서 측두골로부터 분리되었다(도2A).<strong...

이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

1차 보고서는 시냅스 숫자가 변경되고 기능을 분석할 수 있는 대부분의 모델에서 바실라 막의 특정 주파수 영역을 정확하게 찾는 스트레스 중요성입니다. 특정 주파수 영역의 달팽이관 국소화는 코클레오그램 데이터와 함께 주파수 맵을 사용하여 안정적으로 수행됩니다. 현미경은 몇몇 연구 결과에 통찰력을 제공합니다.그것은 달팽이관 신경 병증이 특히 청력 감소, 이명 및 hyperacusis의 앞에 1 차적인 초기 사건이다는 개념을 지원합니다. 마취 된 8 주 된 성인 C57 블랙 6J 남성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후. 전기및 음향 차폐실에 37도 섭씨 열패드에 마우스를 놓습니다.다음으로, 두개골정골의 피부 밑에 3밀리미터의 깊이를 가진 피하 20 밀리미터 28 게이지 바늘 기록 전극을 놓습니다. ipsilateral parotid 영역의 기준 전극, 측정된 귀의 정점에, 그리고 모순된 parotid 영역에서 지상 전극. 마우스 옆에 원뿔 모양의 팁이 있는 2센티미터 플라스틱 튜브가 장착된 폐쇄된 필드 스피커를 배치하고 팁을 외부 외이도에 맞춥니다.청각 브레인스템 응답 또는 ABR 레코딩의 경우 5~10데시벨의 음압 레벨 단계에서 음압 레벨을 90에서 10데시벨로 낮추는 톤 주사위를 생성합니다. 이 단계에서 응답은 증폭, 필터링 및 평균화됩니다. 각 주파수에서, ABR 임계값을 결정, 이는 시각적 검사에 의해 명확하게 식별 할 수있는 하나 이상의 구별 파도와 신뢰할 수있는 ABR 레코딩을 초래 최소한의 음압 수준입니다.ABR 녹음 후, 복부 측에서 황소를 노출하고 달팽이관에 액세스 할 수있는 날카로운 가위로 황소를 엽니 다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 측두골 뼈를 제거 하 고 stapes 동맥을 분리. 그런 다음 타원형 창에서 스테이프를 제거하고 둥근 창 막을 파열시킵니다.13밀리미터 27 게이지 바늘의 끝을 부드럽게 회전하여 달팽이관 정점에 작은 구멍을 뚫은 후, 미세한 기울어진 파이펫을 사용하여 창을 통해 4%의 파라포름알데히드를 부드럽게 세척 공간으로 플러리림프공간으로 플러시합니다. 다음으로, 세척당 차가운 신선한 0.1 어어 PBS로 세척당 5분 동안 뼈를 세 번 헹구습니다. 그 다음에는 실온에서 4시간 동안 10%EDTA를, 수평 셰이커에서 분당 20회 회전하는 뼈를 탈화합니다.잠복이 끝나면 해부 된 현미경으로 탈하된 측두골을 신선한 0.1 어금니 PBS로 옮기습니다. 3및 5 듀몬트 집게와 27 게이지 바늘을 사용하여 정압, 중간 및 기저 달팽이 영역을 차례로 해부하십시오. 면도날을 사용하여 나선형 인대를 따라 작은 일련의 컷을 만들고 지각 막과 Reissner의 막을 제거하십시오.또한 나선형 림푸스를 포함한 나머지 청각 상피를 개별 달팽이관으로 해부하여 전체 마운트 준비를 위해 회전합니다. 그런 다음 광 현미경의 40X 오일 목표를 사용하여 눈조각에 250 마이크로미터 스케일로 바실라 멤브레인 길이를 측정합니다. 그것은 내부 머리 세포의 스테레오실리아를 따라 조정할 수 있습니다.해부 후 각 달팽이관은 개별 2.5 밀리리터 원심분리관으로 변합니다. 회전기의 실온에서 1시간 동안 PBS에서 10%의 염소 세럼으로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션이 끝나면 200 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 해부 현미경하에서 용액을 제거하십시오.1차 항문체로 5%염소 세럼과 PBS를 0.1%트리톤 X-100으로 1회 회전기에서 4도에서 배양한다. 다음 날 아침, 세척당 0.1 대구어 PBS로 5분간 조직 샘플을 3회 헹구어 잔류 1차 항체를 제거한다. 그런 다음 PBS에서 5%염소 세럼으로 희석된 적절한 이차 항체로 시편을 0.1%트리톤 X-100에서 0.1%트리톤 X-100으로 표시하여 회전기의 실온에서 2~3시간 동안 빛으로부터 보호한다.인큐베이션이 끝나면 시료를 0.1 mm PBS로 세 번 세척하고 표본을 0.1 mmm PBS를 포함하는 개별 35 mm 플레이트로 옮겨냅니다. DAPI 보충 장착 매체를 슬라이드에 놓고 PBS에서 장착 매체로 시편을 전송합니다. 커버의 가장자리 한 개를 각 슬라이드에 놓고 놓아 커버가 부드럽게 떨어지게 합니다.그런 다음 슬라이드를 밤새 섭씨 4도에서 슬라이드 상자에 건조시십시오. 표본을 이미지화하려면 적절한 레이저와 63X 고해상도 오일 침수 렌즈가 있는 공초점 현미경을 사용하여 각 달팽이관 회전에서 8마이크로미터 공초점 Z 스택을 획득합니다. 시냅스 말장난 카운트의 경우, 0.3 마이크로미터 스텝 크기로 Z 스택을 설정하여 내부 모발 세포의 전체 길이에 걸쳐 모든 시냅스 말장난을 이미지화하고 Z 스택에 포함된 puncta를 병합하여 Z 액세스 프로젝션을 얻습니다.병합된 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램으로 가져옵니다. 각 세포에 대한 시냅스 말크타 수를 계산하기 위해 특정 주파수 영역에서 각 Z 스택의 시냅스 총 수를 DAPI 양성 내부 모발 세포의 수로 나눕니다. 각 특정 주파수 영역에서, 9~11개의 내부 모발 세포를 포함하는 상이한 현미경 필드의 3개의 심상에서 시냅스 말크타를 평균합니다.사이토셀레탈 아키텍처와 시냅스 지역화를 더 잘 시각화하려면 브러시 도구를 사용하여 개별 내부 모발 세포의 시냅스 구조 및 분포를 시각적으로 평가합니다. 사전 시냅스 리본과 포스트냅스 수용체 패치의 병치를 검사하려면 직사각형 윤곽 도구를 사용하여 리본 주변의 복셀 공간을 추출하고 이미지 커팅을 사용하여 개별 리본을 분리합니다. 그런 다음 이미지 및 이미지 크기를 클릭하여 쌍이 있는 시냅스와 고아 리본을 식별하는 데 사용할 수 있는 이 미니어처 프로젝션의 축소판 배열을 얻습니다.이 대표적인 실험에서 마우스의 모든 10개는 자극의 주파수에 따라 음압 수준당 25 및 70 데시벨 사이의 톤 버스트에 대한 응답으로 ABR 임계값을 나타냈다. 이 실험에 대한 청력 임계값은 달팽이관 정점으로부터의 거리의 약 43%에 해당하는 16킬로헤르츠에서 가장 낮았으며, 이는 다른 달팽이관 지역에서 음향 감도가 현저히 감소한다는 것을 시사합니다. 청각 상피의 전체 탈것은 세 조각으로 해부되고 길이는 달팽이관 정점에서 백분율 거리로 측정되고 변환됩니다.각 달팽이관 회전의 바실라 멤브레인의 주파수 위치는 로그리스믹 기능을 사용하여 계산됩니다. 성인 마우스의 정상적인 귀에서 면역 염색은 시냅스 리본과 글루타민트 수용체 패치의 병치 쌍을 보여줍니다. 세포 당 8 ~20 쌍의 내부 모발 세포의 바소포 측막 표면을 연구합니다.말장난의 대부분은 정상적인 귀에 나란히 배치 된 쌍으로 나타나지만 고아 리본은 높은 배율에서 드물게 관찰되지 않습니다. 내부 헤어 셀 리본 시냅스의 수는 16킬로헤르츠 지역에서 가장 높으며, 이 위치에서의 거리가 증가함에 따라 현저히 감소한다. 이 절차 동안 기억해야 할 가장 중요한 것은 달팽이관 기저막의 무결성을 보장해야한다는 것입니다.우리는 기술적 숙련도에 도달할 때까지 정확성을 강조해야 합니다. 이 절차에 따라, 진통 신경병증이 측정에 의해 복구 될 수 있는지 여부를 대답하기 위해 유전자 치료를 수행 할 수 있습니다. 이 측정은 달팽이관 신경병증을 탐구하기 위한 더 넓은 기술입니다, 1 차적인 초기 사건이 청력 손실, 이명 및 hyperacusis를 가진 것과 연관되는 경우에.

morphological-functional-evaluation-ribbon-synapses-at-specific

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

포유류의 달팽이관에있는 내부 헤어 셀 리본 버렸네에서 청각 신경 섬유 dendrites에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

이 비디오는 쥐 달팽이관의 특정 영역에서 리본 시냅스를 평가하는 방법을 보여줍니다. 면역염색 및 컨포칼 이미징 기술을 활용하여 각 달팽이관 회전에서 서로 다른 주파수 영역에 걸쳐 기능적 시냅스를 식별합니다.

Mouse Cochlea의 특정 주파수 영역에서의 리본 시냅스 평가

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.

젊은 성인과 노인 Gerbil Cochleae의 면역 표지 및 카운팅 리본 시냅스

여기서는 소음성 난청(NIHL)의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제시합니다. NIHL을 유도하기 위해 골판지 플라스틱, 쥐덫 케이지 및 스피커를 사용하여 새롭고 간단한 장치를 개발했습니다. 청각 뇌간 반응과 면역형광 영상을 각각 사용하여 청력 기능과 외부 유모 세포 손상을 평가했습니다.

생쥐의 소음성 난청에 대한 수정된 실험 조건 및 청력 기능 및 외부 유모 세포 손상 평가

전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화하기 위해 광시트 현미경이 개발되었습니다.

광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

이 문서에서는, 우리는 수행하기 쉽고 이미지가 성인 마우스 뇌의 혈관 트리를 활용할 수 뇌혈관 캐스팅에 대한 간단한 실용적인 기술을 제시한다.

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

배우세요 마우스 달팽이관 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가 방법을. ABR 측정과 공초점 현미경을 활용하여 특정 주파수 영역의 시냅스 변화를 정량 분석하고 청각 질환의 기전을 규명합니다.

마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

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