전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

이 전체 마운트 해부 방법의 전반적인 목표는 석회화된 성인 달팽이관의 감각 영역을 정점, 중간, 기저부의 세 가지 온전한 회전으로 분리하는 것입니다. 이 해부 방법은 코르티 기관의 3차원 구조를 보존하고 면역염색 및 컨포칼 현미경과 결합하여 Z축의 다른 평면에서 이미지를 얻을 때 모든 세포를 시각화할 수 있습니다. 이전의 박리 방법과 비교하여, 당사는 면역염색 과정에서 손실되거나 손상될 가능성이 더 크고 더 적은 3개의 달팽이관 회전을 생성하는 다른 전략을 사용합니다.

이 방법의 시각적 시연은 해부를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 코르티 기관은 연약하기 때문에 나선형 인대를 제거할 때 오류의 여지가 적습니다. 승인된 절차에 따라 동물을 안락사시키고 뇌를 제거한 후, 쥐의 두개골 기저부에 있는 측두골을 확인하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 표준 패턴 집게를 사용하여 뇌 신경을 긁어냅니다. 집게를 이낭 끝에 놓고 반대쪽 손의 엄지손가락을 사용하여 뒤쪽 반고리관을 눌러 캡슐화된 달팽이관을 제거합니다. 엄지와 검지로 수동으로 또는 10.5cm의 가는 가위를 사용하여 두개골에서 측두골의 아래쪽 절반을 분리하고 메탄올 자유 전자 현미경 등급 4%파라포름알데히드에 넣어 고정합니다.

고정 후, 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따라 측두골을 석회질화합니다. 샘플이 적절하게 석회질화되었는지 확인하려면 실리콘 엘라스토머로 코팅된 해부 접시에 측두골을 놓고 달팽이 모양의 달팽이관에 집게를 부드럽게 누릅니다. 조직이 해면질이면 석회질 제거가 완료된 것입니다.

PBS를 해부 접시에 넣은 다음 실체 해부 현미경으로 작업하는 동안 4번 또는 5번 집게를 사용하여 전정 영역의 측두골을 잡고 5밀리리터 Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 측면을 따라 정점 위의 과도한 이낭 조직을 잘라냅니다. 2.5 밀리리터 Vannas 스프링 가위를 사용하여 하나의 블레이드를 타원형 창에 삽입하고 기저 회전의 나선형 인대를 따라 여러 개의 작은 절단을합니다. 이제 5 밀리리터 Vannas-Tubingen 스프링 가위의 한 날을 방금 자른 부위에 삽입하고 다른 날을 타원형 창 내측의 측두골 바깥쪽에 놓습니다.

이 절단은 기저 회전을 중간 및 정점 회전과 분리합니다. 다음으로, 기저 회전의 해부를 완료하려면 2.5ml의 스프링 가위를 사용하여 모디올러스에 연결된 나선형 신경절 신경 섬유를 잘라 기저 회전의 긴장을 해제합니다. 전정 기관에서 분리하기 위해 기저 회전 아래를 자릅니다.

겸자를 사용하여 조직을 안내하고 나선형 신경절 섬유를 실리콘-엘라스토머로 코팅된 접시에 고정합니다. 코르티 기관의 위와 아래에서 나선형 인대를 제거하기 위해 일련의 작은 절단을 만듭니다. 나선형 신경절 섬유를 실리콘-엘라스토머로 코팅된 접시에 고정한 상태에서 집게를 사용하여 코르티 기관에서 남아 있는 라이스너 막을 제거합니다.

나선형 신경절 축삭돌기의 두께를 줄이기 위해 여러 번 자릅니다. 그런 다음 집게로 나선형 신경절의 나머지 축삭을 잡고 절개된 기저 회전을 약 500마이크로리터의 PBS를 포함하는 48개의 웰 플레이트로 옮깁니다. 이제 먼저 달팽이관 정점 면의 나머지 2/3를 아래로 향하게 하여 중간 회전과 정점 회전을 분리합니다.

그런 다음 2.5 밀리리터 가위의 한 블레이드를 중간 회전이 이전에 기저 회전에 연결되었던 스칼라 매체에 삽입하고 중간 회전의 나선형 인대를 따라 여러 번 자릅니다. 5 밀리리터 가위를 사용하여 절단 부위에 하나의 칼날을 삽입하고 가운데 회전을 칼날 위에 놓습니다. 다른 쪽 칼날을 뼈 미로 바깥쪽, 정점 끝에서 90도 각도로 놓습니다.

이 컷은 중간 회전과 정점 회전을 분리합니다. 다음으로, 코르티 기관에서 나선형 인대를 제거하여 중간 회전의 해부를 완료합니다. 이전과 같이 절개된 턴을 48웰 플레이트로 옮깁니다.

이제 2.5 밀리리터 Vannas 스프링 가위를 사용하여 정점 회전을 덮고있는 캡을 열고 절차를 반복하여 코르티 기관에서 정점 회전 나선형 인대를 제거합니다. 이전과 같이 절개된 턴을 48웰 플레이트로 옮깁니다. 면역염색 절차를 시작하려면 먼저 각 웰에서 PBS를 흡입한 다음 200-300마이크로리터의 차단 용액으로 교체하고 3D 회전기로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 시간이 경과하면 차단 용액을 제거하고 담체 용액에 적절하게 희석된 1차 항체 100마이크로리터로 교체합니다. 3D 회전기에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 제거하고 실온에서 매번 최소 5분 동안 500마이크로리터의 PBS로 각 웰을 세척합니다.

세탁을 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후 PBS를 흡인하고 피펫 팁에서 절개된 회전을 빨아들이지 않도록 주의하십시오. 운반체 용액에 희석된 형광 태그가 지정된 2차 항체 웰당 100마이크로리터로 교체하십시오.

48웰 플레이트를 빛으로부터 보호하기 위해 블랙박스에 넣고 3D 로테이터에 올려 실온에서 2-3시간 동안 배양합니다. 배양 후 2차 항체 용액을 흡인하고 이전과 같이 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척을 제거한 후 100마이크로리터의 Hoechst를 원자핵 표지에 추가합니다.

빛을 피하고 3D 회전기로 실온에서 15-20분 동안 배양합니다. 마지막으로 Hoechst 용액을 제거하고 이전과 같이 PBS로 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에 라벨을 붙인 후 각 슬라이드에 50마이크로리터의 장착 매체를 피펫으로 주입합니다.

그런 다음 4번 또는 5번 스트레이트 주얼러의 집게를 사용하여 나선형 신경절의 축삭을 잡고 48웰 플레이트에서 장착 매체로 달팽이관을 한 바퀴 부드럽게 옮깁니다. 현미경을 사용하여 절개된 회전이 접히거나 꼬이지 않았는지 확인합니다. 커버 슬립의 한쪽 끝을 슬라이드에 놓고 부드럽게 풀어 커버 슬립이 떨어지도록 합니다.

실체 해부 현미경을 사용하여 달팽이관 회전이 기포 근처에 있지 않은지 확인하십시오. 이 경우 커버 슬립을 앞뒤로 부드럽게 움직여 달팽이관 회전 위치를 조정하십시오. 다른 달팽이관 회전에 대해서도 이 절차를 반복합니다.

이미징 과정에서 빛에 노출되거나 광이 표백되는 것을 방지하기 위해 슬라이드당 하나의 인공와우를 장착합니다. 슬라이드가 평평하게 놓이도록 슬라이드 폴더에 슬라이드를 배치합니다. 빛을 피하고 장착 매체가 실온에서 밤새 경화되도록 합니다.

다음날 투명한 매니큐어로 커버를 밀봉하고 이미지가 표시될 때까지 실온 또는 섭씨 20도에서 보관하십시오. 이 컨포칼 슬라이스 이미지는 p15 마우스에서 분리된 달팽이관 중간 회전을 보여줍니다. 전체 중간 턴을 재구성하기 위해 420X 이미지가 오버레이되었습니다.

토끼 항미오신 VIIa 1차 항체와 Alexa 647 복합 2차 항체로 표지된 유모 세포는 자홍색으로 나타납니다. 염소 항-SOX2 1차 항체와 Alexa 568 복합 2차 항체로 표지된 지지 세포는 녹색으로 나타납니다. 핵은 Hoechst 염색으로 인해 파란색으로 나타납니다.

축척 막대는 100미크론을 나타냅니다. 이 이미지는 X, Z 평면에서 6주 된 마우스에서 분리된 중간 회전의 광학 단면을 보여줍니다. 다시 말하지만, 유모 세포는 자홍색 형광단으로 표시되고 지지 세포는 녹색으로 보이는 형광단으로 표시됩니다.

이것은 십자선이 제거된 이전 이미지의 확대를 증가시킨 것입니다. 축척 막대는 20미크론을 나타냅니다. 다음 4개의 이미지는 전체 마운트 해부 중 또는 마운트 인공와우가 슬라이드를 켤 때 발생할 수 있는 몇 가지 문제를 보여줍니다.

여기 이미지의 왼쪽에서 달팽이관 조직은 바깥쪽 유모 세포의 마지막 줄 옆에서 절단되어 이러한 세포 중 많은 부분이 다양한 각도로 장착되도록 했습니다. 이 이미지에서는 왼쪽의 코르티 기관 부분이 잘려 있습니다. 이미지 중앙의 바깥쪽 유모 세포 영역에 구멍이 뚫려 있습니다.

여기서 코르티 기관은 여러 곳에서 접혀 있습니다. 일단 숙달되면 전체 산 해부 기술을 20-30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 집게를 코르티 기관에 놓지 말고 나선형 인대를 당기거나 잡지 않는 것이 중요합니다.

대신, 겸자를 닫고 나선형 신경절 섬유를 실리콘-엘라스토머로 코팅된 접시에 고정합니다. 생후 1주에서 3주 된 생쥐의 샘플은 더 관대하고 해부 방법을 배우는 데 유용합니다. 또한 유모 세포가 손상된 샘플은 절개가 더 어렵고 소음에 노출된 조직은 특히 어렵고 깨지기 쉽습니다.

이 해부 절차에 따라 주사 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 그러나 다른 정착제가 필요합니다. 또한, 우리는 쥐 달팽이관 조직 해부에 대한 이 프로토콜을 약간 수정했으며, 앞으로 친칠라, 저빌, 기니피그의 달팽이관 해부에 대해서도 추가로 수정하기를 희망합니다.