Name: 전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 학습하세요 성인 마우스 달팽이관의 전체 마운트 해부 및 면역 형광 기법을 통해 코르티 기관의 3차원 구조를 보존하고 모발세포와 지지세포를 정밀 관찰하는 방법을. 이 기술은 청각 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 N000141310569(Office of Naval Research)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility 장비는 National Center for Research Resources-Health(S10RR027716)의 지원을 받았습니다.

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 의학의 서던 일리노이 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 시간적 뼈 1. 추출 <ol><li> 마우스 두개골 (13)의베이스에 시간적 뼈를 확인하고 표준 패턴 집게를 사용하여 두개골 신경을 멀리 쳤어요. </li><li> 캡슐화 된 달팽이관을 제거하기 위해 귀의 캡슐의 끝에서 아래로 후부 반원의 운하에 반대 손으로 언론의 엄지 손가락으로 표준 패턴 집게를 놓습니다. </li><li> 수동으로 엄지와 검지 손가락으로 또는 10.5 cm 미세 가위를 사용하여 두개골에서 시간적 뼈의 아래쪽 절반을 무료로 제공됩니다. </li></ol> 2. 임시 뼈를 포스트 - 수정 <ol><li> 10 mM의 인산 완충 식염수에 희석 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)의 pH 7.4와 incub - (250)를 포함하는 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 시간적 뼈를 배치20 시간 - 2 RT에서 먹었다. 참고 : 원형 또는 타원형 창에 PFA의 정점 캡 또는 주입의 어떠한 개구가 필요하지 않습니다. 유리 병에 16 % 농도에서 구입할 수 있습니다 메탄올 무료, 초순수, 전자 현미경 (EM) 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. 유리 병은 개방 한 희석되면 : 4 % 용액을, PBS로 4 (일부 항체가 허용 할 수있는 짧은 정착 등을 필요로 4 ℃로 저장 될 때, 그것은 최대 2 주 동안 사용할 수있는 O / N (O / N) 고정). </li></ol> 3. 석회 시간적 뼈 <ol><li> 고정 후, 피펫을 사용하여 PFA를 제거하고 120 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 약간 이상 2 ㎖로 대체합니다. 튜브를 닫을 때 공기가 거품 방지하기 위해 전체 2 ML의 microcentrifuge 관을 채우기해야합니다. <ol><li> 바로 decalcifying하지 않는 경우, 4 O ℃에서 10 mM의 PBS 산도 7.4 저장 샘플 PFA 교체 참고 : 고정 후, 시간적 뼈가 variab 저장할 수 있습니다제작 : 항원에 따라 탈회가 조사되기 전에 시간의 양. </li></ol></li><li> 엔드 오버 엔드 회전에 장소 튜브 및 실온에서 4 rpm으로 회전. 피펫을 사용하여 매일 EDTA 솔루션을 변경합니다. 탈회의 길이는 시료의 나이와 절개를하고있는 과학자의 취향에 따라 달라집니다. <ol><li> 배양 시간에 대한 다음 지침을 사용하여 EDTA에 시간적 뼈를 품어 : 8 P15에 샘플 출생 후 하루 (P)의 경우 : 2-4 시간; P21에 샘플 P15의 경우 : O / N; P30에 샘플 P21의 경우 : 2 O / N; 3 개 이상의 O / N : P30보다 오래된 샘플하십시오. 참고 : 탈회 시간은 사용자의 환경에 제한이있을 수 있으며, 필요에 따라 확장 할 수 있습니다. 탈회 시간은 약 8 시간 간격, 하루 두번 EDTA 용액을 변화시킴으로써 감소 될 수있다. 오염을 방지하기 위해 이상 3 일간 decalcifying 때 일부 연구소는 EDTA 용액에 1 % PFA를 추가합니다. </li></ol></li><li> 시료가 적절하게 탈회하는 경우 O 시간적 뼈를 배치, 확인하려면NA 실리콘 해부 접시를 엘라스토머 코팅 부드럽게 달팽이 모양의 달팽이관에 집게를 누릅니다. 조직 spongey이면 탈회가 완료되었습니다. </li><li> 탈회가 완료되면, 피펫을 사용하여 EDTA를 제거하고 10 mM의 PBS 산도 7.4의 500 -1,000 μl를 추가합니다. 준비까지 4 O C에서 보관 샘플을 해부합니다. </li></ol> 4. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시 만들기 <ol><li> 베이스와 제조자의 지시에 따라 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트 경화제 수확기 철저히 혼합한다. </li><li> 이 솔루션은 검은 색이 될 때까지 가루 숯 3 큰술과 잘 혼합 - 약 2를 추가합니다. 주 : 습식 잉크 또는 액체 숯 용액과 혼합되지 않고 사용할 수 없다. 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트는 4.2 단계를 생략 할 수 있도록, 검정에서 구입할 수있다. </li><li> 코트에 충분히 바닥을 작성, 60mm 유리 또는 플라스틱 배양 접시에 솔루션을 붓는다. BU 경우bbles이 존재하는 표면에 공기 퍼프. 설정 실온에서 최소 24 시간을 서 보자. 주 : 실리콘 엘라스토머 코팅 접시 년간 반복 사용할 수있다. 이 실리콘 엘라스토머는 균열의 원인이됩니다 그러나, 청소를​​ 위해 에탄올을 사용하지 마십시오. </li></ol> (P7과 이전 샘플) 달팽이관 5. 전체 마운트 해부 <ol><li> 중간 / 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리 <ol><li> 10 mM의 PBS pH를 7.4으로 3 분의 2 가득 채워진 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 한 탈회 측두골을 놓고 다음 단계에 대한 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. </li><li> # 4, # 5 연속 보석상의 집게를하고 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 이용하여 전정 지역에서 측두골을 잡고, 측면을 따라 꼭대기 위에 여분의 귀 캡슐 조직을 절단. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여 타원형 창에 하나의 블레이드를 삽입하고 나선 인대 / 측면을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들기초 차례의 벽. </li><li> 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 그냥 잘라 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 측두골 외부의 다른 블레이드를 배치, 타원형 창으로 내측. 이 컷은 중간과 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리한다. </li></ol></li><li> 기초 차례의 전체 해부. <ol><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 기초 차례로 긴장을 풀고 전정 기관에서 별도의 기저 차례 이하로 잘라 modiolus에 연결 나선 신경절 신경 섬유를 잘라. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 코르티 기관 위와 아래 모두에서 나선 인대 / 측면 벽을 제거하기 위해 작은 상처의 시리즈를 확인합니다. 조직을 안내하는 # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용합니다. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 나선 신경절 신경 섬유를 핀하지만 조직이 눈물로이 지역에 보유하지 않습니다. </li><li> 이전 단계, Reissner의 membran의 일부 중전자는 종종 제거됩니다. 어떤이 여전히 남아있는 경우, # 4, # 5 직선 보석의 집게와 Reissner의 멤브레인을 파악하고 코르티 기관에서 멀리 당기십시오. 참고 : tectorial 멤브레인은 거의 볼 수 있고 일반적으로 제거를위한 특정 단계를 필요로하지 않고 멀리 수레. </li><li> 마지막에, 가능한 한 평면 회전을하고 나선 신경절의 나머지 축삭을 잡고, 해부 기저 차례 전송 # 4 또는 # 5 직선 보석의 집게를 사용하여, 나선 신경절 축삭의 두께를 감소시키기 위해 여러 컷을 만드는 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드) 10 mM의 PBS pH가 7.4 ~ 500 μl를 포함. </li></ol></li><li> 별도의 중간과 혀끝의 회전 <ol><li> 달팽이관, 아래로 정점 측의 나머지 3 분의 2를 놓습니다. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 사용 중간 차례 기초 차례에 연결되는 스칼라 매체에 하나의 블레이드를 삽입하고 일의 나선 인대 / 측면 벽을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들전자 중앙의 전원을 켭니다. </li><li> 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 바로 블레이드의 상단에 배치 된 중간 차례 절단 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 혀끝의 끝에서 90 오 각도, 뼈 미로 외부에 다른 블레이드를 배치합니다. 이 혀끝의 차례에서 중간 차례를 분리한다. </li></ol></li><li> 기초 차례 유사한 방식으로 중간 차례의 전체 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조). </li><li> 혀끝의 차례의 전체 해부. <ol><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 혀끝의 회전을 커버 뚜껑을 엽니 다. 기초 차례 유사한 방식으로 완전 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조). 주 : 해부 달팽이관 회전은 면역 염색 전에 몇 주 동안 4 O C에서 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 10 mM의 pH 7.4의 PBS에 저장 될 수있다. 에 세균이나 곰팡이의 성장을 초래할 수 3 주 - 그러나 PBS는 더 이상 2보다 증발 주기적으로 보충 할 필요가 및 저장합니다화상의 품질을 감소시킬 수있다 조직. 우리 undissected 시간적 뼈 같은 샘플 장기간 저장을 추천한다. </li></ol></li></ol> 찬란 태그 항체 6. 면역 염색 <ol><li> 절개 한 후, 10 mM의 PBS pH를 7.4 ~ 500 μL에 잠긴 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 별도의 잘 각각의 인공 차례를 저장합니다. 다음 각 단계를 들어 인공 차례, 액체에 잠긴한다 위에 떠 있지 않거나 잘의 측면에 붙어. 참고 : 물론 각에서 액체를 제거 할 때, 그것은 인공 회전을 잃거나 피펫 팁에서 그것을 빨아 쉽다. 해부 범위를 사용하여 200 μL 피펫 팁과 솔루션을 변경하면이 문제를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫을 사용하여, 각 웰로부터 PBS를 제거하고 교체 ~ 200 - / 차단 투과성으로 용액 (웰당 300 ㎕의 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 및 10 % 정상 염소 혈청 (NGS) 10 mM의 PBS 피에 희석H 7.4). 3D 회전에 실온에서 1 시간을 품어. 주 : 사용 된 일차 항체가 염소 숙주에서 만들어진 경우, 보조 항 - 염소 항체를 필요로 할 것이며, NGS는 어떤 단계에 사용되어서는 안된다. 정상 말 혈청 NGS위한 대체로서 사용할 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 차단 / 투과성으로 솔루션을 제거하고 차 항체 용액을 잘 당 ~ 100 μL로 교체 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 PBS의 pH 7.4에 희석 1 % BSA, 5 % NGS). 각각의 일차 항체의 희석 배수는 다릅니다. 3D 회전에서 4 ℃로 O / N (최소 14 시간)을 품어. 주 : 하나 이상의 차 항체가 사용되는 경우, 모든 단지 각 차 항체가 다른 호스트를 가지고 있는지 확인 인큐베이션 동일한 용액에 결합 될 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 일차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 각 세척 3D 회전기에 RT에서 5 분의 최소 잠복. </li><li> 마지막으로 P를 제거BS는 피펫을 사용하여 이차 항체 용액을 웰 당 100 μL ~와 교체 워시 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 pH 7.4의 PBS로 희석하고, 1 % BSA, 5 % NGS). 500 또는 1 : 1,000 각 희석 배수는 형광 이차 항체는 일반적으로 1 태그. 찬란 보호 빛 차 항체를 태그하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 놓습니다. 3D 회전에 실온에서 3 시간 - 2를 품어. 주 : 둘 이상의 이차 항체가 필요한 경우, 그들은 동일한 배양 용 용액에 결합 될 수있다. 크로스 라벨의 가능성이없는 것을 확인합니다 (예., 염소 항 - 토끼와 닭고기 방지 염소 이차 항체 사용) </li><li> 피펫을 사용하여 이차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 마지막 PBS 세척을 제거하고 Hoec 잘 당 ~ 100 μL로 교체핵을 레이블 : HST 33342 (10 mM의 PBS pH를 7.4에서 2000 1 희석). 3D 회전에 실온에서 20 분 - 15 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. 이상 20 분 부화하지 마십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 훽스트 (Hoechst) 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. </li><li> 필요한 경우 모든 단계는 몇 시간, 훽스트 배양을 제외하고, 확장 할 수 있습니다. 모든 단계에서의 반응을 일시 중지하려면 단지 10 mM이 PBS pH 7.4로의 ~ 500 UL의 샘플 잠수함 및 프로토콜 시간 1 재개 할 준비가 될 때까지 4 ℃로 48 - 글쎄 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)를 저장 - 2 일 이상 . </li></ol> 7. 산 달팽이는 슬라이드를 켭니다 <ol><li> 라벨에 사용되는 샘플과 항체에 대한 관련 정보를 슬라이드. </li><li> 피펫 설치 미디어의 ~ 50 μL를 각 슬라이드에 및주의거품을 방지한다. 임의의 기포를 제거하기 위해 설치 미디어를 포함하는 튜브를 원심 분리기. </li><li> # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용하여 부드럽게 장착 매체에 슬라이드와 장소에 48 웰 플레이트에서 하나의 인공 차례를 전송하기 위해 나선 신경절의 축삭을 파악. 슬라이드 당 장착 한 인공 차례 이미징 과정에서 빛 노출과 광표백을 방지합니다. </li><li> 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 사용 # 4, # 5 직선 보석의 집게는 인공 차례의 위치를​​ 변경합니다. </li><li> 슬라이드 커버 슬립의 한쪽 끝을 놓고 부드럽게 coverslip에 가을 있도록 놓습니다. </li><li> 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 부드럽게 인공 차례의 위치를​​ 앞뒤로 coverslip에 이동합니다. </li><li> 장소 슬라이드그래서 슬라이드 폴더에 그들은 평면 배치. 설치하자 미디어 경화 O / RT에서 N (어둠 속에서 계속) </li><li> 명확한 매니큐어 및 저장 실온에서 또는 -20 O를 C와 인감 된 커버가 될 때까지 몇 군데. 슬라이드는 슬라이드 폴더 또는 슬라이드 박스에 저장 될 수있다. 참고 : 슬라이드 -20 O를 C 또는 -80 O C와 형광에서 장기 저장 될 수는 몇 달 동안 유지됩니다. </li><li> 면역 염색 과정 중에 사용되는 이차 항체에 따라 적절한 파장의 공 초점 현미경을 사용하여 화상 슬라이드. 명도 및 콘트라스트 조정 촛점 벤더에 의해 제공된 이미지 소프트웨어를 이용하여 수행 될 수있다. </li></ol>

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<html> 성공적인 전체 마운트 해부 및 면역 염색에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이러한 방법 중 하나를 수행하지만 전에, 인공 조직의 적절한 고정이 필요하다. 우리는 메탄올 무료, 초순수, EM 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. PFA는 메탄올과 면역의 품질을 감소 불안정의 pH의 흔적을 가질 수 분말했다. 다른 그룹은 유사한 해부 포름 알데히드 14-16를 포함하지 않는 수 사용하여 고정 제는 것을 보여 주었다. 고정의 길이도 중요 항체 다릅니다. 다른 사람들이 PFA 단지 1 시간 잘 작동하지 않는 동안 일부 항체 (그러나이 드문), O / N 고정을 허용 할 수 있습니다. 조직이 떨어져 떨어지는에서 고정 조직은 절개 방법에 대한 문제가 될 수 있습니다. 우리의 경험에서 3-4 시간 고정 적절한 고정을 제공하며, 일반적으로 청각 분야에서 사용되는 일차 항체의 대부분을 방해하지 않습니다. &quot;jove_content&gt; 그것은 EDTA 차 항체를 방해 할 수있는 것이 가능...

측두골에 포함 된 내이의 나선형 모양의 달팽이관은 코르티, 포유 동물의 청각 감각 최종 기관의 장기 주택. 달팽이관 tonotopically 편성 일반적 혀끝, 중앙으로 분할하고, 기초가 정점 1베이스와 낮은 주파수 검출에 고주파 사운드 검출과 상이한 주파수 영역들에 대응하도록 설정 한. 헤어 셀, 코르티 기관의 mechanosensory 세포는 쥐 2,3 약 6mm 길이 달팽이관의 길이를 실행합니다. 이러한 셀 구조체 중심부의 청각 신경에 의해 처리되는 신호들로, 유체 충전식 멤브레인 미로를 통해 전송되는 음파의 기계적 에너지로 변환. 여기에 설명 된 기술은 (나이 일주일로부터 성인에 이르기까지의 샘플에 대해) 달팽이관의 석회화 후 코르티 기관의 전체 마운트를 제조하는 방법이 완료 제공한다. 우리는 또한 immunosta에 대한 방법을 제시한다전체 ining 인공 조직을 설치. 인공 와우 전체 마운트는 모든 유모 세포의 시각화 및 자연 공간 배치에서 지원하는 세포를 둘러싸는 매우 중요하며, 공 초점 현미경을 사용하여 세 가지 차원에서 분석 할 수 있습니다. 박사. 한스 엥 스트롬과 할로우 아데스는 원래 그들은 빠르게 현미경 분석 4 코르티 기관의 짧은 그대로 세그먼트를 보존, 수정 및 포유 동물의 다양한 액체에 잠긴 석회화 cochleae를 해부하는 방법을 자세히 설명 1966 년 전체 마운트 인공 해부 방법을 설명했다. 고정되지 않은, 석회화 쥐 달팽이관의 해부는 교육 비디오 5에 도시되어있다. 박사. 바바라 BOHNE 워싱턴 대학의 게리 하딩은이 방법에 몇 가지 중요한 수정을했다. 인공 전체 마운트 방법의 자신의 버전에서는 시간적 뼈, 탈회했다 플라스틱에 포함, 5 반 회전, 10 분기 턴은 dissec했다테드 6,7. 그 플라스틱 삽입이 8 필요하지 그래서 찰스 박사 Liberman과 이튼 피바디 연구소, 매사추세츠 눈과 귀 의무실에서 연구팀은이 기술을 수정했습니다. 기술의 추가 수정은 여기에 제시된 해부 방법을 알려 세인트 주드 아동 연구 병원 9-12 박사 지안 주오의 실험실에서 발생했습니다. 우리는 완전한 혀끝의, 중간 및 기저 회전의 분리를 허용 BOHNE와 Liberman보다 코르티의 기관에 액세스하기 위해 다른 전략을 사용합니다. 따라서 해부 조직은 크고 해부 또는 면역 염색 과정에서 손실되거나 손상 될 가능성이 적습니다. 또한, 현재의 방법은 팁 선단 또는 주파수 영역을 식별하는 기저 후크로부터의 거리 측정을 용이하게한다. 많은 연구소가 인공 조직의 면역 염색을 수행하지만이 방법이 발생한 위치, 그것은 명확하지 않다. 그 결과 buffe을 차단하기위한 다양한 조리법이있다RS 및 개별 일차 항체의 성능에 영향을 미칠 수있다 항체 인큐베이션 버퍼. 여기서는 청각 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 항체에도 적용 가능하다 형광 태그 항체로 면역 염색을위한 하나의 방법을 제시한다. 달팽이관의 복잡한 모양, 코르티 기관의 섬세한 구조 및 뼈에 넣음은 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 도전을 제공합니다. 다양한 기술이 현재 어려운 특징을 극복하고 코르티 자체 장단점 각 기술의 장기 내에서 세포를 시각화하기 위해 청각 분야에서 사용된다. 여기에 제시된 프로토콜은 약간의 수정과, 잠재적으로 다른 분야에서 사용되는 모델이 다양한 유기체로부터 cochleae 내의 중요한 구조를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 성인 마우스 달팽이관의 전체 마운트 박리 가능하고.

<table><tbody><tr><td>표준&nbsp; 패턴 펜치</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>는 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>10.5cm 파인 사이</td>언스 <td>도구</td><td>14060-11</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>2ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td>는 <td>다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>16% 포름알데히드, 메탄올 프리, 초순수, EM 등급</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIC --장갑을 착용하고 싱크대에 버릴 수 없습니다. 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수</td></tr> 있습니다. <tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>엔드 오버 엔드 튜브 로테이터</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td>은 <td>다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>60mm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Dow Corning Sylgard 184 실리콘 봉지재 키트</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>활성탄</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>실체 해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Dumont #4 보석상용 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 보석상용 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>곡선&nbsp;</td></tr><tr><td>5mm Vannas-Tubingen 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>스트레이트</td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>8웰 챔버 슬라이드 Fisher</td><td></td><td>1256518</td>는 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>는 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>3D 로테이터</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Western blot incubation box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr>.<td>금 페이드 방지 마운팅 미디어 Prolong gold Antifade Mounting Media</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>은 다른 공급업체에서 구매할 수 있지만, 마운팅 미디어는 광표백을 방지하는 능력이 다릅니다</td></tr>. <tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>는 다른 공급업체에서 구매할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 커버슬립 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>는 다른 공급업체에서 구입할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>투명 매니큐어</td>는 지역 <td>약국</td><td></td><td>에서 구입할 수 있습니다</td>골</tr><tr><td>판지 슬라이드 폴더</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>플라스틱 슬라이드 상자</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

내이의 달팽이관에 위치한 코르티 기관은 나선형으로 조직되어 있고 소리 감지를 위한 토노토피 구배를 가진 기계감각 유모 세포와 주변 지지 세포를 포함하고 있습니다. 쥐 달팽이관은 길이가 약 6mm이며 분석을 위해 종종 3개의 회전(정점, 중간 및 기저부)으로 나뉩니다. 세포 손실, 세포 분열 또는 모자이크 유전자 발현을 조사하려면 달팽이관의 전체 마운트 또는 표면 준비가 유용합니다. 이 해부 방법을 사용하면 면역염색 및 컨포칼 현미경과 결합하여 z축의 다른 평면에 있는 세포를 이미지화할 때 코르티 기관 내의 모든 세포를 시각화할 수 있습니다. 이러한 z-stack 이미지로부터 다중 광학 단면을 얻을 수도 있습니다. 또한, 전체 마운트 해부 방법은 주사 전자 현미경에 사용할 수 있지만 다른 고정 방법이 필요합니다. 여기에서는 코르티 기관을 3개의 온전한 달팽이관 회전(정점, 중간, 기저부)으로 분리하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생후 1주일부터 성인까지의 마우스에 사용할 수 있으며 달팽이관의 석회화가 불완전한 신생아 샘플에 사용되는 기술과 다릅니다. 약간 수정된 버전을 사용하여 쥐 달팽이관을 박리할 수 있습니다. 또한 형광 표지된 항체를 사용한 면역 염색 절차를 시연합니다.

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스) 그림 1에 제시된 키 해부 단계, 석회화이다 인공 조직에서 같이 코르티 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 개발의 첫 번째 출생 후 주의 석회화 중 마우스 달팽이관이 불완전하고 더 간단한 박리 법 (13)을 사용할 수있다. 코르티 기관의 P7에서 달팽이관과 눈물의 오래된 마우스 결과와 분쇄와 신생아 전체 마운트 해부 방법을 사용. 나선형 인대 / 측벽은 이제 더 단단히 부착되고 손상을 초래하지 않고 얻어 감각 상피로부터 박리 될 수 없다. 따라서 &quot;성인&quot;전체 마운트 해부 방법은 P6보다 오래된 샘플이 필요하다. 우리는 해부 헤어 셀 및 지원 세포 마커 (그림 2)와 면역 염색 된 P15 마우스 와우의 중간 차례의 예를 제시한다. 광 단면의 C또한, 전체의 실장 기술 (도 3)로 취득 될 수...

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

이 전체 마운트 해부법의 전반적인 목표는 석회화된 성체 와우의 감각 영역을 정점(apex), 중간(middle), 기저(base)의 세 가지 온전한 회전부로 분리하는 것입니다. 이 해부법은 코르티 기관(organ of Corti)의 3차원 구조를 보존하며, 면역염색 및 공초점 현미경과 결합하여 Z축의 서로 다른 평면에서 이미징함으로써 모든 세포를 시각화할 수 있게 합니다. 이전의 해부법과 비교하여, 본 방법은 더 크고 면역염색 과정에서 분실되거나 손상될 가능성이 적은 세 개의 와우 회전부를 생성하는 차별화된 전략을 사용합니다.해부 과정이 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 코르티 기관(organ of Corti)은 취약하므로 나선 인대(spiral ligament)를 제거할 때 오차 범위가 매우 좁습니다. 승인된 절차에 따라 동물을 안락사시키고 뇌를 제거한 후, 생쥐 두개골 바닥에서 측두골을 찾아 확인하는 것으로 시작하십시오.그 다음 표준 패턴 포셉을 사용하여 뇌신경을 긁어냅니다. 포셉을 이낭(otic capsule)의 끝부분에 놓고 반대쪽 손의 엄지손가락으로 후반고리관(posterior semi-circular canal)을 눌러 캡슐에 싸인 와우(cochlea)를 분리합니다. 엄지와 검지를 이용해 수동으로 하거나 10.5 centimeter 미세 가위를 사용하여 측두골의 하단부를 두개골에서 떼어낸 뒤, 고정을 위해 전자현미경 등급의 메탄올 프리 4%paraformaldehyde에 넣습니다.고정 후, 프로토콜의 서면 지침에 따라 측두골을 탈칼슘 처리합니다. 샘플이 충분히 탈칼슘 처리되었는지 확인하려면, 측두골을 실리콘 엘라스토머가 코팅된 해부 접시에 놓고 달팽이 모양의 와우를 핀셋으로 가볍게 누릅니다. 조직이 스펀지처럼 말랑말랑하다면 탈칼슘 처리가 완료된 것입니다.해부 접시에 PBS를 넣고, 실체 현미경 하에서 4번 또는 5번 핀셋으로 전정 부위의 측두골을 잡은 뒤, 5 mm Vannas-Tubingen 스프링 가위로 측면과 정점 상부의 과도한 이낭 조직을 잘라냅니다. 2.5 mm Vannas 스프링 가위의 한쪽 날을 난원창에 삽입하고 기저 회전의 나선 인대를 따라 여러 번 작게 절개합니다. 이제 5 mm Vannas-Tubingen 스프링 가위의 한쪽 날을 방금 절개한 부위에 삽입하고, 다른 쪽 날은 난원창의 내측인 측두골 외측에 배치합니다.이 절단은 기저 회전부를 중간 및 정점

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.

마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.

젊은 성인과 노인 Gerbil Cochleae의 면역 표지 및 카운팅 리본 시냅스

여기서는 소음성 난청(NIHL)의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제시합니다. NIHL을 유도하기 위해 골판지 플라스틱, 쥐덫 케이지 및 스피커를 사용하여 새롭고 간단한 장치를 개발했습니다. 청각 뇌간 반응과 면역형광 영상을 각각 사용하여 청력 기능과 외부 유모 세포 손상을 평가했습니다.

생쥐의 소음성 난청에 대한 수정된 실험 조건 및 청력 기능 및 외부 유모 세포 손상 평가

전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화하기 위해 광시트 현미경이 개발되었습니다.

광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.

단일 핵 시퀀싱 또는 면역염색을 위한 성인 마우스 줄무늬 혈관의 해부

생쥐 내이 조직의 초보 사용자를 위한 이 프로토콜은 단면 면역 염색을 위한 다양한 발달 단계에서 생쥐 내이를 처리하는 단계를 포괄적으로 자세히 설명합니다.

냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

학습하세요 성인 마우스 달팽이관의 전체 마운트 해부 및 면역 형광 기법을 통해 코르티 기관의 3차원 구조를 보존하고 모발세포와 지지세포를 정밀 관찰하는 방법을. 이 기술은 청각 연구에 필수적입니다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

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