Name: 왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 생쥐 심근 경색 모델에서 왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥을 영구 결찰하는 수술 기법을. 이 방법은 심장 생물학 및 심근 경색의 병태 생리학 연구에 활용됩니다.

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이 모델은 스위스 국립 과학 재단 (교부금 310030_162629 to LL)과 로잔 대학 병원의 흉부 외과 및 집중 치료 의학 서비스의 부서 기금의 지원으로 개발되었습니다. JL은 엠마 머샴 재단의 보조금을 수령합니다. 우리는 로잔 대학의 생물학 및 의학 학부의 수의사와 동물 시설 직원의 중요한 지원을 인정합니다. 우리는 로잔 대학 병원의 심장 수술 서비스에서 박사 주세피나 밀라노와 그들의 기술적 힌트에 대한 로잔 대학의 심장 혈관 평가 Facilty에서 알렉산드르 사레 박사에게 감사드립니다.

이 프로토콜에 기술된 동물 실험은 보 주 동물 윤리 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
참고: 이러한 실험을 위해, 우리는 25 g와 30 g 사이 무게 남성 C57Bl/6J 마우스와 8-12 주의 나이 사용. 마우스를 차우 펠릿 및 물 광고 리비텀을 사육하고 종래의 조건하에서 사육하였다. 수술 장비는 이전에 살균되었다. 실험자는 오염 및 수술 후 감염을 제한하기 위해 멸균 수술 장갑과 수술 용 마스크를 착용해야합니다.
1. 마취 및 기관 통조림.
<ol><li>마취제, 수술 후 진통 약물 및 인공 호흡기의 조수 부피의 복용량을 결정하기 위해 마우스를 무게. 37°C에서 가열 패드를 미리 데우다. 수술 설정은 그림1에 도시되어 있습니다.</li>
	<li>케타민과 자일라진을 각각 80 mg/kg과 10 mg/kg의 용량으로 혼합하여 마우스를 복강 내 주사합니다.</li>
	<li>전기 면도기로 목구멍과 흉곽의 왼쪽에 있는 마우스 털을 빠르게 면도합니다.</li>
	<li>꼬리 및/또는 뒷발을 꼬집어 마취깊이를 확인하고 동물을 가열 패드의 척추 자세로 정착시다. 눈의 과열을 피하기 위해 동물의 머리 아래에 작은 거즈 압축을 놓습니다. 안구 건조를 피하기 위해 안구 젤을 바르십시오.</li>
	<li>가열 패드 표면에 접착제 테이프로 네 개의 팔다리를 고정합니다. 상부 앞니 아래에 5-0 실크 봉합사의 루프를 전달하고 가열 패드에 접착제 테이프로 루프의 말단을 스틱. 이것은 동물의 입을 열어 놓고 구강 을 용이하게합니다.</li>
	<li>면도 전 부위에 제모 크림을 바르고 면봉으로 1분간 부드럽게 마사지합니다. 0.9% 식염수와 거즈방울을 사용하여 절개 부위를 청소하십시오. 면도 목과 흉부에 멸균 거즈 조각을 적용하고 요오도포비드톤에 담가. 참고 : 절개 부위에 국소 마취제 (리도카인 또는 부피바카인)를 적용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>인공호흡기를 조수부 7mL/kg, 환기속도 140스트로크/분당으로 설정합니다. 참고 : 지금부터 미세 수술 입체 현미경으로 작업.</li>
	<li>목의 중앙에 피부를 잡고 작은 가위를 사용하여 꼬리 / 두개 선 에 따라 0.5 cm의 절개를 수행합니다. 침샘의 엽을 분리한 다음 후두와 기관선이 보일 때까지 구부러진 해부 집게로 스테노이드 근육의 근막을 부드럽게 분리합니다. 탄성 밴드에 부착된 리트랙터로 개구부 가장자리를 고정합니다. 참고 : 근육의 절개없이이 단계를 수행하십시오. 숙련된 작업자는 이 단계를 선택사항으로 만드는 기관을 시각화하지 않고도 구강을 통해 동물을 삽관할 수 있습니다.</li>
	<li>혀를 옆으로 부드럽게 잡습니다. 집게로 16 G 캐뉼라의 무딘 내부 바늘을 기관에 삽입하십시오. 인후 절개를 통해 기관에 올바른 삽입을 시각화합니다.</li>
	<li>캐뉼라를 인공호흡기에 연결하고 배기 튜브를 물에 넣어 올바른 환기를 보장합니다. 거품의 존재는 올바른 삽관을 나타냅니다. 참고 : 수술 중에 조직을 젖은 상태로 유지하기 위해 0.9 %의 식염수 용액과 인후 절개에 요오도 포비드로 적신 멸균 거즈. 시술 중에 수분을 조절하십시오.</li>
</ol>2. LAD 관상 동맥 결찰
<ol><li>덕트 테이프에서 왼쪽 전방 발을 놓고 마우스를 오른쪽 디큐베이터 위치로 조심스럽게 옮니다. 동물이 올바른 위치에 있으면 왼쪽 전방 사지를 고정하십시오.</li>
	<li>왼쪽 가슴 경미한 주요 근육 사이의 라인을 식별하고 라인을 따라 가위로 1cm에 경사 피부 절개를합니다. 무딘 마이크로 가위를 해부하면 절개없이 가슴 근육의 분리 근막이 분리됩니다. 탄성 밴드에 부착 된 리트랙터로 분리 된 가슴 근육을 유지하십시오.</li>
	<li>3cm H2O의 양수 말기 기압(PEEP)으로 인공호흡기를 설정합니다.</li>
	<li>3rd와4 번째 갈비뼈 사이의 3rd 늑간 공간에서 무딘 집게를 사용하여 가슴 구멍을 엽니 다. 출혈의 위험이 있기 때문에 내부 흉동맥을 만지지 마십시오. 심장이나 폐를 만지지 마십시오. 흉곽에 두 개의 리트랙터를 적용합니다(그림2A).</li>
	<li>구부러진 미세 집게로 심낭을 조심스럽게 제거하고 심장과 폐를 손상시키지 않고 분리하십시오.</li>
	<li>왼쪽 전방 내림차순(LAD) 관상 동맥을 찾습니다. LAD 동맥은 왼쪽 auricle의 가장자리에서 정점을 향해 달리는 피상적 인 밝은 빨간 선으로 나타납니다.</li>
	<li>바늘 홀더를 사용하여 왼쪽 심실 아래 LAD 2 ~ 3mm 아래에 7-0 실크 봉합사를 전달합니다. 실크를 천천히 당겨 심장 조직의 찢어짐을 피하십시오. 합자를 세 개의 매듭으로 묶습니다. 좌심실의 왼쪽 아래 부분은 결찰 시 즉시 창백하게 바뀝니다 (그림2B-E). 참고: 심실 구멍깊숙이 들어가거나 너무 피상적으로 머무르지 않는 것이 중요합니다. 가짜 로 작동하는 동물의 경우, LAD 아래에 봉합사 실크를 당겨 천천히 조직이 찢어지지 않도록 제거하십시오.</li>
	<li>리브 리트랙터를 해제하고, 집게로 3rd 리브를 잡고 3rd 및 4번째 갈비뼈 아래 6-0 실크 봉합사로 두 번의 패스를합니다. 주의: 천공을 심부나 폐에 대지 마십시오. 아직 매듭을 조이지 마십시오.</li>
	<li>37°C 0.9% 식염수 3방울을 개구부에 놓고 폐를 제대로 팽창시키기 위해 2~3회 호흡주기 동안 만료 배기 튜브를 닫습니다. 봉합사를 조이고 두 번 던져서 단단히 고정하십시오.</li>
	<li>근육을 들고 있는 리트랙터를 놓고 올바른 장소를 되찾을 수 있도록 도와주세요.</li>
	<li>5-0 봉합사 실크의 두 바늘로 흉부 피부를 닫고 두 번 던져 서 두 개의 손가락으로 고정하십시오. 5-0 봉합사 실크의 스티치 로 목 피부를 닫고 두 번 던져 단단히 고정하십시오.</li>
</ol>3. 수술 후 절차 및 후속 조치.
<ol><li>팔다리에서 접착제 테이프 밴드를 제거합니다. 동물의 오른쪽에있는 가열 패드에 압축을 넣어. 참고 : 마취에서이 시점까지의 전반적인 절차는 40-45 분 이상 걸리지 않아야합니다. 선택적으로 깨어있는 과정을 가속화하기 위해 0.1 mg / mL의 농도로 아티파메졸의 IP 0.2 mL를 주입하십시오.</li>
	<li>복강 내 5% 포도당 용액의 0.3 mL를 37°C에서 미리 데운 다.</li>
	<li>조심스럽게 복부 방수에 동물을 압축 패드에 돌립니다.</li>
	<li>인공 호흡기를 중지; 마우스가 자발적으로 호흡하는 경우, 조심스럽게 캐뉼라를 제거합니다.</li>
	<li>피하 (SC) 0.1 mg/kg buprenorphine를 주입하고 30 °C에서 가열하고 100 % O2로 환기 된 미리 따뜻하게 케이지에 마우스를 넣어 1 시간 의 최소 1 시간. 과도한 호흡 곤란이나 출혈과 같은 생명을 위협하는 상태에 대한 모니터 마우스.</li>
	<li>수술 후 2일 동안, 매일 두 번 마우스를 모니터링하십시오. SC를 주입 0.1 mg/kg buprenorphine 매일 두 번. 복강 내 주입 0.3 mL 0 의 5% 포도 당 솔루션 매일 두 번. 부드러운 다이어트와 물 광고 리비텀 마우스를 제공합니다. 필요한 경우 동물을 데우습니다. 참고 : 오피오이드 외에도 동물은 식단에 혼합되거나 식수에 희석된 비 스테로이드 성 항 염증 약물을 제공해야합니다.</li>
	<li>동물이 일반적인 외관, 호흡 또는 행동에 관한 특이한 징후를 나타내는 경우 3 일째부터 SC 0.1 mg / kg buprenorphine을 매일 두 번 주입하십시오. 동물이 여전히 체중을 잃고있는 경우 복강 내 주입 5 % 포도당 용액 의 매일 두 번. 필요한 경우 동물을 따뜻하게 하십시오. 참고: 과도한 고통을 피하기 위해 필요한 경우 미리 정의된 중단 기준을 엄격하게 적용하십시오. 일반적으로 마우스는 3 일과 4일까지 체중을 잃고 체중을 증가시면 됩니다. 7 일 후, 마우스는 일반적으로 사전 작업 무게를 검색합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 절차의 첫 번째 중요한 단계는 확실히 삽관입니다. 우리는 기관 관으로 16 G 카테터의 무딘 내부 바늘을 사용합니다. 무게가 22g 미만인 마우스에서는 이 설정을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이 설치를 사용하면 기관을 손상시키지 않고 더 작은 체중으로 마우스를 제대로 삽관하기가 어려울 수 있습니다. 또 다른 중요한 점은 기관 및 흉곽을 노출하는 동안 근육에 만든 절개를 제한하는 것입니다. 조직 손상을 감소시키는 것은 중요한 중요성, MI 에 후에 선동적인 프로세스를 공부할 때 특히. 그래서 우리는 집게와 리트랙터8,9와근육과 갈비뼈의 부드러운 확산을 선호하는 이유입니다 . 우리는 출혈을 제어하기 위해 전기 소작기를 사용하지 않습니다10. 이 불성 화상을 일으킬 수 있습니다 및 감염을 선호. 외상과 감염 둘 다 선동적인 독서를 편견할 수 있습니다. 3 cm H2O의 외인성 PEEP의 적용은 환기 배기를 물 튜브로 급락시킴으로써 thoracotomy 동안 종말 폐포 붕괴를 제한한다. LAD의 국소화는 또 다른 중요한 단계이며 관상 동맥의 해부학은 마우스(11)의 변형 및 유전자형에 따라달라질 수 있음을 명심해야 한다. LAD를 시각화하는 데 약간의 경험이 필요하지만, 절차에 설명된 바와 같이 봉합사를 왼쪽 심실 아래에 직접 2-3 mm 를 배치하면 결찰의 정확한 위치 가 허용된다. 봉합사 아래 좌심실의 많은 부분을 즉시 변색하여 정확도를 확인합니다. 마지막으로, 가슴 폐쇄 시 2-3호흡사이클에 대한 환기 배기 가스를 차단하여 자동 PEEP를 인위적으로 적용하면 폐의 일시적인 과인플레이션이 가능하여 흉부구멍(12)에서공기를 쫓는 데 도움이 된다. 우리는 의도적으로 9,10에표시된 것처럼 소실을 수행하지 않습니다 . 이런 식으로, 우리는 폐와 심장 상해의 리스크를 제한하고 과도한 조직 손상 또는 천공을 피합니다.
심근 허혈 재관류 (I /R)는 진료소에서 MI 환자에게 행해진 관상 동맥 혈류의 회복을 모방하는 관련 외과 모델입니다. I/R 모델 동안 관상 동맥의 과도 폐색은 20 내지 45 분8,13의기간 동안 LAD에 튜브조각을 조임으로써 수행된다. 그런 다음 폐색은 원하는 기간 동안 심근의 재관류를 허용하기 위해 방출됩니다. 우리의 프로토콜에 적용이 간단한 수정은 쉽게 I / R 모델4,8,14,15로설정할 수 있습니다 . 경색은 심장 트로포닌 T8,10 또는 심초음파15에대한 혈액 검사를 통해 확인할 수 있다.
MI는 그 자체로 재관류가 부상을 유발하기 때문에 I/R 모델과 다릅니다. MI는 더 많은 조직 괴사를 유도하고 apoptosis는 레퍼퓨드심근 5에서 더 두드러집니다. 염증성 세포의 역학은 또한 MI 7에서 면역 세포의 지연된 심근 침윤을 가진 MI및 IR에서상이하다. 경색 영역의 크기와 위치는 영구 결찰과 I/R 모델(15)간에도 다를 수 있습니다. 이 점을 염두에 두고 I/R 및 영구 MI 모델이 동일하지 않으므로 관련 모델을 선택해야 합니다. 심근 경색의 또 다른 뮤린 모델은 극저온 경색 모델입니다. LV 전방 벽에 극저온 프로브를 적용하여 LAD 동맥에서 심실 조직의 동결 및 혈류 검지를 유도합니다. 그러나이 기술은 리모델링 및 염증 반응의 타이밍 및 진폭에 관한 MI 및 I / R 기술과 다릅니다16,17.
가변성은 모든 외과 적 절차에 관해서는 제한이다. 이 가변성은 생물학적 차이에 의존합니다. 좋은 예는 마우스(11)에서 관상동맥배열의 변이이다. 또한 실험자 기술에 의존합니다. 이 모델로 안정적인 결과를 얻으려면 실험자의 적절한 교육이 필수적이라는 점을 언급하는 것이 좋습니다. 잘 훈련된 실험자는 재현 가능한 경색 크기를 쉽게 생성할수 있습니다(그림 3A-B). 모델의 치수는 LAD의 위치, 실험 기간(일, 주), 마우스 변형 및 유전자형에 따라 달라집니다. 마취제와 진통 약물의 종류는 또한 putative 심장 보호 또는 심장 우울효과를 가진 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 손에, 이 모형은 25-30%의 글로벌 사망률이 있습니다. 이 사망률은 균주와 실험 기간에 관계없이 실험이 끝나기 전에 자발적인 사망과 희생을 포함한다. 죽음 또는 희생의 대부분은 수술 후 두 번째와 네 번째 일 사이. 엄격한 통증 관리를 적용하고 동물의 후속 은 사망률을 줄일 수 있습니다.
여기서 우리는 각각 서부 블롯 및 실시간 PCR에 의해 LV에서 염증성 또는 섬유성 과정에 관여하는 단백질 및 유전자의 TTC염색 및 발현을 이용하여 분석된 경색 크기의 대표적인 결과를 제시한다(도 3C-G). 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA) 또는 효소 분석에 의해 이들 파라미터의 많은 부분을 측정할 수도 있다. 물론, 테스트해야 할 가설에 따라, 이 방법은 압력과 부피의 초음파, MRI 또는 내식 카테터 측정에 의한 모든 기능적 분석을 따를 수 있다. 그것은 또한 심장을 추출 하 고 격리 된 세포에 심장 세포 생물학을 추가 조사 가능. 전반적으로, LAD 관상 동맥의 영구 결찰을 가진 MI 모델은 심근 경색 에 이어 염증 성 및 섬유성 과정, 상처 치유 및 심장 기능의 변화를 평가하는 데 특히 유용합니다.

급성 심근 경색 (MI)은 허혈성 심장 질환 (IHD)의 가장 심각한 발현이다. IHD는 전 세계적으로 사망률과 사망의 주요 원인, 특히 서방 국가에서1. 따라서 의료 시스템에 막대한 경제적 영향을미칩니다 2. MI는 죽상 경화성 플라크에 의한 관상 동맥의 폐색과 심근의 큰 부분에서 혈류의 후속 체포를 특징으로합니다. 심근에 있는 산소 공급의 부족은 심근세포의 허혈성 죽음으로 이끌어 냅니다. 이 병리학 적 상태는 궁극적으로 심실 기능, 리모델링 및 심부전의 결핍으로 이어지는 심실조직의 반응을 유발합니다 3. MI는 조절 된 세포 죽음, 산화 스트레스에 대한 반응, 염증, 상처 치유, 섬유증 및 심실 리모델링을 포함하는 여러 복잡한 생물학적 과정을 포함하는 복잡한 병리생리학적 상태입니다. 이러한 생물학적 반응 중 일부는 괴사 유발 방출과 같은 시험관내 개별 프로세스로서 모델링되어 손상관련 분자 패턴 및 관련 염증 반응 4. 이러한 단순화된 모델은 MI를 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 생체 내 모델만이 MI에 반응하여 생물학적 과정복잡성에 대한 사실적인 이미지를 제공할 수 있다.
돼지와 같은 더 큰 동물에서 MI의 모형이 MI의 인간 적인 병리생리학에 더 밀접하게 관련될 수 있더라도, 뮤린 모형의 힘은 그밖 포유류 종에서 보다는 더 진보된 유전 공학에 의해 제안된 가능성에 있습니다. 다른 무시할 수없는 측면은 상대적으로 낮은 비용과 수술 설정의 단순성이다.
심근의 허혈 재관류 모델은 영구 MI 모델과 다른 결과를 나타낼 수 있음을 언급 할 가치가 있습니다. 심근 조직에서 염증 및 상처 치유 반응의 세포 사멸의 유형, 품질 / 진폭 또는 역학과 같은 생물학적과정은 모델 5,6및7에따라 다를 수 있습니다. 그러나, 영구 관상 동맥 폐색의 이 프로토콜은 허혈 재관류 모델을 얻기 위해 용이하게 적응될 수 있다.
이 방법은 reperfusion없이 MI의 물리 병리학과 관련된 연구에 관련되어 있으며 국소 심장 조직 및 전신에서 관상 동맥 폐색 (분)에서 후기 심장 마비 (주)까지 발생하는 병리학 적 과정을 모니터링 할 수 있습니다. 수준.

<table><tbody><tr><td>1 CC 주사기, Omnifix-F</td><td>B. Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>30G- 바늘</td><td>BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>베타딘 60 ml</td><td>MundiPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무딘 견인기</td><td>정밀 과학 도구</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 바늘 홀더 스트레이트 잠금</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>어플리밍 SA</td><td>6001109</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위, 곡선</td><td>Aesculap</td><td>BC603R</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>Remington</td><td>HC720</td><td></td></tr><tr><td>포도당 5% B.Braun</td><td>B. Braun</td><td>531032</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림, Veet</td><td>Silk & 신선한 기술.</td><td></td><td></td>8218535</tr><tr><td>아이리스 해부 펜치 풀 커브드</td><td>Aesculap</td><td>&nbsp; OC022R</td><td></td></tr><tr><td>Ketasol 100 (100 mg/ml)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위, 곡선형 둔탁/둔탁</td>한 <td>Aesculap&nbsp;</td><td>FM013R</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9% B. Braun</td><td>B. Braun</td><td>534534</td><td></td></tr><tr><td>Short Fixator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-01</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합사 5-0, BB</td><td>Ethicon</td><td>K880H</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합사 6-0, P-1</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합사 7-0, BV-1</td><td></td><td>Ethicon K804</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #7 집게</td><td>파인 과학 도구</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>학생용 세밀한 펑크-각도</td><td>미세 과학 도구</td><td>91110-10</td><td></td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>Weitacare</td><td>834301</td><td></td></tr><tr><td>수술용 발열 패드</td><td>개인화 설정</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic&nbsp; sol 0.3 mg/ml&nbsp; Buprenorphine</td><td>Indivior Schweiz AG</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>16G iv 고양이의 기관 튜브 내부 바늘</td><td>Abbocath-T</td><td>G714-A01</td><td></td></tr><tr><td>범용 S3 현미경, OMPIMD</td><td>Zeizz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인공 호흡기, MiniVent 모델 845</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>1551535</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol(1mg/ml)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr></tbody></table>

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

심근 경색 (MI) 및 급성 관상 동맥 질병은 서쪽 생활양식에 인구에 있는 죽음의 가장 두드러진 원인 중 입니다. 좌측 전방 내림차순 (LAD) 관상 동맥의 영구 결찰을 가진 MI의 뮤린 모형은 인간에 있는 MI를 밀접하게 모방합니다. Murine 모델은 요즘 사용할 수있는 광범위한 유전 공학의 혜택을 누릴 수 있습니다. 여기서 우리는 영구 LAD 관상 동맥 결찰에 의한 심근 경색의 재현 가능한 뮤린 수술 모델을 제안합니다. 우리의 기술은 길항제의 투여에 의해 빠르게 반전 될 수있는 케타민 / 자일라진마취, 기계적 보조 환기를위한 기관 절제술없이 삽관, 외인성 양성의 적용으로 환기를 포함합니다. 폐포 붕괴를 피하기 위해 말기 압 (PEEP), 골격 근육에 만든 최소 수술 병변으로 제한 하는 thoracotomy 방법, 그리고 thoracentesis 없이 폐 인플레이션. 이 방법은 드물게 침습적이고 재현 가능하며 수술 후 사망률과 합병증을 감소시킵니다.

마우스는 수술 후 7일 동안 안락사시켰다. 동물은 80 mg/kg 케타민과 10 mg/kg 자일라진으로 마취시켰다. 마취 하에, 혈액은 정맥에서 뽑혀심장을 샘플링하였다. 심토리를 제거하고, 심근을 얼음으로 차가운 PBS로 세척시켰다. 허혈성 영역의 측정을 위해, 심장은 -20°C에서 40분 동안 동결한 다음, 2% 트리페닐테트라졸륨 염화물(TTC)을 함유하는 PBS에서 37°C에서 20분 동안 슬라이스하고 염색하였다. 심장 슬라이스는 실온에서 4% 완충 파라포름알데히드 용액으로 하룻밤 동안 고정시켰다. 허혈성 영역은 염색되지 않은 채로 남아 있었지만 살아있는 조직은 탈수소 효소의 존재로 인해 빨간색으로 염색되었습니다. 허혈성 영역은 이미징 소프트웨어를 가진 좌심실(LV)의 백색 영역의 백분율로 계산하였다(도3A,B). 생화학 및 분자 생물학 분석을 위해, 마음은 액체 질소에서 동결되었습니다. 액체 질소에 하트를 연후 기관 분말단백질 및 mRNA 추출에 사용되었다. 경색된 심근 의 심근 조직에서 섬유증의 정도는 각각 myofibroblasts및 TGFβ 신호 화 활성화의 중요한 판독인 알파 평활근 actin (αSMA) 및 SMAD2 인산화의 서쪽 얼룩 분석에 의해 평가되었습니다 그림3C)를 참조하십시오. Tgfb의mRNA 발현, 및 다운스트림 타겟 Ctgf, Postn 및 Il11은 모두 심근 섬유증의 지표이다. 이는 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석(도3D)에의해 나타났다.
프로-염증 성 신호 경로 및 프로 염증 성 유전자의 발현은 일반적으로 심근 경색 다음 첫 주 이내에 활성화 발견 되었다. NF-θB p65 전사 인자의 인산화는 염증의 특징이며 MI 마우스의 전체 심근 추출물에서 관찰되었다(도3E). mRNA 의 염증성 유전자 Il1b, Il6 및 Cxcl10 (도3F)및 단핵구/대식세포 마커 Cd14 및 Mertk의 발현은 실시간 PCR(그림3G)으로분석하였다. 참고로 NF-θB p65 및 SMAD2 인산화의 범위에서 가변성이 있었다(도3C,E,레인 4-7). 이러한 가변성은 경색의 크기에 크게 좌우됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig1.jpg"> 그림 1 : 수술 설정에 대한 설명. (A) 수술 설정은 탄성 밴드에 부착 된 변형 된 가열 패드, 인공 호흡기 및 리트랙터를 포함한다. (B) 수술 중 사용되는 가위, 집게 및 바늘 홀더 세트. (C) 미니 리트랙터의 클로즈업. 표시되지 않음: 외과 용 스테레오 현미경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig2.jpg"> 그림 2 : 수술 및 LAD 결찰의 대표적인 이미지. (A) 리트랙터가 있는 가슴을 열었습니다. 좌심실은 명백했다. 상부, 좌측 및 하단 리트랙터는 흉곽을 잡고 오른쪽 리트랙터는 가슴 근육을 개최했다. (B) 바늘을 LAD 아래에 통과시켰다. (C) 봉합사 실크를 LAD 하의 밑에, 좌심실로 통과시켰다. (D) LAD에 단일 스티치. (E) 결찰 절차의 끝, 봉합사는 3개의 매듭으로 고정하였다. (F) 심장의 전방 시야를 표현합니다. LAD 결찰의 위치는 LAD의 왼쪽 심소와 상기 대각선 분지 보다 2-3 mm 였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig3.jpg"> 그림 3 : 수술 후 7일간 의 섬유증과 염증이 심근 추출물 전체에 함유되어 있습니다. (A) TTC 염색의 대표적인 이미지는 수술 후 7일 간 경색된 심장의 염색을 한다. 창백한 허혈성 영역은 염색되지 않은 흰색으로 남아 있는 반면 살아있는 조직은 빨간색으로 염색되었습니다. 결찰은 왼쪽에서 세 번째 슬라이스에 볼 수 있었다. (b) 5개의 경색된 하트의 허혈성 영역의 크기를 TTC 염색 기술을 사용하여 측정하였다. 결과는 좌심실(LV)의 백색 영역의 백분율이었다. (C) 섬유증의 지표로서 전체 심근에서 SMAD2 인산화 및 알파-SMA 발현의 서방 블롯 분석. (D) 전체 심근 추출물에서 Tgfb, Ctgf, Postn 및 Il11의 mRNA 발현. (E) 전체 심근 추출물에서 NF-θB p65 인산화의 서양 블롯. (F) 전체 심근 추출물에서 염증성 유전자 Il1b, Il6 및 Cxcl10의 mRNA 발현. (g) cd14 및 Mertk의 mRNA 발현은 각각 단핵구/대식세포 및 식세포 대식세포의 심근내 존재의 지표로서. N = MI 그룹에서 샴3및 N = 4. mRNA 발현 분석의 경우, 발현은 내인성 대조군 Rps18을 상대적이었고, 그룹 비교는 짝이 없는 학생의 T-검정, *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001이었다. 패널 B, D, F 및 G 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서 우리는 마우스에서 좌측 전방 의 관상 동맥의 영구적 인 결찰을 달성하는 방법을 보여주는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모형은 심근 경색의 병리생리학 및 수반되는 생물학 프로세스를 조사하기 위하여 높은 관련성입니다.

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

심근 절범의 이 뮤린 모델은 관상 동맥 폐색에서 현지 심장 조직 및 전신 수준에서 후기 심부전으로 발생하는 병리학적 과정을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법은 현재 심장 생물학 및 생리학에 사용되는 모든 판독과 호환됩니다. 또한, 그것은 뮤린 유전 모델의 엄청난 다양성에서 혜택을.적절한 수술 기술을 습득하는 데는 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 절차는 숙련 된 연구원과 단계적으로 학습하는 것이 가장 좋습니다. 이 뮤린 모델의 시각적 데모는 외과 적 수술에 도움이 되고 학습 과정을 가속화 할 수있는 힌트를 공유 할 수 있습니다.전기 면도기를 사용하여 마취, 25-30그램, 남성, C57-Black/6 마우스를 목구멍과 늑골 케이지의 왼쪽에 빠르게 면도합니다. 발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인합니다. 동물의 눈에 연고를 바르습니다.가열 패드에 수핀 위치에 마우스를 배치하고 눈과 열을 피하기 위해 머리 아래에 작은 거즈 압축을 배치합니다. 접착제 테이프로 팔다리를 고정합니다. 상부 절개 아래에 5-0 실크 봉합사의 루프를 전달하고, 캐닝 중에 입을 열어 두기 위해 가열 패드에 루프의 극단을 고정합니다.미리 면도된 부위에 탈모 크림을 바르고 면봉으로 1분간 부드럽게 마사지하세요. 거즈로 과도한 모피와 크림을 제거하고 0.9% 식염수와 거즈를 떨어뜨려 노출된 피부를 청소합니다. 멸균 거즈 조각을 면도된 목구멍과 흉부에 바르고, 이오도포비단으로 거즈를 담그세요.인공호흡기를 킬로그램당 7밀리리터의 조수부와 분당 140스트로크의 환기속도로 설정합니다. 미세 수술 스테레오 현미경으로 마우스를 이동합니다. 목의 중앙에 피부를 잡고, caudal / 세팔 라인을 따라 0.5 센티미터 절개를하고, 타액 선의 엽을 분리합니다.후두와 기관진이 보일 때까지 구부러진 집게를 사용하여 스테르노하이드 드 근막의 근막을 부드럽게 분리하십시오. 그런 다음 탄력적 밴드에 리트랙터가 부착되어 개구부 가장자리를 고정합니다. 다음으로, 혀를 옆으로 부드럽게 당기고, 집게를 사용하여 16 게이지 캐뉼라의 무딘 내부 바늘을 기관지에 삽입합니다.인후 절개를 통해 기관체에 올바른 삽입을 시각화하고 캐뉼라를 인공호흡기에 연결합니다. 멸균 0.9%의 식염수에 요오도포비도에 담근 거즈를 절개에 두어 작업 중에 조직을 젖은 상태로 유지합니다. 그런 다음 배기 튜브를 물에 넣습니다.거품의 존재는 성공적인 삽관을 나타냅니다. 좌측 전방 내림차순 관상동맥 또는 LAD의 결찰을 위해 마우스를 오른쪽 디큐비투스 위치로 조심스럽게 이동하고, 새로운 위치에서 왼쪽 전방 사지를 재확보한다. 왼쪽 가슴절부미와 주요 근육 사이의 선을 식별하고 선을 따라 경사 1 센티미터 피부 절개를합니다.무딘 해부 마이크로 가위를 사용하여 조직을 절개하지 않고 가슴 근육의 근막을 분리하고, 분리를 유지하기 위해 탄성 밴드에 부착 된 재트랙터를 사용합니다. 3센티미터의 물의 양수 종기 기만 압력으로 인공호흡기를 설정합니다. 무딘 집게를 사용하여 세 번째 갈비뼈와 네 번째 갈비뼈 사이의 세 번째 늑간 공간에서 가슴 구멍을 엽니다.두 개의 리트랙터를 갈비뼈에 넣고 각 갈비뼈에 하나씩 놓고 곡선이 있는 미세 포셉을 사용하여 심혼과 폐에 해를 끼치지 않고 심근을 조심스럽게 제거합니다. 왼쪽 아우리클 가장자리에서 정점을 향해 흐르는 피상적인 밝은 빨간색 선으로 LAD를 찾습니다. 바늘 홀더를 사용하여 왼쪽 아리아 아래 2~3mm 의 LAD 아래 실크 봉합사를 7-0으로 전달합니다.심장 조직이 찢어지는 것을 피하기 위해 천천히 실크를 당기고 합자를 3 노트로 묶습니다. 왼쪽 심실의 왼쪽 아래 부분은 결찰 시 즉시 창백하게 변합니다. 이제 갈비뼈 리트랙터를 풀어주며 세 번째 갈비뼈를 집게로 잡고 세 번째 갈비뼈와 네 번째 갈비뼈 아래 6-0 실크 봉합사로 두 번의 패스를 만듭니다.37도 섭씨 0.9% 식염수 용액 3방울을 개구부에 놓고 폐를 제대로 팽창시키기 위해 2~3회 호흡주기동안 만료 배기 튜브를 닫습니다. 두 번의 던지기로 봉합사를 조이고 고정하고 근육을 들고 있는 리트랙터를 풀어 근육이 올바른 해부학 적 위치로 돌아갈 수 있도록 돕습니다. 그런 다음 두 개의 바늘과 5-0 봉합사 실크의 두 개의 던지기로 흉부 피부를 닫습니다.5-0 봉합 실크1개의 스티치와 2개의 던지기로 목 피부를 닫습니다. 절차가 끝나면 팔다리에서 테이프 밴드를 제거하고 동물을 조심스럽게 압축 패드에 복부 디큐비투스로 돌리고 동물의 오른쪽에있는 가열 패드에 압축을 놓습니다. 37도-섭씨 5%의 포도당 용액의 0.3 밀리리터를 내분하였습니다.인공 호흡기를 중지합니다. 마우스가 자발적으로 호흡하는 경우 조심스럽게 캐뉼라를 제거하십시오. 피하 부프레노르핀킬로그램당 0.1 밀리그램을 피하한다.모니터링을 통해 적어도 1시간 동안 100%의 산소로 통풍이 잘되는 섭씨 30도 케이지에 마우스를 놓습니다. 수술 후 2 일 동안, 부드러운 다이어트와 물 광고 리비툼으로 마우스를 제공, 필요에 따라 동물을 따뜻하게. 수술 후 7일 후, 허혈성 부위는 염화삼페닐테트라졸륨에 의해 얼룩지지 않은 채로 남아 있는 반면, 살아있는 조직은 탈수소효소의 존재로 인해 붉게 얼룩지게 됩니다.허혈 영역은 이미징 소프트웨어 프로그램에서 왼쪽 심실의 흰색 영역의 백분율로 계산할 수 있습니다. 알파-부드러운 근육 액틴 및 SMAD2 인산화를 위한 서양 얼룩 분석은 각각 근섬유아세포의 주요 판독값이며 성장 인자 베타 신호 활성화를 변화시키는 데 사용될 수 있으며, 경질된 심근 조직의 근심 조직 내에서 섬유증의 정도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 성장인자 베타및 다운스트림 표적 mRNA 발현의 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석은 심근 섬유증의 존재를 평가하기 위해 수행될 수 있다.항염증성 신호 경로 및 프로 염증 유전자의 발현은 전형적으로 심근 경색 후 첫 주 이내에 활성화되는 것으로 나타났습니다. 프로 염증 유전자 및 단핵구/대식세포 마커의 mRNA 발현도 관찰된다. 결찰 높이는 생존에 비판적으로 영향을 미치고 LAD 분기가 다를 수 있으므로 각 변형 또는 유전자형에 적응해야 합니다.결찰의 상수는 재현 가능한 결과를 얻는 열쇠입니다. 이 절차는 어떤 분석 방법과 결합될 수 있고 기능 분석, 조직 고정, 세포 배양, 또는 관심있는 어떤 기술에 선행될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 심근 국소 빈혈의 pathobiological 및 pathophysiological 프로세스를 연구하기위한 빠르고 안정적​​인 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

내사 - 결합 : 심근 경색의 Murine 모델

수많은 유전자 조작 및 / 또는 유전자, 단백질, 세포 및 / 또는 biomaterials의 intramyocardial 주사는 급성 국소 빈혈 / reperfusion 부상과 생쥐의 만성 리모델링의 연구에 시간의 차원에 따라 겹쳐있다. 이 동영상은 국소 빈혈 / reperfusion에 대한 microsurgical 절차, 영구적인 관상 동맥 내고, 그리고 intramyocardial 사출 공부를 보여줍니다.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

쥐 실험 심근 경색을 유발하는 데 사용되는 외과 수술은 심장과 왼쪽 폐의 앞쪽 표면을 시각화하기 위해 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 왼쪽 thoracotomy로 시작합니다. 왼쪽 관상 동맥이 출혈도 잡았되어 가슴이 폐쇄되고 마우스가 저절로 복구 할 수 있습니다.

마우스의 관상 동맥 결합에 대한 수정 기술

이 비디오에서는 좌측 전방 하행 관상 동맥을 영구적으로 결찰하여 심근 경색의 마우스 모델을 생성하는 수술 절차에 대해 설명합니다.

심근경색의 쥐 모델 생성: 마우스 모델에서 좌측 전방 하행 관상동맥의 영구 결찰을 위한 수술 절차

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

심부전은 입원의 주요 원인이자 사망의 주요 원인입니다. 마우스에서 좌측 전방 하행 관상동맥의 영구 결찰 모델을 적용하여 심근경색 후 심실 리모델링 및 심장 기능 장애를 조사합니다. 마우스의 침습적 혈류역학적 측정 기술이 제시됩니다.

마우스의 왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰 : 심근 경색 리모델링과 심장 마비의 모델

우리는 마우스 모델에서 좌측 전방 하행 동맥(LAD) 결찰에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 기관 내 삽관, 좌측 개흉술 접근법 및 흉강천자를 포함하는 다른 방법보다 상대적으로 덜 침습적입니다. 이 방법은 급성 및 만성 심근 경색(MI)에 대한 모델로 사용할 수 있습니다.

쥐 왼쪽 앞쪽에 내림차순 (LAD) 관상 동맥 결찰 : 심근 경색에 대한 개선 및 단순화 된 모델

이 프로토콜은 심낭과 그 내용물을 보존하면서 마우스에서 심근 경색을 유도하는 단계를 설명합니다.

온전한 심낭 허혈성 설치류 모델

여기서는 미세 조작을 통해 좌측 전방 하행 관상동맥의 정밀 결찰에 의해 마우스에서 심근경색 또는 심근 허혈 재관류 손상을 유도할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다.

마우스의 심근경색 및 심근 허혈-재관류 손상 유도

여기에 제시된 것은 생쥐에서 왼쪽 관상 동맥의 영구 결찰을위한 수술 절차입니다. 이 모델은 심근 경색 후 병태생리학 및 관련 염증 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

좌측 관상동맥 결찰술: 심근경색의 외과적 쥐 모델

배우세요 생쥐 심근 경색 모델에서 왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥을 영구 결찰하는 수술 기법을. 이 방법은 심장 생물학 및 심근 경색의 병태 생리학 연구에 활용됩니다.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

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