Name: 자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 배우세요 마우스 안구 표면 세포에서 UV-C 손상에 따른 ROS 및 세포 생존율을 동시에 검출하는 방법을. DCFDA, 프로피듐 요오드화물, Hoechst 염색을 활용하여 산화 스트레스와 세포 사멸을 정량적으로 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 예네포야 연구 센터, 예네포야 (대학으로 간주)의 지원을 인정 인프라 시설에 대한.

실험은 스위스 알비노 마우스 눈에서 유래한 1차 안구 세포/줄기 세포에서 수행되었다. 이 실험을 위해 눈을 채취하기 위한 동물의 사용은 기관 동물 윤리위원회, 예네포야(대학로 간주됨)(IEAC 승인 번호, 6a/19.10.2016)에 의해 승인되었다.
1. 시약의 준비
참고 : 마우스 안구 표면에서 1 차 세포 / 줄기 세포의 유도는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러므로, 우리는 UV-C 노출 복용량, ROS, 살아있는 죽은 세포 및 그들의 정량화를 평가하기 위한 시약 준비를 설명합니다. 시약의 각각부(최종 염색 용액을 얻기 위해 첨가될 10% 태아 소 혈청, DCFDA, Hoechst 및 프로피듐 요오드화 스톡 용액)에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
<ol><li>DMSO 5.13 mL에 25 mg의 DCFDA 분말을 용해시켜 10 mM DCFDA의 재고 용액을 준비하십시오. Aliquot 250 μL 각각 호박색 1.5 mL 튜브에 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>10 mg/mL(16.23 mM 용액)의 스톡 용액을 준비하여 2.5 mL의 탈이온수에서 25 mg 바이알의 전체 내용을 용해시킴으로써 Hoechst 33342를 준비합니다. 호박색 미세원원지 튜브에 100 μL의 알리쿼트를 만들고 최대 6개월 동안 2-6°C에 보관하십시오. 장기간 보관을 위해 -20°C에 보관하십시오.</li>
	<li>탈이온수에서 1 mg/mL 프로피듐 요오드화물의 스톡 용액을 준비하고, 호박색 1.5 mL 튜브에 각각 1 mL을 aliquot하고, 4 °C에서 저장합니다.</li>
</ol>2. 세포 도금 및 UV-C 방사선 처리
<ol><li>도금 전에, 우리 실험실에서 분리된 마우스 1차 안구 표면 세포를 해리(미공개 결과; 이러한 세포는 각막 상피, 기질 세포 및 각화세포의 혼합물)을 부드러운 세포 해리제를 사용하여해리한다(자료표).</li>
	<li>플레이트 0.2 x 106 마우스 1차 안구 표면 세포를 35 mm 0.2% 지하 막 매트릭스 코팅 세포 배양 접시에 2.5 mL의 완전한 배지. 5%CO2 및 가습 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양한다. 참고: 마우스 안구 표면에서 1차 세포를 배양하기 위한 완전한 매체는 20% FBS, 1% 펜 스트렙, 1% 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 1% 피루브나트륨 및 0.1% β-메르카포에탄올을 함유하는 DMEM 고혈당으로 구성됩니다.</li>
	<li>UV-C의 각종 복용량에 세포를 드러내기 전에, 매체의 최대 양을 버리고 매체의 얇은 층 (~500 μL)만 세포와 접촉하는 것을 허용합니다, 그(것)들을 커버하기 위하여 충분히.</li>
	<li>UV-C 소스 / 챔버 (하이브리드 화 오븐 / UV 크로스 링커의 하부 챔버)에 한 번에 하나씩 접시를 가져 가라. 재료 표)를 참조하십시오. 접시를 챔버에 넣고 접시 뚜껑을 제거합니다. 접시의 열린 뚜껑 위치는 세포가 UV-C 노출 동안 최대 UV-C 용량을 수신하도록 보장합니다.</li>
	<li>UV-C의 다른 등급 / 복용량에 세포를 노출 : 1 J /m2,100J /m2,1,000 J /m2 및 10,000 J /m2.</li>
	<li>UV-C 노출 후, 각 접시의 뚜껑을 즉시 교체하고 UV-C 소스 챔버에서 제거하십시오.</li>
	<li>각 접시를 층류 공기 흐름 후드에 가져와서 신선한 완전한 매체 2 mL로 각 요리를 마무리하십시오.</li>
	<li>37°CCO2 인큐베이터에서 3시간 동안 세포를 배양한다. 3시간의 배양 후 UV-C 노출은 초기 효과를 시각화하고 정량화하는 데 최적이다.</li>
</ol>3. 살아있는 세포 염색 매체의 준비
<ol><li>UV-C 노출 후 3시간 동안 의 마지막 15분 동안 염색매체를 신선히 준비한다.</li>
	<li>10% FBS-DMEM을 함유하는 염색매체의 10 mL를 37°C로 1% 펜-스트렙으로 보충하였다.</li>
	<li>10 mM DCFDA의 5 μL을 추가; 5 μL 의 10 mg/mL Hoechst 용액 및 200 1 mg/mL 프로피듐 요오드화의 200 μL. DCFDA, Hoechst 및 PI의 최종 농도는 염색 매체의 10 mL에서 각각 5 μM, 5 μg/mL 및 20 μg/mL입니다.</li>
</ol>4. UV-C 노출 마우스 1 차 안구 세포의 DCFDA 염색
<ol><li>UV-C의 3시간 배양 후 다양한 용량으로 마우스 1차 안구 세포를 노출하고, 35 mm 접시로부터 매미를 흡인한다.</li>
	<li>신선하게 준비된 DCFDA 염색 매체 2 mL로 각 요리에 부드럽게 보충하십시오.</li>
	<li>살아있는 세포 염색을 위해 37°CCO2 인큐베이터에서 어둠 속에서 15분 동안 염색 매체로 세포를 배양하였다.</li>
</ol>5. DCFDA (ROS), 호히스트 및 PI 염색 된 세포의 보기
<ol><li>배양이 완료된 후 염색 매체를 폐기하십시오.</li>
	<li>세포에 신선한 완전한 매체를 추가하고 반전된 형광 현미경/세포 이미저(재료표)에서세포를 관찰합니다. 원하는 필드를 사진 : 밝은 필드, 푸른 형광, 붉은 형광, 녹색 형광. 참고: 청색 형광 염색 세포는 핵이고, 녹색 형광은 ROS 생성 세포를 위한 것이고 적색 형광은 PI 양성 죽은 세포를 나타낸다.</li>
</ol>6. 이미징 기술을 사용하여 스테인드 셀 (Hoechst-Blue, PI-Dead 및 Green-ROS)의 정량화
<ol><li>반전형광현미경/셀 이미저로 캡처한 이미지를 ImageJ로 내보내 정량화를 위해.</li>
	<li>각 이미지를 한 번에 하나씩 열고 계산을 위해 각 채널(즉, 파란색(핵/Hoechst), 녹색(ROS), 빨간색(죽은/PI 양성))을 순차적으로 사용합니다. 노출되지 않은 컨트롤에서 시작하여 순차적으로 1, 100, 1,000 및 10,000J/m-2로이동합니다.</li>
	<li>각 필드에 대한 소프트웨어 메뉴에서 십자가로 표시된 셀 카운팅 도구를 사용하여 세포를 카운트[청색 양성(Hoechst positive; 핵), 적색 양성(PI 양성; 죽은 세포); 각각의 이미지에 대응하는 녹색 양성(ROS)] 치료.</li>
	<li>각 필드의 각 특정 신호를 클릭하여 계산합니다. 예를 들어, 청색/Hoechst 스테인드 핵을 클릭하면 주어진 필드에 있는 핵의 총 수를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>UV 손상에 의한 세포 사멸율(PI 양성 세포 수 x 100을 Hoechst 양성 세포의 수로 나눈 값)과 UV 손상에 의한 ROS 생산 비율(DCFDA 양성 세포 수 x 100의 백분율로 나눈 호에스트 양성 세포의 수)으로 결과를 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+surface%3A+the+challenge+to+enable+and+protect+vision%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li>
<li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmoogy%22%5BJournal%5D)">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li>
<li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), Suppl 1 3-8 (2000).</li>
<li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+%28ROS%29+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li>
<li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734(2016).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited%3A+eye-sun+protection+factor+%28E-SPF%28R%29%29%2C+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li>
<li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers%3A+A+major+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li>
<li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li>
<li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells%3A+A+possible+role+in+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li>
</ol>

저자는 기사를 후원하기위한 바이오 라드 연구소 인도 개인 제한에서 자금 지원을받았다.

여기에 기술된 DCFDA 염색 방법은 UV-C 방사선으로 처리된 마우스 1차 안구 라이브 세포에서 ROS의 시각화를 가능하게 한다. 이 염색 방법의 장점은 연구원이 살아있는 세포에 대한 UV-C (3 시간 UVC 노출 후)의 즉각적인 효과와 ROS 양성의 비율에 대한 동시 열거, 죽은 세포의 동시 열거를 연구 할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 염색 방법이 살아있는 세포에 사용됨에 따라, 세포는 UV-C 방사선의 지연된 효과의 연구를 위해 더 긴 시간(수일) 동안 동일한 매체에서 더 배양될 수 있다. 따라서, 이 염색 방법은 ROS 생성 (녹색)을 구상하고 동시에 반전된 형광 현미경의 밑에 살아있는 세포에 있는 살아있는, apoptotic 및 죽은 세포 인구를 구별하는 가능하게 합니다. 그러나 특정 상황에서는 ROS 양성 및 PI 양성 세포를 얻을 것이라는 기대에도 불구하고 시각화가 실패할 수 있습니다. 이러한 경우 문제 해결이 권장됩니다(표2).
이...

안구 표면(OS)은 주로 각막, 래크리말 선, 마이보미안 선, 결막, 눈뚜껑 의 일부 및 신호를 변환하는 안구 의 일부의 외층 및 선 상피로 구성된 기능적 단위이다1. 투명 한 돔 모양의 각막 층망막에 빛을 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 혈관 조직은 상피 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 콜라겐 및 글리코사미노글리칸과 같은 세포 성분으로 구성된다2. 이 지역은 또한 대부분의 영양소를 공급하는 눈물로 배수됩니다. OS의 해부학 적 위치는 종종 밝은 빛, 미생물, 먼지 입자 및 화학 물질과 같은 다양한 가혹한 구성 요소에 노출, 외부 환경과 직접 접촉하도록 강요한다. 이 요인은 물리적 인 부상에 OS를 걸리기 쉽게하고 다양한 질병에 경향이있습니다.
산화 스트레스는 반응성 산소 종(ROS)의 생산과 내인성 항산화 방어 메커니즘 사이의 불균형으로 인해 발생한다3. ROS는 반응성 분자 및 자유 라디칼로 분류되며, 둘 다 미토콘드리아 산화 인산화를 통해 분자 산소(O2)에서유래된다4. 상기 전군은 과산화수소(H2O2), 일중항산소(1O2)와같은 비라디칼 종으로 구성되며, 후자는 수퍼옥사이드 음이온(O2-) 및 하이드록실 라디칼(• OH)과 같은 종을 포함한다. 이들 분자는 정상적인 세포 과정의 부산물이며, 이들의 역할은 신호 전이, 유전자 발현 및 숙주 방어5와같은 중요한 생리기능에 연루되어 왔다. ROS의 향상된 생산은 병원균 침습, 제노바이오틱스, 및 자외선(UV) 방사선에 의한 노출과 같은 인자에 반응하여 생성되는 것으로 알려져있다 4. ROS의 이 과잉 생산은 핵산, 단백질 및 지질과 같은 분자의 손상으로 이끌어 내는 산화 응력 에서 유래6.
UV 방사선의 가장 지배적 인 소스 인 자연 태양광은 UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), UV-C (290-200 nm)7로구성됩니다. 파장과 스펙트럼 에너지 사이의 역 상관 관계가 보고되었습니다. 천연 UV-C 방사선은 대기에 흡수되지만 수은 램프 및 용접 기구와 같은 인공 공급원이 방출되므로 직업적 위험이 있습니다. 눈에 노출의 증상은 광각막염과 광각막결막염 을 포함8. ROS의 생산은 UV 유도 된 세포 손상을 유발하는 주요 메커니즘 중 하나입니다9. 현재 연구에서는 UV-C에 노출된 마우스 1차 안구 표면 세포/줄기 세포에서 2',7'-디클로로디로디하이드로플루오레스세인 디아세이테인 디아세이테(DCFDA) 염색 방법을 사용하여 ROS검출을 입증합니다. 녹색 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 포착되었습니다. 세포는 2개의 염료, Hoechst 33342 및 적색 프로피듐 요오드화물로 카운터-염색하였고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 염색하였다.

<table><tbody><tr><td>2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA)</td><td>시그마</td><td>D6883</td><td>2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트는 형광 프로브이며 세포에 투과성이 있습니다. 반응성 산소 종의 정량화에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Cell culture dish (35 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>SA 003700112</td><td>세포 배양을 위한 멸균 디쉬.</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>HiMedia</td><td>AT007</td><td>가장 널리 사용되는 세포 배양 배지에는 4500mg/L의 포도당이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, EU Origin</td><td>HiMedia</td><td>RM99955</td><td>세포 배양 배지의 가장 중요한 구성 요소 중 하나입니다. 성장 인자, 아미노산, 단백질, A, D, E, K와 같은 지용성 비타민, 탄수화물, 지질, 호르몬, 미네랄 및 미량 원소를 제공합니다.</td></tr><tr><td>GlutMax</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>L-글루타민의 보충제 및 대체품으로 사용됩니다. 세포 생존력과 성장을 개선하는 데 도움이 됩니다.</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td></td><td>혼성화 오븐/UV 크로스 링커</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td>Hoechst 염색은 살아있는 세포와 죽은 세포 모두에 투과성이 있습니다. 그것은 세포가 죽었는지 살아 있는지에 관계없이 이중 starnded DNA에 결합합니다.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td></td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 (100X)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td>세포 <td>성장과 생존력을 증가시키기 위한 보충제로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>페니실린과 스트렙토마이신은 배양물 내 박테리아 오염을 방지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>시그마</td><td>P4170</td><td>죽은 세포에만 투과할 수 있는 형광 염료. 그것은 DNA와 결합하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다.</td></tr><tr><td>TryplE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>연성 세포 해리제</td></tr><tr><td>ZOE 형광 세포 이미저</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자외선-c (uv-c) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

안구 표면은 다양한 환경 적 요인으로 인해 정기적으로 마모됩니다. UV-C 방사선에 노출은 직업 건강 위험을 구성합니다. 여기에서, 우리는 UV-C 방사선에 마우스 안구 표면에서 1 차적인 줄기 세포의 노출을 보여줍니다. 반응성 산소 종 (ROS) 형성은 산화 스트레스 / 손상의 정도의 판독이다. 시험관 내 실험 환경에서는 산화 스트레스로 인해 생성된 죽은 세포의 백분율을 평가하는 것도 필수적입니다. 이 기사에서는 UV-C 노출 된 마우스의 2',7'-Dichlorofluescececetate (DCFDA) 염색을 시연할 것이며 DCFDA 염색의 형광 이미지에 기초한 1 차적인 안구 표면 줄기 세포 및 정량화를 시연할 것입니다. DCFDA 염색은 ROS 생성에 직접적으로 해당합니다. 우리는 또한 각각 프로피듐 요오드화물 (PI) 및 Hoechst 3332와 DCFDA (ROS 양성) 및 PI 양성 세포의 백분율로 동시에 염색함으로써 죽은 세포와 살아있는 세포의 정량화를 입증합니다.

DCFDA는 세포에서 ROS를 검출하기 위한 지표로 사용되는 형광의 화학적으로 감소된 형태인 무색 염료이다. 이 염료는 세포 내부에 갇히게되고 녹색 형광을 방출하는 형광 디클로로디하이드로 플루오레스신 (DCF)으로 쉽게 산화됩니다. 이 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 검출될 수 있습니다. 세포는 다음과 같이 ROS 축적과 가시화 및 상관될 수 있다: (i) ROS가 없는 살아있는 세포는 높은 청색 형광을 방출한다; (ii) ROS 축적을 가진 살아있는 세포는 낮은 녹색 형광을 가진 높은 청색 형광을 방출합니다; (iii) ROS 축적이 있는 죽은 세포는 높은 적색 및 높은 녹색 형광을 가진 낮은 청색 형광을 방출합니다.
UV-C의 1J/m2에 노출된 대조군 세포 및 세포는 DCFDA/ROS 및 PI 양성 세포를 나타내지 않았다. UV-C 미노출 대조군은 Hoechst 염색에 의해 지시된 것만핵 염색을나타냈다(그림 1)...

이 프로토콜은 마우스 안구 표면 세포로부터살아있는 1차 배양에서 반응성 산소 종(ROS), 살아있는 세포 및 죽은 세포의 동시 검출을 입증한다. 2',-7'-디클로로플루오레세테이트, 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염색은 ROS, 죽은 세포 및 살아있는 세포를 각각 평가하기 위해 사용되며, 이미징 및 분석이 뒤따릅니다.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

안녕하세요, 내 이름은 박사 비파샤 보스입니다. 저는 부교수로 일하고 있으며 줄기 세포 및 재생 의학 센터, 예네포야 연구 센터, 예네포야 대학, 인도 만갈로어에서 담당하고 있습니다. 이제 우리는 자외선-C 방사선의 각종 복용량에 드러진 마우스 안구 표면에서 살아있는 배양에서"즉 반응성 산소 종인 ROS의 존재를 검출하는 방법을 시연할 것입니다.이 기술의 장점은 여기서 우리는 동시에 베스터 세포를 가질 필요없이 반응성 산소 종, 살아있는 죽은 세포의 존재를 감지 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 원리는 본질적으로 염료 DCFDA의 살아있는 세포 투과성에 있습니다. DCFDA는 살아있는 세포 무색 염료로, 산화 스트레스 가 세포 내 산화에 의해 행동되고 녹색 형광 DCF로 변환됩니다.따라서, 녹색 꽃은 우리가 살아있는 세포에 반응성 산소 종의 존재를 검출할 수 있게 합니다. 한편, 프로피듐 요오드제는 홍조를 적색으로 하는 만사세포 침전염염이다. 그것은 rDNA 이중 좌초 연염염입니다.그러나, 염료 Hoechst는 살아있는 세포와 죽은 세포 둘 다에 periss입니다. 푸른 색 핵 얼룩입니다. 따라서, 이것은 우리가 죽은 세포의 평가와 함께 시간 종속 방식으로 장기 배양에 반응성 산소 종의 존재를 검출 할 수있는 매우 간단한 방법입니다.플레이트 포인트 35 밀리미터 배양 접시 당 2 백만 셀. 우리가 적용하는 세포는 마우스 안구 표면에서 세포입니다. 각 세포 배양 접시에서 최대 양의 미디어를 제거합니다.세포 배양 매체의 약 500 마이크로리터를 세포와 밀접한 접촉으로 남겨 둡니다. 최소한의 양의 매체는 세포의 건조를 방지할 수 있습니다. 그러나 최소한의 양의 미디어의 목적은 UVC 노출의 최대 침투를 허용하는 것입니다.UV 소스에서 세포를 가지고, 그것은 UV 크로스 링커 일 수있다, 또는 다른 자외선-C 소스 가 될 수 있습니다. 1, 10, 100, 1, 000 및 10, 000 줄과 같은 UVC 방사선의 상이한 복용량에 세포를 노출하는 것은 미터 평방 당 10, 000 줄. 세포가 자외선-C 방사선에 노출되면 뚜껑은 열린 위치에 있어야합니다.이것은 세포에 자외선-C의 최대 침투를 허용하고 그러므로 자외선-C 방사선에 세포의 최적 복용량 반응을 보여줄 것입니다. 세포를 라미나르 공기 흐름 후드에 가져와 서 전체 미디어의 2 밀리리터와 각 접시를 보충. 이 완전한 매체는 DMEM에 있는 20% 태아 소 혈청을 포함합니다, 1%최소 비 필수 아미노산과 같은 보충교재로 보충되고, 또한 페니실린과 연쇄상 구균인 1%항생제.그 후, 최대 부피로 보충 한 후, 즉 완전한 매체의 두 밀리리터, 자외선-C 방사선의 초기 효과를 보기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 반환하고 인큐베이터. UVC 세포 인큐베이션 후 3시간 후 의 마지막 15분 동안 라이브 셀 염색 매체를 준비한다. 스테인닝 미디어는 37도까지 미리 따뜻하게 DMEM을 포함하는 10 % FBS로 준비됩니다.염색 매체의 10 밀리리터를 만들기 위해, 먼저 5 마이크로 몰러의 최종 농도를 얻기 위해 10 밀리머의 주식에서 DCFDA의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 둘째, mL당 10밀리그램의 스톡에서 Hoechst 용액 5마이크로리터를 추가하여 mL당 5마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.이제 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 마지막으로 mL 당 1 밀리그램의 주식에서 프로피듐 요오드의 200 마이크로 리터를 추가하여 mL 당 20 마이크로 그램의 최종 농도를 얻습니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요.이제 염색 솔루션을 사용할 준비가 되었습니다. UVC 노출 후 3시간 동안 잠복후 CO2 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 1, 10, 100, 1, 000 및 10, 000 평방 미터 당 10, 000 줄과 같은 UVC의 다양한 복용량에 노출 된 각 요리에서 미디어를 흡인.이제 갓 준비된 라이브 셀 스테닝 미디어를 접시 의 측면에서 부드럽게 두 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 다시 반환하고 라이브 셀 염색을 위해 15 분 동안 배양하십시오. 살아있는 세포 염색 매체에서 15분 동안 배양한 후, 자외선-C 방사선의 상이한 복용량에 노출된 세포를 포함하는 각 접시에서 염색 매체를 제거한다.완전한 매체의 2 밀리리터로 세포를 보충하십시오. 이제 셀이 볼 준비가 되었습니다. 이제 형광 이미저의 밝은 필드 아래에 제어 세포를 배치합니다.세포는 통제 세포이기 때문에 명백하게 정상보입니다. 파란 들판 아래에서 우리는 형광 총 세포를 할 수 있습니다. 녹색 필드 아래에는 ROS 생성이 표시됩니다.이들은 제어 세포이기 때문에, 생성된 ROS가 없습니다. 적색 필드 아래에서, 프로피듐 요오드 염색 죽은 세포가 볼 수 있습니다. 그런 다음 밝은 필드 아래에 미터 평방 미터 당 100 줄에 노출 된 UV를 유지합니다.파란색 필드 아래에서, 또한 우리는 파란색 필드 아래총 셀 번호를 볼 수 있습니다. 그러나, 우리가 녹지에 노출될 때, DCFDA 양성 세포가 보입니다, 또한 PI 양성 사구는 보입니다. 마지막으로, 최대 UV 용량을 배치, 즉 10, 000 미터 평방 노출 세포 당 줄, 밝은 필드 아래에.우리는 비정상적인 세포 형태를 볼 수 있습니다. 그러나, 푸른 필드 에서 우리는 총 파란색 세포를 볼 수 있습니다. 녹색 필드 에서, 녹색 형광 DCFDA 양성 세포는 ROS 생성을 나타내는 볼 수 있습니다.세포가 적색장에 노출될 때, 모든 세포는 세포가 UV 투여량의 미터 당 10, 000 줄로 취급될 때 많은 수의 세포사를 나타내는 적색을 형광하였다. 이제 다양한 채널에서 캡처한 이미지를 자외선-C 용량 및 노출되지 않은 컨트롤에 대응하는 단일 복합 이미지 패널로 정렬합니다. 이미지는 그룹의 단일 패널로 정렬됩니다.첫째, 밝은 필드. 둘째, 호흐스트 블루 핵 얼룩. 셋째, 죽은 핵에 관해서는 요오드 염색을 프로디듐 요오드데.넷째, ROS 양성 세포를 위한 DCFDA. 그리고 다섯 째, 병합된 이미지입니다. 우리가 이미지의 첫 번째와 두 번째 행을 볼 때, 즉 노출되지 않은 제어 및 미터 평방 당 하나의 줄에 노출 되지 않은 세포, 우리는 PI 도 ROS 양성 세포가 조명 했다 관찰, 따라서 노출 되지 않은 컨트롤에 ROS와 세포 죽음의 완전 한 부재와 하나의 joule 평방 미터 당 의 이러한 낮은 UVC 복용량을 나타내는 것을 관찰.이제 미터 평방 미터 당 100 줄에 노출 된 세포의 합성 이미지의 세 번째 행에 오고. 세포의 매우 낮은 비율, 약 10%는 이 복용량에서 PI와 DCFDA 둘 다에 대해 긍정적이었다, 따라서 ROS 생성 및 세포 죽음의 낮은 양을 나타내는. 이제 우리는 복합 이미지의 네 번째 행에 표시된 바와 같이 미터 평방 미터 당 1, 000 줄인 UVC 방사선 노출의 더 높은 용량으로 이동합니다.여기서, 세포의 대략 70%는 PI와 DCFDA를 위해 양수이었습니다. 마지막으로, 우리는 복합 이미지의 다섯 번째 행에 표시된 바와 같이 미터 평방 미터 당 10, 000 줄입니다 UVC 노출의 가장 높은 복용량으로 이동합니다. 여기에 세포의 거의 100 %가 PI와 DCFDA 모두에 대해 양성이었다는 것을 발견, 따라서 이 특정 UVC 용량에서 100 %의 세포 죽음과 ROS 생성을 나타내는.이미지를 이미징 소프트웨어로 전송합니다. 먼저 Hoescht 염색 핵을 나타내는 파란색 이미지를 엽니 다, 즉 세포의 총 수입니다. 카운트 도구를 열고 숫자를 갖기 위해 각 셀을 한 번에 하나씩 클릭합니다.이제 PI 양성 죽은 세포를 나타내는 빨간색 채널 아래에 캡처 된 이미지를 엽니 다. 카운팅 도구를 열고 PI 양수 죽은 세포의 수를 나타내는 각 빨간색 반점을 클릭합니다. 죽은 세포의 계산이 끝나면, 녹색 채널 캡처 된 세포를 클릭하고 계수 도구를 열고 ROS 생성을 나타내는 세포를 나타내는 녹색 반점의 각을 클릭합니다.녹색 채널에서 캡처된 녹색 셀의 계수를 완료한 다음, 포뮬러를 사용하여 UVC 손상 및 UVC 손상에 의한 ROS 생산의 백분율에 의한 세포 사멸의 비율을 확대합니다. 이는 PI 양성 세포의 간단한 수식 수를 사용하여 계산되며, 즉 적색 형광 세포이며, Hoechst 양성 세포의 수로 나누어 100을 곱한다. UV 손상에 의한 ROS 생산의 백분율은 100을 곱한 Hoechst 양성 세포의 수로 나눈 수식, DCFDA 양성 또는 녹색 형광 세포의 수를 사용하여 계산됩니다.셀 사망 비율과 ROS 생산 비율의 백분율인 백분율이 모두 있으면 이러한 값을 사용하여 막대 그래프를 플롯합니다. X축은 UV의 투여량을 나타내는 반면 y축은 세포의 백분율을 나타냅니다. 녹색 막대는 ROS 생성 의 백분율을 나타내고 빨간색 막대는 세포 사망 비율을 나타냅니다.분석 시, UVC 용량 100 줄에는 10%의 ROS 생성 세포와 10%의 세포 사망이 있음이 분명합니다. UVC 투여량 10에서 미터 정사각형 당 3개의 줄로 상승하는 반면, 70%의 세포는 세포 사멸뿐만 아니라 ROS 생성을 나타냈다. UVC의 가장 높은 복용량에 있는 동안, 그 10 미터 평방 미터 당 4 줄로 제기, 약 100% 세포는 세포 죽음 뿐만 아니라 ROS 생산을 전시.따라서, ROS 생성과 세포 사멸 사이에 강한 긍정적 인 상관 관계가 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 살아있는, 일반적인 사건 문화에서 반응성 산소 종, 살아있는 및 죽은 세포의 동시 평가를 위해 아주 편리합니다. 이 기술은 또한 반응성 산소 종, 살아있는 및 죽은 세포, 자외선, 또는 화학 에이전트와 같은 각종 세포 손상 제에 노출된 장기 배양에서 제한된 평가에 유용합니다.그리고 이 기술은 또한 PCR 및 서양 블로팅에 QR과 같은 많은 다운스트림 응용 에 대한 수 로 등등 50 %ROS, 75 %ROS, 등등에서 세포를 수확하기위한 최적의 시간을 결정하기위한 연구원을 안내 할 수 있습니다.

assessment-oxidative-damage-primary-mouse-ocular-surface-cellsstem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

산화 세포 환경을 감지하는 심사 방법은 CM - H2DCFDA의 산화를 측정하는 것입니다. 일단 비 형광의 형광 화합물로 세포, CM - H2DCFDA 변경 내에 산화. 형광에이 변경 사항은 유동세포계측법으로 측정하고 산화 환경에서 세포의 수를 나타냅니다.

고양이 Astrocyte 세포주에서 산화 스트레스에 대한 심사 분석, G355 - 5

백내장은 세계에서 실명의 주요 원인이다. 태양 자외선 방사 (UVR)는 백내장 개발을위한 주요 위험 요소입니다. 지금까지 UVR-B 유발 백내장의 동물 모델은 개발되었습니다. UVR, 정량 RT-PCR 및 immunohistochemistry에 노출 :이 글에서 우리는 백내장 형성에 대한 조사를하는 방법을 설명합니다.

의 분자 메커니즘의 특성<em&gt; 생체에</em&gt; UVR 유도 백내장

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

이 프로토콜의 목적은 마우스 피부에서 치명적이지 않은 수준의 활성 산소 종(ROS)의 일시적인 생체 내 생산을 유도하여 조직의 생리적 반응을 더욱 촉진하는 것입니다.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

이 기사에서는 1차 및 불멸화 세포주에서 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 평가하는 데 사용되는 절차를 설명합니다.

일차 및 불멸화 된 인간 각막 상피 세포에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 독성 결정

이 프로토콜은 마우스 모델에서 정확하고 재현 가능한 각막 및 윤부 알칼리 손상을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 고도로 구부러진 쥐의 각막과 변두리에 고르게 분포된 손상을 허용하기 때문에 유리합니다.

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

이 프로토콜은 생쥐에서 자외선 B 노출의 전신 및 국소 피부 영향에 대한 연구를 설명합니다.

자외선 B 방사선에 대한 마우스의 만성 노출 연구 

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

배우세요 마우스 안구 표면 세포에서 UV-C 손상에 따른 ROS 및 세포 생존율을 동시에 검출하는 방법을. DCFDA, 프로피듐 요오드화물, Hoechst 염색을 활용하여 산화 스트레스와 세포 사멸을 정량적으로 평가합니다.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

더 많은 동영상 탐색