3차원 모터 신경 오르간성 생성

이 프로토콜은 신체 외부의 인간 iPS 세포에서 유래한 운동 신경 오가노이드를 사용하여 축삭 다발의 발달 및 질병의 기저에 있는 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 합니다. 단순히 뉴런 스페로이드와 맞춤형 미세배양 칩을 배양함으로써 단방향 축삭 다발을 자발적으로 생성하고 다양한 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다. 운동 신경 오가노이드는 이전의 체외 시스템보다 더 많은 생리학적 모델을 제공함으로써 LS를 포함한 운동 신경 질환에 대한 약물의 스크리닝 및 테스트를 용이하게 할 수 있습니다.

흄 후드에서 적절한 PPE를 착용하고 SU-8 2100 3ml를 아세톤 세정된 실리콘 웨이퍼에 분배하고 웨이퍼를 스핀 코터 중앙에 놓습니다. 웨이퍼를 진공으로 고정하고 웨이퍼 표면을 가로 질러 SU-8을 균일하게 코팅하기 위해 10 초 동안 분당 500 회전으로 웨이퍼를 회전 한 다음 초당 300 회전의 가속도로 분당 1, 500 회전으로 웨이퍼를 회전시켜 웨이퍼에 150 미크론 두께의 포토 레지스트 층을 얻습니다. 소프트 베이킹 후 포토마스크를 마스크 얼라이너에 놓고 웨이퍼를 자외선에 60초 동안 노출시킵니다.

핫 플레이트에서 베이킹한 후 궤도 셰이커에서 교반하면서 포토레지스트 현상액에서 10-20분 동안 웨이퍼를 현상하고 공정 중에 현상 용액을 한 번 변경합니다. 조직 배양을 위해 칩의 하단 층을 준비하려면 새로 준비된 PDMS를 원하는 두께로 웨이퍼에 붓고 진공 챔버에서 혼합물의 가스를 제거합니다. PDMS를 섭씨 60도에서 최소 3시간 동안 오븐에서 경화시킵니다.

냉각 후 블레이드를 사용하여 웨이퍼에서 경화된 PDMS를 절단한 다음 베이킹과 함께 경화되지 않은 PDMS를 사용하여 PDMS 하단 층에 매체 저장소를 접착하여 조립된 PDMS 조직 배양 칩을 얻습니다. 운동 신경 오가노이드 형성을 위해 PDMS 칩을 준비하려면 70% 에탄올이 함유된 페트리 접시에 칩과 76 x 52mm 현미경 유리를 최소 1시간 동안 멸균합니다. 배양이 끝나면 젖은 현미경 유리에 칩을 놓습니다.

밤새 건조시킨 후 칩이 유리에 부착되어야 합니다. DMEM/F12에 희석된 기저막 매트릭스의 30마이크로리터 방울을 채널 입구의 한쪽 면에 놓고 입구의 다른 쪽에서 용액을 흡입하여 마이크로 채널 표면을 매트릭스로 코팅합니다. 그런 다음 PDMS 칩을 코팅 용액과 함께 페트리 접시에 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

3D iPS 세포가 운동 뉴런으로 분화되도록 유도하기 위해 100마이크로리터의 공급기 및 무혈청 Y-27632가 보충된 96웰 U-바닥 플레이트의 적절한 수의 웰에 웰당 10배에서 4번째 iPS 세포를 파딩합니다. 다음날, 각 웰의 상층액을 10마이크로몰 SB431542과 100나노몰 LDN-193189가 보충된 100마이크로리터의 KSR 배지로 교체합니다. 2일차와 3일차에는 상등액을 10마이크로몰 SB431542, 100나노몰 LDN-193189, 5마이크로몰 DAPT, 5마이크로몰 SU5402, 마이크로몰 레티노산 1개, 마이크로몰 평활 작용제 1개가 보충된 KSR 배지 100마이크로

4일과 5일째에 상층액을 10마이크로몰 SB431542, 100나노몰 LDN193189, 5마이크로몰 DAPT 5개, 마이크로몰 SU5402 5개, 마이크로몰 레티노산 1개, 마이크로몰 평활 작용제 1개가 보충된 KSR 배지 75%와 N2 배지 25%의 혼합물로 교체합니다. 6일과 7일째에 상층액을 50%의 KSR 배지와 50%의 N2 배지의 혼합물로 교체하고 5개의 마이크로몰 DAPT, 5개의 마이크로몰 SU5402, 1개의 마이크로몰 레티노산 및 1개의 마이크로몰 평활 작용제로 보충합니다. 8일과 9일째에 상층액을 KSR 배지 25%와 N2 배지 75%의 혼합물로 교체하고 5개의 마이크로몰 DAPT, 5개의 마이크로몰 SU5402, 1개의 마이크로몰 레티노산 및 1개의 마이크로몰 평활 작용제를 보충합니다.

10일과 11일에 상층액을 5마이크로몰 DAPT 5개, 마이크로몰 SU5402 5개, 마이크로몰 레티노산 1개, 마이크로몰 평활 작용제 1개가 보충된 N2 배지로 교체합니다. 12일째에 각 웰의 상등액을 웰당 밀리리터당 20나노그램의 뇌 유래 신경 영양 인자로 보충된 100마이크로리터의 성숙 배지로 교체합니다. 운동 신경 오가노이드 형성을 유도하기 위해 PDMS 칩의 코팅 용액을 1밀리리터당 20나노그램의 뇌 유래 신경 영양 인자로 보충된 150마이크로리터의 성숙 배지로 교체하고 광경 마이크로피펫 팁을 사용하여 96웰 플레이트의 한 웰에서 칩의 마이크로채널 입구로 운동 뉴런 스페로이드를 부드럽게 추가합니다.

매체 증발을 방지하기 위해 접시의 조직 배양 칩 근처에 멸균수가 담긴 작은 저장소를 놓고 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 2-3일에 한 번씩 배지 저장소 중앙에서 소진된 배양 배지의 절반을 뇌 유래 신경 영양 인자 밀리리터당 20나노그램이 보충된 새로운 성숙 배지로 교체하십시오. 축삭돌기는 운동 뉴런 타원체에서 채널로 성장하여 2-3주에 걸쳐 자발적으로 단일 다발로 조립되어 운동 신경 오가노이드를 형성합니다.

운동 뉴런은 3D 분화 절차에서 12-14일 이내에 분화합니다. 중요한 것은 분화 과정에서 세포의 60% 이상이 운동 뉴런 마커 HB9를 발현하고 운동 뉴런 스페로이드에 있는 세포의 약 80%가 SMI32 양성이라는 것입니다. 물리적 가이드 역할을 하는 마이크로채널을 통해 축삭은 운동 뉴런 스페로이드에서 뻗어 나와 스페로이드에 도입된 후 24시간 이내에 축삭-축삭 상호 작용에 의해 다발을 형성합니다.

축삭돌기는 다음 3-4일 이내에 미세채널의 중심에 도달했고, 추가로 10일 후에 미세채널의 다른 쪽 끝으로 확장되었습니다. 현미경 유리에서 PDMS를 분리하여 생물학적 분석을 위해 칩에서 운동 신경 오가노이드를 수집할 수 있습니다. 그런 다음 축삭돌기와 세포체를 절개하고 수술용 칼이나 핀셋을 사용하여 현미경으로 분리할 수 있습니다.

운동 신경 오가노이드의 축삭돌기 다발에서 수지상 마커 단백질은 웨스턴 블로팅에 의해 검출되지 않습니다. 스페로이드가 배양 칩 내의 바닥으로 완전히 떨어졌는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 부위를 조사하고 바닥이 칩에서 스페로이드의 위치를 결정하는 데 도움이 될 수 있음을 보여주었습니다.

분리된 축삭돌기는 다양한 추가 방법을 검사할 수 있습니다. 많은 양의 축삭돌기를 얻어 상당한 물질이 필요한 생화학적 분석에 사용할 수 있습니다.