전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

반복적이고 무질서한 전사 인자에 대한 구조 기능 분석을 수행하는 것은 어렵습니다. 전사체학을 올바른 세포 컨텍스트와 결합함으로써 이 접근 방식은 중요한 구조 기능 관계를 더 잘 밝혀냅니다. RNA 염기서열분석을 기능적 출력으로 사용하면 한 번의 실험에서 단일 단백질에 의해 조절되는 모든 유전자를 효과적으로 평가할 수 있으므로 부분 기능 검출 가능성이 높아집니다.

부분 기능 검출은 발암성 융합 전사 인자에 특히 중요한데, 이러한 단백질이 어떻게 기능하는지 모르고 염기서열 분석이 융합 유발 암에서 더 나은 치료법으로 이어질 수 있기 때문입니다. EWS/FLI에서 무질서한 EWS 영역에 초점을 맞추겠지만, EWS는 제대로 정의되지 않은 기능을 가진 무질서 도메인을 포함하는 다른 융합에 관여합니다. cDNA 발현 구축물 형질도입을 위해 먼저 섭씨 37도의 수조에서 cDNA 구축물로 냉동 바이러스를 빠르게 해동하고 각 바이틀에 밀리리터당 8밀리그램의 폴리브레렌 2.5마이크로리터를 부드럽게 혼합합니다.

다음으로, 바이알 구조체당 50-70% confluent 10cm 세포 배양 플레이트 하나에서 배지를 제거하고 플레이트 측면 아래로 전체 2ml 부피의 구조체를 부드럽게 우회합니다. 플레이트를 흔들어 세포 전체에 바이러스를 고르게 퍼뜨리고 플레이트를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 2시간 동안 놓고 플레이트의 모든 영역이 건조되지 않도록 30분마다 플레이트를 흔듭니다. 배양이 끝나면 소 태아 혈청, 항생제, 피루브산 나트륨 및 폴리브레렌이 보충된 배지 5ml를 추가합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양 후 상층액을 선택 배지로 교체하고 세포를 추가로 7-10일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣어 선택 및 cDNA 구성 발현을 허용합니다. 선택 기간이 끝나면 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 모아 계수하고 5-10 곱하기 10을 RNA 염기서열 분석을 위한 새 튜브에 5-10 곱하기 5번째 세포에 할당하고 단백질 추출을 위해 6개 세포에 2배 10을 다른 새 튜브에 할당합니다. 원심분리로 세포를 침전하고 펠릿을 1ml의 차가운 PBS 또는 5분 원심분리에 재현탁합니다.

그런 다음 펠릿과 액체 질소를 모두 급속 동결하고 전지를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 관심 단백질의 knockdown과 구성물 패널의 발현을 검증하려면 표준 Western blot 분석 프로토콜에 따라 단백질 용해물 샘플을 적절한 1차 및 2차 항체로 블롯화합니다. RNA의 질과 양을 평가하려면 실리카 스핀 컬럼 기반 추출 키트의 용해 버퍼를 사용하여 RNA 염기서열분석 세포 샘플을 용해하고 용해물을 30-60초 동안 분당 13, 000회 이상의 회전으로 게놈 DNA 제거 컬럼에 적용합니다.

다음으로, 실리카 스핀 컬럼 정제를 진행하고 키트 지침에 따라 컬럼의 RNA를 세척합니다. 그런 다음 RNA를 30마이크로리터의 용리 완충액에 용리시키고 분광광도계에서 260-280나노미터 비율로 최소 2.5마이크로그램의 RNA를 분석하여 RNA의 양과 샘플 품질을 평가합니다. fastq 파일 분석의 경우 Putty를 사용하여 터미널을 고성능 컴퓨팅 환경으로 열고 project라는 분석 디렉토리를 만듭니다.

프로젝트 디렉터리의 경로로 이동하여 fastq라는 압축된 원시 fastq. gz 파일에 대한 디렉터리와 trimmed라는 두 번째 디렉터리를 만듭니다. 압축된 원시 fastq를 전송하기 위한 적절한 보안 파일 전송 프로그램입니다.

gz 파일을 로컬 저장소에서 프로젝트 fastq 디렉토리의 경로로 이동하고 각 샘플에 대해 R1 및 R2 파일이 있는지 확인합니다. 프로젝트 fastq의 경로로 이동하고 표시된 대로 trim galore의 명령을 사용하여 fastq에서 낮은 품질의 읽기를 트리밍합니다. GZ 파일.

프로젝트 디렉토리의 경로로 이동하여 STAR output이라는 새 디렉토리를 만듭니다. 프로젝트 trim 디렉토리의 경로로 이동하고 표시된 대로 명령을 사용하여 STAR를 실행하여 trimed fastq를 정렬합니다. GZ 파일.

표시된 위치에서 전사체당 개수를 포함하는 다음 단계에 필요한 출력을 찾고 명령을 사용하여 유전자 출력 탭 파일당 각 판독을 읽습니다. 첫 번째 열의 경우 다운스트림 처리를 용이하게 하기 위해 ENSEMBL 유전자 ID 열의 마침표 앞의 문자만 사용합니다. 그런 다음 명령을 사용하여 모든 샘플의 개수를 totcts라는 데이터 프레임으로 컴파일하고 원시 개수 데이터의 새 테이블을 탭으로 구분된 텍스트 파일로 저장합니다.

DESeq2를 사용하여 각 구문에 대한 미분 표현식 프로파일을 정의하려면 실험적 DESeq2 설계를 입력하고 행렬 함수에서 DESeq 데이터셋을 사용하여 DESeq 데이터셋을 구성하고, 크기 요인을 추정하고, DESeq2를 실행합니다. 분석의 품질을 평가하려면 DESeq2를 사용하여 정규화된 로그 정규화 카운트를 추출합니다. DESeq2 결과에서 각 전사 프로파일에 대한 결과를 추출할 때 knockdown 조건 또는 baseline empty vector를 참조하여 쌍별 비교를 수행합니다.

HGNC 유전자 기호로 이러한 결과를 추가로 수정하고 DESeq2 데이터에서 데이터를 ENSEMBL 유전자 ID, HGNC 기호, baseMean 발현 및 로그 2중 변화와 원시 및 조정된 P 값이 있는 모든 구성에 대한 차등 발현 데이터가 있는 단일 파일로 추출합니다. 성공적인 배치 정규화 및 관심 표본 유사성을 평가하고, 코드를 사용하여 정규화된 로그 정규화 카운트를 사용하여 주성분 분석 및 표본 간 거리 플롯으로 표본 클러스터링을 확인합니다. 정규화된 로그 정규화 카운트를 사용하여 1,000개의 가장 가변적인 유전자를 매트릭스로 추출하고 히트 맵을 사용하여 이러한 유전자를 기반으로 샘플의 비지도 계층적 클러스터링을 수행합니다.

덴드로그램에서 관심 있는 군집을 추출하려면 덴드로그램 관심 군집의 어떤 수준이 나타나는지 결정하고 K를 해당 수준의 군집 수와 동일하게 설정합니다. 관심 있는 클러스터를 확인하려면 클러스터별로 정렬된 히트 맵을 다시 플로팅하고 테이블에서 각 클러스터와 관련된 유전자 목록을 내보낸 다음 적절한 생물정보학 도구를 사용하여 클래스 간에 식별되고 비교된 다양한 유전자 클러스터에 대한 생물학적 역할을 식별합니다. 이 대표 분석에서는 긍정적 및 부정적 구성을 사용한 효과적인 녹다운 및 구조를 관찰할 수 있습니다.

DAF가 구출한 세포는 콜로니를 형성하지 못했으며, 이는 발암성 변형이 손상되었음을 시사합니다. 리플리컨트 검증이 완료된 후, 배치 정규화 및 분석을 위해 모든 샘플에 대해 표현형 분석 및 초기 RNA 염기서열분석 데이터 처리 유전자 수를 얻을 수 있습니다. 배치 정규화가 없는 DESeq2는 배양 내 세포의 통과로 인한 생물학적 변동성과 각 배치 처리의 차이로 인해 발생하는 생물학적 변동성으로 인해 혼란스러운 배치 결함을 초래할 수 있습니다.

배치 정규화 후 DESeq2를 사용하여 기준선을 기준으로 관심 구성에 대한 전사 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이러한 데이터에 대한 주성분 분석은 DAF의 전사 프로필이 야생형 EWS/FLI와 Delta 22 사이의 중간에 있음을 시사하여 부분 기능을 확인합니다. 더욱이, 샘플에 걸쳐 1,000개의 가장 다양한 유전자의 계층적 클러스터링은 DAF가 EWS/FLI 표적 유전자를 억제하지 못하고 유전자 활성화 활성을 부분적으로만 유지한다는 것을 보여줍니다.

상위 유전자 분석은 DAF가 활성화하는 유전자의 종류가 DAF가 작동하지 않는 EWS/FLI 활성화 표적과 기능적으로 구별된다는 것을 시사합니다. 흥미롭게도, DAF는 GGAA-microsatellite 활성화 유전자를 가장 잘 구할 수 있지만, 친화도가 높은 부위 근처에서 활성화된 유전자를 구할 수는 없다. transcriptomic output을 관련 표현형 분석과 페어링하면 구조 기능 분석이 완료됩니다.

연구원들은 또한 다른 기술을 사용하여 다양한 전사 기능의 기계론적 동인을 연구할 수 있습니다.