Name: 전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 전사체학을 활용한 Ewing 육종의 EWS 도메인 구조-기능 관계 매핑 방법을 배우세요. RNA 시퀀싱과 DESeq2 분석으로 융합 전사 인자의 조절 메커니즘을 규명하고 표적 치료 개발에 활용하세요.

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이 연구는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 고성능 컴퓨팅 시설에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 건강 국립 암 연구소의 국립 연구소 [U54 CA231641 SLL, R01 CA183776에]에 의해 지원되었다; 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 [ERT에 젊은 조사관 상]; 펠로토니아 [ERT에 대한 펠로우십]; 및 국민건강의학연구위원회 CJ마틴 해외생물의학펠로우십[APP1111032 to KIP].

<ol><li>Miettinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+sarcomas%3A+histopathology+and+clinical+significance+of+selected+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities.</a> Human Pathology. 86, 57-65 (2019).</li>
<li>Knott, M. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+undruggable%3A+exploiting+neomorphic+features+of+fusion+oncoproteins+in+childhood+sarcomas+for+innovative+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+and+therapeutic+relevance+of+cancer-associated+transcript+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions.</a> Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).</li>
<li>Duesberg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genes+generated+by+rare+chromosomal+rearrangements+rather+than+activation+of+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).</li>
<li>Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+Fusion+Genes+in+Pediatric+Cancers%3A+Toward+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).</li>
<li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).</li>
<li>Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+EWS%2FFLI+identifies+NKX2.2+as+a+critical+target+gene+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma.</a> Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).</li>
<li>Davicioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+PAX-FKHR+gene+expression+signature+that+defines+molecular+classes+and+determines+the+prognosis+of+alveolar+rhabdomyosarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).</li>
<li>Gröbner, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+genomic+alterations+across+childhood+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of genomic alterations across childhood cancers.</a> Nature. 555, 321-327 (2018).</li>
<li>Kim, J., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+chromosome+translocations+involving+EWS+and+related+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members.</a> Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).</li>
<li>Boulay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Specific+Retargeting+of+BAF+Complexes+by+a+Prion-like+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain.</a> Cell. 171, 163-178 (2017).</li>
<li>Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+domains+mediate+transformation+by+the+Ewing%E2%80%99s+sarcoma+EWS%2FFLI-1+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Multiple domains mediate transformation by the Ewing’s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene.</a> Oncogene. 10, 423-431 (1995).</li>
<li>Leach, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+fusion+target+AF9+is+an+intrinsically+disordered+transcriptional+regulator+that+recruits+multiple+partners+via+coupled+folding+and+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding.</a> Structure. 21, 176-183 (2013).</li>
<li>Ng, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+aromatic+side+chains+within+a+disordered+structure+are+critical+for+transcription+and+transforming+activity+of+EWS+family+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).</li>
<li>Riggi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS-FLI1+Divergent+Chromatin+Remodeling+Mechanisms+to+Directly+Activate+or+Repress+Enhancer+Elements+in+Ewing+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma.</a> Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).</li>
<li>Tomazou, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+Mapping+Reveals+Distinct+Modes+of+Gene+Regulation+and+Widespread+Enhancer+Reprogramming+by+the+Oncogenic+Fusion+Protein+EWS-FLI1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1.</a> Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).</li>
<li>Sankar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+relevance+of+EWS%2FFLI-mediated+transcriptional+repression+in+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma.</a> Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).</li>
<li>Gangwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellites+as+EWS%2FFLI+response+elements+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+Properties+of+EWS%2FFLI+Regulation+via+GGAA+Microsatellites+in+Ewing%27s+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1, 177-187 (2010).</li>
<li>Guillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oncogenic+EWS-FLI1+Protein+Binds+In+Vivo+GGAA+Microsatellite+Sequences+with+Potential+Transcriptional+Activation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function.</a> PLoS One. 4, 4932(2009).</li>
<li>Chong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+and+selective+low-complexity+domain+interactions+that+control+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription.</a> Science. 361, (2018).</li>
<li>Johnson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+EWS+domain+of+EWS%2FFLI+in+binding+GGAA-microsatellites+required+for+Ewing+sarcoma+anchorage+independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).</li>
<li>Theisen, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+functionally+maps+the+intrinsically+disordered+domain+of+EWS%2FFLI+and+reveals+novel+transcriptional+dependencies+for+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis.</a> Genes & Cancer. 10, 21-38 (2019).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).</li>
<li>Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+types+of+GGAA-microsatellites+and+their+roles+in+EWS%2FFLI+binding+and+gene+regulation+in+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma.</a> PLOS One. 12, 0186275(2017).</li>
<li>Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+retention+in+transcription+factor+fusion+genes+and+its+biological+and+clinical+implications%3A+a+pan-cancer+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study.</a> Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).</li>
<li>de Mendíbil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+Selection+in+Fusion+Transcripts+Resulting+from+Chromosomal+Translocations+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer.</a> PLOS One. 4, 4805(2009).</li>
<li>Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+domain+combinations+in+proteins+encoded+by+chimeric+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts.</a> Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).</li>
<li>Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Structural+Disorder+Confers+Cellular+Viability+on+Oncogenic+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins.</a> PLoS Computational Biology. 5, 1000552(2009).</li>
<li>Latysheva, N. S., Babu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+and+understanding+oncogenic+gene+fusions+through+data+intensive+computational+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches.</a> Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).</li>
<li>Deneen, B., Denny, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+p16+pathways+stabilizes+EWS%2FFLI1+expression+and+complements+EWS%2FFLI1+mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation.</a> Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).</li>
<li>Kendall, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3-FOXO1+transgenic+zebrafish+models+identify+HES3+as+a+mediator+of+rhabdomyosarcoma+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis.</a> eLife. 7, 33800(2018).</li>
</ol>

SLL은 샐러리우스 제약의 자문 위원회 위원이자 지분 보유자로서 이해 상충을 선언합니다. SLL은 또한 미국 특허 번호에 상장 된 발명가입니다. 미국 7,393,253 B2, "유잉 육종의 진단 및 치료를 위한 방법과 조성물", 그리고 미국 8,557,532, "약물 내성 유잉육종의 진단 및 치료" 이는 데이터 및 자료 공유에 대한 JoVE 정책을 준수하는 것은 아닙니다.

온코겐 전사 요인의 생화학 적 메커니즘을 연구하는 것은 그들이 일으키는 질병을 이해하고 새로운 치료 전략을 설계하는 데 매우 중요합니다. 이것은 융합 전사 인자 결과로 염색체 전좌를 특징으로 하는 악성에서 특히 사실이다. 이러한 키메라 단백질에 포함된 도메인은 야생형 단백질에 존재하는 조절 도메인과 의미 있는 상호 작용이 부족할 수 있으며,융합(26,27,28)의맥락에서 구조 기능 정보를 해석하는 능력을 복잡하게 만든다. 더욱이, 이러한 온코겐성 융합의 대부분은 본질적으로 무질서한 도메인10,13,29,30의낮은 복잡성을 특징으로 한다.
EWS 도메인은 다양한 온코겐성융합(10)에관여하는 본질적으로 무질서한 도메인의 예입니다. 본질적으로 무질서하고 반복적인 성격은 EWS 도메인에 의해 채택된 분자 기계장치를 이해하는 노력을 방해했습니다. 구조 기능을 조사하기 위한 사전 노력은 주로 관련 세포 맥락을 재구성하지 못하는 기자 유전자 해석의 맥락이나 세포 배경에서 상이한 돌연변이를 사용하거나 의미 있는 부분기능(11,17,25)을생성하는 구조적 변이가 결여되어 있다. 여기에 제시된 메서드는 이러한 문제를 해결합니다. 구조 기능 매핑은 질병 관련 세포 컨텍스트에서 수행되며 차세대 시퀀싱을 통해 전사 프로파일링을 통해 네이티브 크로마틴 설정에서 전사 인자 기능을 평가할 수 있습니다. EWS/FLI의 DAF 돌연변이의 특정 사례에서, DAF는 분리된 반응 요소를 사용하여 리포터 분석에서 거의 활성을 보여주지 만, 기자 분석또는 네이티브 크로마틴에서 전체 유전자 프로모터의 맥락에서 활성을 나타내기 위해 흥미로운표현형(23)을시사한다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 게놈 전반에 걸쳐 어떤 유형의 조절 요소가 질병 환경에서 가장 반응성이 있는지에 대한 질문을 보다 직접적으로 해결합니다. 네이티브 크로마틴 컨텍스트에서 모든 후보 대상 유전자를 동시에 테스트함으로써 전사적 접근법은 부분 기능을 가진 구조를 식별할 가능성이 더 높습니다.
질병 관련 세포 배경을 사용하는 내재된 강점은 아마도 이 기술의 가장 큰 한계일 것입니다. 가장 중요한 요인 중 하나는 이러한 실험에 적합한 세포 시스템을 선택하는 것입니다. 병상 전사 인자를 가진 악성에서 파생된 많은 세포주는 그 전사 인자의 녹다운을 쉽게 용납하지 않으며, 많은 경우에, 특히 소아암의 경우, 기원의 진정한 세포는 논란의 여지가 있으며 다른 세포 배경에서 종양유전자의 발현은 엄청나게독성이 31,32입니다. . 이러한 경우에, 연구원이 결과의 해석에 주의를 기울이고 보다 질병 관련 세포 모형에 있는 어떤 관련 사실 인정든지 적절하게 유효성을 검사하는 한, 다른 세포 배경에서 실험을 수행하는 것이 유용할 수 있습니다.
종양 유전자의 발현의 안정성과 표현성 결과를 신중하게 검증하고 엄격한 기준을 충족하는 시퀀싱을 위한 시료만 제출하는 것이 매우 중요합니다. 여기서, 여기에는 소수의 알려진 표적 유전자의 녹다운 및 구조, qRT-PCR을 확인하기 위해 서체 블롯을 포함하여 양성 대조군(도2)을검증하였다. 각 배치를 통해 가능한 한 세포 및 RNA 제제를 가능한 한 유사하게 수행함으로써 가능한 한 많은 배치 가변성을 감소하는 것이 중요합니다.
여기에서 기술된 방법은 연구 중인 전사 인자의 게놈 전체 기능에 말하는 다른 유형의 게놈 데이터와 결합될 때 특히 강력해집니다. 이러한 유형의 구조 기능 분석에 대한 향후 방향은 ChIP-seq 및 ATAC-seq를 포함하도록 확장되어 전사 계수의 결합과 크로마틴 접근성의 유도된 변화를 결정할 것입니다. 제품군으로서 이러한 유형의 데이터는 온코겐 전사 요인의 다른 구조 구성 요소가 기능의 다양한 측면(즉, DNA 바인딩 대 크로마틴 수정 대 공동 레귤레이터 모집)에 기여하는 위치를 가리킬 수 있습니다. 전반적으로, NGS 기반 접근법을 사용하여 융합 전사 인자의 구조 기능 관계를 매핑하면 이러한 단백질의 온코겐 성 기능의 생화학 적 결정요인에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이것은 그들이 일으키는 질병에 대한 우리의 이해를 높이고 새로운 치료 전략의 개발을 가능하게하는 데 중요합니다.

유년기와 사춘기의 많은 악성을 포함하는 암의 하위 집합은 새로운 융합 온코진1,2,3,4,5,6을생성하는 염색체 전좌를 특징으로 합니다. 결과 융합 단백질은 종양발생7,8을촉진하기 위해 전사 조절의 광범위한 변화를 조율하면서 종양 발생 요인으로 자주기능한다. 이러한 전좌를 가진 암은 일반적으로 병상 융합4,9를제외하고 몇몇 반복되는 게놈 수차와 함께, 그렇지 않으면 조용한 돌연변이 풍경을 가지고 있습니다. 따라서 융합 단백질을 직접 표적으로 하는 것은 이러한 질환에서 매력적인 치료 전략이다. 그러나, 이러한 온코인성 전사 인자는 일반적으로 낮은 복잡성, 본질적으로 무질서한, DNA 결합 도메인(DBD)과 융합된 전사활성 도메인(DBD)10,11,12,13,14로구성된다. 이 단백질의 본질적으로 무질서한 도메인 (IDDs) 및 DBDs 는 전통적인 약리학적 접근을 표적으로 하기 어려운 입증되었습니다. 새로운 치료 접근법의 개발은, 그러므로, 유전자 발현을 비정상적으로 조절하기 위하여 이 융합에 의해 채택된 기계장치의 더 상세한 분자 이해가 필요합니다.
EWSR1의 N-말단 IDD 부분은 일반적으로 유잉 육종의 EWS/FLI, 확산 소둥근 세포 종양의 EWS/WT1, 그리고 소프트파트(10)의명확한 세포 육종에서 EWS/ATF1을 포함한 암에서 DBD에 일반적으로 융합된다. 이러한 융합의 각각에서 EWS IDD의 기계적인 역할은 불완전하게 이해된다. EWS/ETS 융합 제품군, 특히 EWS/FLI는 현재까지 가장 기능적으로 특징적입니다. EWS/FLI는 게놈 전체 후생유전학 및 전사적 변화를 조정하여 수천 개의유전자7,11,15,16의활성화 및 억압으로 이어진다. 연구 결과에 따르면 IDD는 전사 공동 활성화제(예: p300, WDR5 및 BAF 단지)와 공동 억압자(예: NuRD 복합체)11,15, 17의모집에중요하다는 것을보여주었습니다. FLI1의 C-말단 부분에 EWS IDD의 융합은 FLI1의 ETS DBD에 새로운 DNA 결합 특이성을 부여하며, 융합 온코단백질(EWS/FLI)은 합의 ETS 모티프18,19,20에추가하여 게놈의 반복적인 GGAA-마이크로위성 영역에 결합한다. 공동 활성화자 모집 기능과 결합, EWS/FLI의 이러한 새로운 DNA 결합 활동은 GGAA-마이크로위성에서 드 노보 증강을 촉진하여 전사 시작 사이트(TSS)(TSS)("증강제 유사" 마이크로위성)에 불경하게 작용하고, RNA 폴리머라제 II를 모집하여 GGAA-마이크로위성에서 TSS("프로모터와 같은"11,111)마이크로위성에서 전사를 촉진합니다.
종합하면, 이러한 데이터는 EWS 도메인 내의 개별 요소가 EWS/FLI 바인딩 사이트의 다른 유형에 대한 고유한 공동 규제 기관의 모집에 기여한다는 가설을 주도했습니다. 그러나 EWS/FLI의 EWS 부분 내에서 이러한 요소를 분별하고 어떻게 작동하는지 파악하는 것은 도메인의 매우 반복적이고 무질서한 특성에 의해 방해되었습니다. 여기서 우리는 EwS IDD에서 이러한 요소를 기능적으로 매핑하기 위해 Ewing 육종 세포에서 이전에 출판 된 녹다운 구조 시스템을 활용합니다. 본 시스템에서 EWS/FLI는 FLI1 유전자의 3'UTR을 표적으로 하는 shRNA를 이용하여 고갈되고, 발현은 3'UTR7,17,22가부족한 다양한 EWS/FLI 돌연변이 cDNA 구조로 구출된다. 이러한 실험은 GGAA-마이크로위성 기자 구성, 식민지 형성 분석, EWS/FLI 활성화 및 억압유전자7,17,22의 표적 검증을 포함하여 EWS IDD와 중요한 종양발생 표현형 사이의 구조 기능 관계를 매핑하는 다양한 삭제를 가진 구조에 초점을 맞춘실험입니다. . 그러나 이러한 연구는 EWS/FLI의 EWS IDD 내에서 이산 하위 도메인을 찾지 못해 활성화 또는 억압에 매우 중요합니다. 모든 시험된 구조물은 특정 표적 유전자를 활성화하고 억압할 수 있었고, 효율적인 식민지 형성으로 이어지거나, EWS/FLI 표적 유전자중 하나를 조절할 수 없었으며, 식민지 형성7,17,22의손실로 이어졌다.
차세대 시퀀싱의 광범위한 채택에 의해 활성화된 전사 분석은 일반적으로 스크리닝 또는 설명 연구의 맥락에서, 두 가지 조건에서 유전자 발현 서명을 비교하는 데 사용됩니다. 대신 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 게놈 전체 발현 데이터를 캡처하여 전사 인자 기능에 IDD의 기여를 특성화하고자 했습니다. 이 경우 RNA-seq는 녹다운 구조 시스템과 결합되어 EWS 도메인의 구조 기능 관계를 탐구합니다. 이 접근법은 다른 EWS 융합 또는 제대로 이해되지 않은 기능을 가진 야생 형 전사 인자를 포함한 다른 융합 전사 인자에 적용되며 기자 소사 또는 표적 qRT-PCR과 같은 기능 매핑 연구에 사용되는 다른 저술보다 여러 가지 장점이 있습니다. 여기에는 관련 크로마틴 컨텍스트에서 함수의 구조적 결정요인 테스트, 하나의 분석법(예: 활성화 및 억압, GGAA-마이크로위성 및 비마이크로위성 등)에서 여러 유형의 반응 요소를 테스트하는 기능, 부분 기능을 더 잘 검출할 수 있는 능력이 포함됩니다.
이 접근법의 성공적인 구현은 관심표현형을 포착하는 세포 기반 시스템(이 경우 shRNA 매개 EWS/FLI 고갈을 가진 A673 세포) 및 세포 기반 시스템에 적합한 발현 벡터에서 돌연변이 구조패널(이 경우, 다양한 3x-FLAG 태그-EWS/FLI 돌연변이를 가진 pMSCV-hygro)에 의존한다. CRISPR 기반 고갈 구문, shRNA 기반 고갈 구조 및 안정적인 세포주를 생성하는 적절한 선택으로 cDNA 발현 구문 중 하나의 바이러스 성 변환은 과도 의 과도 연산에 권장됩니다. 전사 데이터의 다운스트림 해석은 전사 계수및 사용 가능한 다른 현상제 판독기의 국소화와 관련된 다른 데이터와 결합될 수 있을 때 강화됩니다.
이 문서에서는 EWS/FLI14의DAF 돌연변이의 활성을 특성화하기 위해 이 방법을 적용합니다. DAF 돌연변이체는 EWS/FLI14의EWS IDD의 반복적인 영역에서 알라닌 돌연변이에 17개의 티로신을 갖는다. 이러한 특정 EWS 돌연변이는 이전에 보고되었으며 ATF1 DBD14에융합될 때 기자 유전자 발현을 활성화할 수 없다. 그러나, 예비 qRT-PCR 데이터는 이 돌연변이가 EWS/FLI 표적 NR0B123의전사를 활성화할 수 있었다는 것을 건의했다. 여기에 설명된 전사적 접근 법은 DAF 돌연변이의 부분 기능을 성공적으로 검출할 수 있게 해 주었다. 이러한 전사 데이터를 EWS/FLI 바인딩 및 인식 모티프에 대한 정보와 페어링함으로써 DAF 돌연변이가 GGAA 마이크로위성 반복에서 기능을 유지한다는 것을 더욱 보여줍니다. 이러한 결과는 DAF를 첫 번째 부분 기능 EWS/FLI 돌연변이체로 식별하고 비마이크로위성 유전자에서 의 기능을 종양 발생에 중요하게 식별합니다(보고된23). 이것은 온코겐 전사 요인의 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해이 전사 구조 기능 매핑 접근 방식의 힘을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Wet Lab Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-FLI rabbit pAb</td><td>Abcam</td><td>ab15289</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-lamin B1 rabbit pAb</td><td>Abcam</td><td>ab16048</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Cell-based system for introduction of mutant constructs</td><td></td><td></td><td>사용된 세포 시스템에 의해 결정</td></tr>됨 <tr><td>바이러스 분취량의 경우</td> <td>cryotubes</td><td></td><td></td>를 사용합니다.</tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>G418</td><td>ThermoFisher</td><td>10131027</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>HEK293-EBNAs</td><td>ATCC</td><td>CRL-10852</td><td>바이러스 생산용</td>HEPES</tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>M2 anti-FLAG mouse mAb</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Near IR-secondary 항체</td><td>Li-Cor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>바이러스 형질도입용</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL 재고로 보관</td></tr><tr><td>RNeasy Plus 키트</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>gDNA 제거 컬럼 포함</td></tr><tr><td>사용된 세포 시스템에 따라</td><td>선택 시약</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>바이러스 생산용</td></tr><tr><td>조직 배양 배지</td><td></td><td></td><td>바이러스</td></tr> 생산<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력한>소프트웨어</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr>HPC <tr><td>환경에</td><td></td><td></td><td></td>대한 액세스</tr>에 사용되는 <tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2304</td><td></td></tr> <tr><td>AnnotationDbi</td><td></td><td></td><td>1.38.2</td></tr><tr><td>Cairo</td><td></td><td></td><td>1.5-10</td></tr><tr>DESeq2에 사용된 셀 시스템에 의해 결정됨<td></td><td></td><td></td><td>1.16.1</td></tr><tr><td>유전자 필터</td><td></td><td></td><td>1.58.1</td></tr><tr><td>ggbiplot</td><td></td><td></td><td>0.55</td></tr><tr><td>ggplot2</td><td></td><td></td><td>3.1.1</td></tr><tr><td>조직. </td><td></td><td></td> Hs.eg.db <td>3.4.1</td></tr><tr><td>pheatmap</td><td></td><td></td><td>1.0.12</td></tr><tr><td>PuTTY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td>3.4.0</td></tr><tr><td>RColorBrewer</td><td></td><td></td><td>1.1-2</td></tr><tr><td>reshape2</td><td></td><td></td><td>1.4.3</td></tr><tr><td>rgl</td><td></td><td></td><td>0.100.19</td></tr><tr><td>R-studio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> STAR <td>버전 2.6 이상</td></tr><tr><td>sva</td><td></td><td></td><td>3.24.4</td></tr><tr><td>TrimGalore!</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>윈SCP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

많은 암은 종양 발생 융합 전사 인자의 발현을 초래하는 염색체 전좌를 특징으로합니다. 전형적으로, 이들 단백질은 다른 단백질의 DNA 결합 도메인(DBD)과 융합된 본질적으로 무질서한 도메인(IDD)을 포함하고 악성종양을 촉진하기 위해 광범위한 전사 변화를 조율한다. 이 융합은 수시로 그(것)들이 일으키는 원인이 되는 암에 있는 유일한 반복하는 게놈 수차, 그(것)들을 매력적인 치료 표적을 만드는. 그러나 종양 유발 전사 요인을 대상으로하려면 복잡성이 낮고 IDD가 함수에서 재생하는 기계론적 역할에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. EWSR1의 N 단말 도메인은 EWS/FLI, EWS/ATF 및 EWS/WT1을 포함한 다양한 온코겐 융합 전사 인자에 관여하는 IDD입니다. 여기서, 우리는 유잉 육종에서 EWS/FLI의 전사 기능에 중요한 EWS 도메인의 구조적 특징을 조사하기 위해 RNA-시퀀싱을 사용합니다. 다양한 EWS 돌연변이 구조의 자궁 발현과 결합된 유잉 육종 세포로부터내생 융합의 첫 번째 shRNA 매개 고갈이 수행된다. 그런 다음 RNA-시퀀싱은 EWS 도메인내의 돌연변이와 관련된 기능적 적자를 특성화하기 위해 이러한 구조를 발현하는 세포의 전사를 분석하는 데 사용된다. 전사 분석을 EWS/FLI DNA 결합 모티프 및 게놈 국소화에 대한 이전에 발표된 정보와 통합하여, 기능적 특성화를 위한 기능적 분석뿐만 아니라, 온우주발생에 중요한 EWS/FLI의 구조적 특징을 파악하고 유동 육종에 중요한 EWS/FLI 표적 유전자의 새로운 세트를 정의할 수 있었습니다. 본 논문은 RNA-시퀀싱을 본질적으로 무질서한 온코겐 전사 인자의 구조 기능 관계를 매핑하는 방법으로 서열화하는 방법을 보여줍니다.

예비 qRT-PCR 데이터는 EWS의 반복적이고 무질서한 지역에서 알라닌 돌연변이에 특정 티로신을 가진 DAF에게 불린 EWS/FLI 돌연변이가, EWS/FLI 표적 유전자를 활성화하는 기능을 유지한다는 것을 건의했습니다, 그러나 중요한 표적 유전자를 억압하는 것을 실패했습니다23. EWS 도메인과 EWS/FLI 기능에서 이러한 잔류물의 관계를 더 잘 이해하기 위해 그림 1에 설명되고 설명된 프로토콜이 사용되었습니다. A673 유잉 육종 세포는 FLI1의3'UTR을 표적으로 하는 shRNA로 바이러스적으로 변형되어 내인성 EWS/FLI의 고갈을 초래하였다. 4일간의 선택 후, EWS/FLI 기능은 구조 없이 빈 벡터를 통해 다양한 3XFLAG 태그EWS/FLI 돌연변이 구조물의 바이러스 성 전염으로 구조되었습니다. Δ22라고 불리는 EWS 도메인이 결여된 비기능 돌연변이는 음의 제어로 사용되었고 wtEF라고 불리는 야생형 EWS/FLI가 양수제어(도 2A)로사용되었다. DAF는 테스트 구문으로 사용되었지만 원하는 경우 두 개 이상의 테스트 구인을 사용할 수 있습니다. 세포는 추가로 10일 동안 선택되어 생성 발현이 안정화된 다음 RNA(gDNA 제거 단계), 단백질 및 식민지 형성 에세이를 수집하였다. 4개의 복제가 수집되었고, 효과적인 녹다운 및 구조가 보이는 대표적인 qRT-PCR 및 서부 얼룩이 도 2B-D에표시된다. DAF가 구조한 세포가 도 2E에도시된 바와 같이 식민지를 형성하지 못해 손상된 온코겐성 변화를 시사한다는 점에 유의해야 한다.
복제 검증 및 현상 분석의 완료에 따라, RNA는 도서관 준비 및 다음 세대 시퀀싱을 위한 전국 아동 병원에 게놈 의학 연구소에 제출되었습니다 ~5천만 bp 쌍단 읽기 수집. 데이터는 fastq.gz 파일로 반환되었습니다. 낮은 품질의 읽기는 TrimGalore와 이 파일에서 손질되었고 STAR는 인간 게놈 hg19에 판독을 정렬하고 유전자 당 읽기를 계산하는 데 사용되었다. hg19는 다운스트림 분석에 사용되는 EWS/FLI에 대한 다른 선별된 데이터 집합과의 호환성을 목적으로 사용되었습니다. 이러한 읽기 수는 모든 샘플에 대한 단일 카운트 행렬로 결합되었으며, 그 중 첫 6행은 그림 3에표시됩니다.
카운트는 처음에 배치 정규화 없이 DESeq2를 통해 실행되었지만, 샘플 간 거리의 육안으로 검사는 그림 4A에서빨간색 화살표로 강조 표시된 바와 같이 잠재적인 혼동 배치 효과를 보였다. 이것은 가능성이 각 배치의 처리에 있는 배양및 다름에 있는 세포의 통과에 의해 소개된 생물학 가변성 때문에 생겼습니다. 일괄 처리 효과에 대한 정규화는 ComBat에서 수행되었으며 일반적으로 권장됩니다. 배치 정규화된 데이터의 샘플 간 거리는 그림 4B에표시됩니다. 배치 정규화 에 이어 DESeq2는 기준선을 기준으로 3개의 구문(wtEF, Δ22 및 DAF)에 대한 전사 프로파일을 생성하는 데 사용되었습니다. "부모" A673 세포(여기에 "iLuc"라고 불리는 모의 녹다운 및 모의 구조)가 차동 분석에 포함되었지만,이 실험에 대한 참조는 iEF 세포라고 불리는 EWS / FLI 고갈된 세포입니다. 전사 프로파일은 iEF에 iLuc 샘플을 비교하여 여기에서 내인성 단백질을 생성할 수 있으며, 이는 구조 시스템이 어떻게 작동하는지 이해하는 데 관심이 있을 수 있지만, 이는 이 특정 분석의 목표가 아니다. 돌연변이에 대해 생성된 전사 프로파일에는 iEF와 관련하여 양성(wtEF) 및 음수(Δ22) 컨트롤이 포함되며, 이러한 프로파일은 다른 돌연변이체에 대한 벤치마크로 작동되어야 한다. 이 예에서 긍정적 인 제어가 다른 곳에서 논의 된 내인성 EWS / FLI의 기능을 완전히 재구성하지 않았기 때문에7,23이중요합니다.
도 5의 주 성분 분석(PCA)은 DAF의 전사 프로파일이 wtEF와 Δ22 사이의 중간이며 부분 기능을 확인하는 것을 시사한다. 더욱이, 샘플 전반에 걸친 1000개의 가장 가변적인 유전자의 계층적 클러스터링은 DAF가 EWS/FLI 표적 유전자를 억압하지 못했고, 도 6A 및 도S5에도시된 바와 같이 부분적으로 유지된 유전자 활성화 활성만을 보였다. ToppGene 분석은 DAF가 활성화하는 유전자의 종류가 DAF가 작동하지 않는 그 EWS/FLI 활성화 표적과 기능적으로 구별된다는 것을 건의했습니다(그림 6B). 흥미롭게도, WtEF에 의해 구출된 활성화된 유전자의 기능은 DAF에 의해서는, 전사 통제 및 크로마틴 규정과 관련이 있는 것처럼 보입니다. 식민지 형성 분석의 결과에 기초하여, 이 핵심 유전자 서명에서 유전자는 EWS/FLI 매개 종양 발생에 있는 그들의 역할을 위해 추가 분석되어야 합니다. EWS/FLI 매개 유전자 억압의 중요성은 이전에17에기술되었다.
EWS/FLI는 GGAA-마이크로위성 반복원소(19,22)에대한 고유한 결합친화성을가지고 있으며, 이들 원소에서 결합은 다운스트림 유전자 조절11,15,18,20,22를구동한다. 이들 마이크로위성은 활성화 또는 억압과 연관된 것으로 특징지어지며, (&lt; 5kb) TSS또는 (&gt; 5kb)TSS(25)에대한 실증(&lt; 5kb)의 근접성 중 하나를 특징으로 한다. 또한, TSS23에근접성이 높은 EWS/FLI 조절 유전자(HA) ETS 모티프가 있다. DAF 기능의 특성과 어떤 유형의 EWS/FLI 활성화 유전자DAF를 추가로 분석하기 위해, 이들 상이한 클래스와 관련된 유전자의 차동발현을 분석하였다. 흥미롭게도, DAF는 GGAA-마이크로위성 활성화 유전자를 가장 많이 구출할 수 있었지만, 도 7에서볼 수 있듯이 HA 사이트 근처에서 활성화된 유전자를 구출할 수 없었다. 계층 적 클러스터링에서 볼 수 있듯이 DAF는 모티프 클래스에서 EWS / FLI 매개 억압을 구출하지 못합니다. 이러한 데이터는 DAF가 GGAA 마이크로위성에 결합하고 활성화하기 위해 EWS의 충분한 구조적 특징을 유지한다는 것을 시사합니다. 이는 GGAA에서 EWS/FLI 활동에 중요하다고 생각되는 그대로 SYGQ 도메인에서 발생할 가능성이있다 11. 이 데이터는 또한 DAF에서 돌연변이된 특정 티로신이 HA 사이트에서 EWS/FLI 매개 유전자 조절뿐만 아니라 유전자 억압에서 중요한 역할을 중요하지만 제대로 이해하지 못하는 것을 제안하며, 추가 조사의 중요한 영역을 강조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig01.jpg"> 그림 1: 워크플로. 전사학에 의한 구조 기능 매핑을 수행하는 단계별 절차의 묘사. 셀은 먼저 구조 기능 매핑에 필요한 구조 제품군을 표현할 준비가 되었습니다. 발현에 따라, 세포는 RNA와 단백질을 위해 수확되고 상관 관계 표현형을 위해 분석되었습니다. 구문의 발현이 검증되었고, 이 과정은 독립적인 생물학적 복제를 수집하기 위해 3-4회 반복되었다. RNA는 그 때 차세대 염기서열분석 (NGS)를 위해 제출되었다. 데이터가 수신되면 데이터를 품질에 맞게 트리밍하고 정렬되고 성적증명서당 카운트가 계산되었습니다. 배치 효과는 제어되었고 전사적 서명 및 차동 식은 DESeq2를 사용하여 결정되었다. 다른 -omics 데이터 집합및 다른 경로 또는 기능 분석을 통합하는 계층적 클러스터링 및 다운스트림 분석을 통합할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig02.jpg"> 그림 2: 구조 표현식 및 상관 관계 적 표의 유효성 검사입니다. (A)이 예제에서 테스트된 구체를 묘사한 회로도. (B)내인성 EWS/FLI의 녹다운 및 면역블롯에 의한 3X-FLAG 태그 구조의 발현의 검증. (C,D) EWS/FLI(C) 활성화대상유전자, NR0B1및(D)억압대상 유전자, TGFBR2,qRT-PCR에 의한 시공 활성의 유효성을 검증한다. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로 표시됩니다. P-값은 투키의 정직한 중요성 테스트로 계산되었습니다. * p &lt; 0.05, ** p &lt; 0.01, *** p &lt; 0.005 (E) 콜로니 카운트는 연한 천서 의 변형 활동을 평가하기 위해 수행. P-값은 투키의 정직한 중요성 테스트로 계산되었습니다. * p &lt; 0.05, ** p &lt; 0.01, *** p &lt; 0.005. 이 그림은 Theisen에서 적응,외. 23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig03.jpg"> 그림 3: 분석을 위한 최종 집계 된 카운트 데이터. 모든 시료가 정규화되고 분석될 유전자 카운트 파일의 처음 6행의 스크린샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig04v3.jpg"> 그림 4: 샘플 간 거리 히트맵입니다. (A)원시 개수 데이터의 샘플 클러스터링을 보여주는 샘플 대 샘플 거리 플롯. 일괄 처리 및 샘플별로 클러스터링되는 샘플은 빨간색 화살표로 표시됩니다. (B)ComBat을 사용하여 배치 정규화 한 다음 샘플 간 거리 플롯. 여기서 모든 샘플은 일괄 처리와 는 별개로 클러스터를 함께 복제합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig05.jpg"> 그림 5: 차동 식 분석 결과. (A)모든 샘플에 대해 생성된 전사적 시그니처의 원리 성분 분석(PCA) 플롯은 강력한 샘플 내 클러스터링을 나타내며 DAF가 양수(wtEF) 및 음수(Δ22) 컨트롤 사이에서 중간화되어 있음을 입증한다. (B)각 구문에 있는 유전자에 대해 log2FoldChange에 대해 플롯된 -log(p-값)를 나타내는 화산 플롯. 조정 된 p-값 &lt; 0.05및 |log2 (FoldChange)| &gt; 1은 중요한 것으로 간주되며 빨간색으로 표시됩니다. 패널 5B는 Theisen에서 적응,외. 23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig06.jpg"> 그림 6: 유전자 클래스를 식별하기 위한 계층적 클러스터링. (A)모든 구문과 기준선, iEF에 걸쳐 상위 1000개 가변 유전자의 계층적 클러스터링은 DAF가 EWS/FLI 매개 유전자 활성화를 부분적으로 구출하는 것을 보여준다. (B)DAF에 의해 구조되거나 구조되지 않은 EWS/FLI 활성화 유전자의 기능적 농축을 보여주는 ToppGene의 유전자 온톨로지(분자 기능) 결과. 패널 6B는 Theisen에서 적응,외. 23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61564/61564fig07.jpg"> 그림 7: 상이한 구문에 대한 상이한 전사 인자 반응 요소에 대한 상세한 분석: (A)패널(B) 및 (C)를 생성하는 데 사용되는 데이터 처리를 묘사하는 회로도는 여기에 전사 프로파일과 함께 다른 사용 가능한 데이터 집합을 통합한다. (B,C) 직접 EWS/FLI-(B) 활성화 및(C)억압 된 표적의 상이한 클래스의 구조를 보여주는 편집. 유전자포함된 유전자는 내인성 EWS/FLI에 의한 검출 가능한 차동 발현을 가진 그 유전자만이었습니다. 각 원형 차트에서 회색은 구조에 의해 구조되지 않은 유전자의 부분을 묘사합니다. 빨간색은 분화되는 유전자의 부분을 묘사하고, 파란색은 분화되는 유전자의 부분을 묘사합니다. 이 그림은 Theisen에서 적응,외. 23<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S1: 패스트q.gz 파일을 HPC 환경에 로드하고 트리밍 및 정렬합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S2: 샘플 간에 읽기 수를 정렬하고 ComBat을 사용하여 일괄 처리 정규화를 실행합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig02.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S3: DESeq2 실행 및 차동 식 분석의 결과를 추출합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig03.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S4: 출력 분석. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig04.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S5: 유전자 클래스를 식별하기 위한 계층적 클러스터링: 모든 구문과 기준선 iEF에 걸쳐 상위 1000개 가변 유전자의 계층적 클러스터링이 k 클러스터로 분류됩니다. 이 경우 k=7이지만 이 매개 변수는 그림 S4D에표시된 대로 사용자가 설정합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/61564supfig05.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 S1: 클러스터 성서를 가진 유전자 목록 (Ensembl 유전자 ID). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61564/Table_S1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본질적으로 무질서한 도메인은 온코겐융합 전사 인자 기능에 중요합니다. 이러한 단백질을 치료적으로 표적으로 하기 위해서는 이러한 도메인에 의해 사용되는 규제 메커니즘에 대한 보다 상세한 이해가 필요합니다. 여기서는 전사학을 사용하여 유잉 육종에서 본질적으로 무질서한 EWS 도메인의 중요한 구조적 특징을 매핑합니다.

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

반복적이고 무질서한 전사 인자에 대한 구조 기능 분석을 수행하는 것은 어렵습니다. 전사체학을 올바른 세포 컨텍스트와 결합함으로써 이 접근 방식은 중요한 구조 기능 관계를 더 잘 밝혀냅니다. RNA 염기서열분석을 기능적 출력으로 사용하면 한 번의 실험에서 단일 단백질에 의해 조절되는 모든 유전자를 효과적으로 평가할 수 있으므로 부분 기능 검출 가능성이 높아집니다.부분 기능 검출은 발암성 융합 전사 인자에 특히 중요한데, 이러한 단백질이 어떻게 기능하는지 모르고 염기서열 분석이 융합 유발 암에서 더 나은 치료법으로 이어질 수 있기 때문입니다. EWS/FLI에서 무질서한 EWS 영역에 초점을 맞추겠지만, EWS는 제대로 정의되지 않은 기능을 가진 무질서 도메인을 포함하는 다른 융합에 관여합니다. cDNA 발현 구축물 형질도입을 위해 먼저 섭씨 37도의 수조에서 cDNA 구축물로 냉동 바이러스를 빠르게 해동하고 각 바이틀에 밀리리터당 8밀리그램의 폴리브레렌 2.5마이크로리터를 부드럽게 혼합합니다.다음으로, 바이알 구조체당 50-70% confluent 10cm 세포 배양 플레이트 하나에서 배지를 제거하고 플레이트 측면 아래로 전체 2ml 부피의 구조체를 부드럽게 우회합니다. 플레이트를 흔들어 세포 전체에 바이러스를 고르게 퍼뜨리고 플레이트를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 2시간 동안 놓고 플레이트의 모든 영역이 건조되지 않도록 30분마다 플레이트를 흔듭니다. 배양이 끝나면 소 태아 혈청, 항생제, 피루브산 나트륨 및 폴리브레렌이 보충된 배지 5ml를 추가합니다.세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양 후 상층액을 선택 배지로 교체하고 세포를 추가로 7-10일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣어 선택 및 cDNA 구성 발현을 허용합니다. 선택 기간이 끝나면 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 모아 계수하고 5-10 곱하기 10을 RNA 염기서열 분석을 위한 새 튜브에 5-10 곱하기 5번째 세포에 할당하고 단백질 추출을 위해 6개 세포에 2배 10을 다른 새 튜브에 할당합니다. 원심분리로 세포를 침전하고 펠릿을 1ml의 차가운 PBS 또는 5분 원심분리에 재현탁합니다.그런 다음 펠릿과 액체 질소를 모두 급속 동결하고 전지를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 관심 단백질의 knockdown과 구성물 패널의 발현을 검증하려면 표준 Western blot 분석 프로토콜에 따라 단백질 용해물 샘플을 적절한 1차 및 2차 항체로 블롯화합니다. RNA의 질과 양을 평가하려면 실리카 스핀 컬럼 기반 추출 키트의 용해 버퍼를 사용하여 RNA 염기서열분석 세포 샘플을 용해하고 용해물을 30-60초 동안 분당 13, 000회 이상의 회전으로 게놈 DNA 제거 컬럼에 적용합니다.다음으로, 실리카 스핀 컬럼 정제를 진행하고 키트 지침에 따라 컬럼의 RNA를 세척합니다. 그런 다음 RNA를 30마이크로리터의 용리 완충액에 용리시키고 분광광도계에서 260-280나노미터 비율로 최소 2.5마이크로그램의 RNA를 분석하여 RNA의 양과 샘플 품질을 평가합니다. fastq 파일 분석의 경우 Putty를 사용하여 터미널을 고성능 컴퓨팅 환경으로 열고 project라는 분석 디렉토리를 만듭니다.프로젝트 디렉터리의 경로로 이동하여 fastq라는 압축된 원시 fastq. gz 파일에 대한 디렉터리와 trimmed라는 두 번째 디렉터리를 만듭니다. 압축된 원시 fastq를 전송하기 위한 적절한 보안 파일 전송 프로그램입니다.gz 파일을 로컬 저장소에서 프로젝트 fastq 디렉토리의 경로로 이동하고 각 샘플에 대해 R1 및 R2 파일이 있는지 확인합니다. 프로젝트 fastq의 경로로 이동하고 표시된 대로 trim galore의 명령을 사용하여 fastq에서 낮은 품질의 읽기를 트리밍합니다. GZ 파일.프로젝트 디렉토리의 경로로 이동하여 STAR output이라는 새 디렉토리를 만듭니다. 프로젝트 trim 디렉토리의 경로로 이동하고 표시된 대로 명령을 사용하여 STAR를 실행하여 trimed fastq를 정렬합니다. GZ 파일.표시된 위치에서 전사체당 개수를 포함하는 다음 단계에 필요한 출력을 찾고 명령을 사용하여 유전자 출력 탭 파일당 각 판독을 읽습니다. 첫 번째 열의 경우 다운스트림 처리를 용이하게 하기 위해 ENSEMBL 유전자 ID 열의 마침표 앞의 문자만 사용합니다. 그런 다음 명령을 사용하여 모든 샘플의 개수를 totcts라는 데이터 프레임으로 컴파일하고 원시 개수 데이터의 새 테이블을 탭으로 구분된 텍스트 파일로 저장합니다.DESeq2를 사용하여 각 구문에 대한 미분 표현식 프로파일을 정의하려면 실험적 DESeq2 설계를 입력하고 행렬 함수에서 DESeq 데이터셋을 사용하여 DESeq 데이터셋을 구성하고, 크기 요인을 추정하고, DESeq2를 실행합니다. 분석의 품질을 평가하려면 DESeq2를 사용하여 정규화된 로그 정규화 카운트를 추출합니다. DESeq2 결과에서 각 전사 프로파일에 대한 결과를 추출할 때 knockdown 조건 또는 baseline empty vector를 참조하여 쌍별 비교를 수행합니다.HGNC 유전자 기호로 이러한 결과를 추가로 수정하고 DESeq2 데이터에서 데이터를 ENSEMBL 유전자 ID, HGNC 기호, baseMean 발현 및 로그 2중 변화와 원시 및 조정된 P 값이 있는 모든 구성에 대한 차등 발현 데이터가 있는 단일 파일로 추출합니다. 성공적인 배치 정규화 및 관심 표본 유사성을 평가하고, 코드를 사용하여 정규화된 로그 정규화 카운트를 사용하여 주성분 분석 및 표본 간 거리 플롯으로 표본 클러스터링을 확인합니다. 정규화된 로그 정규화 카운트를 사용하여 1,000개의 가장 가변적인 유전자를 매트릭스로 추출하고 히트 맵을 사용하여 이러한 유전자를 기반으로 샘플의 비지도 계층적 클러스터링을 수행합니다.덴드로그램에서 관심 있는 군집을 추출하려면 덴드로그램 관심 군집의 어떤 수준이 나타나는지 결정하고 K를 해당 수준의 군집 수와 동일하게 설정합니다. 관심 있는 클러스터를 확인하려면 클러스터별로 정렬된 히트 맵을 다시 플로팅하고 테이블에서 각 클러스터와 관련된 유전자 목록을 내보낸 다음 적절한 생물정보학 도구를 사용하여 클래스 간에 식별되고 비교된 다양한 유전자 클러스터에 대한 생물학적 역할을 식별합니다. 이 대표 분석에서는 긍정적 및 부정적 구성을 사용한 효과적인 녹다운 및 구조를 관찰할 수 있습니다.DAF가 구출한 세포는 콜로니를 형성하지 못했으며, 이는 발암성 변형이 손상되었음을 시사합니다. 리플리컨트 검증이 완료된 후, 배치 정규화 및 분석을 위해 모든 샘플에 대해 표현형 분석 및 초기 RNA 염기서열분석 데이터 처리 유전자 수를 얻을 수 있습니다. 배치 정규화가 없는 DESeq2는 배양 내 세포의 통과로 인한 생물학적 변동성과 각 배치 처리의 차이로 인해 발생하는 생물학적 변동성으로 인해 혼란스러운 배치 결함을 초래할 수 있습니다.배치 정규화 후 DESeq2를 사용하여 기준선을 기준으로 관심 구성에 대한 전사 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이러한 데이터에 대한 주성분 분석은 DAF의 전사 프로필이 야생형 EWS/FLI와 Delta 22 사이의 중간에 있음을 시사하여 부분 기능을 확인합니다. 더욱이, 샘플에 걸쳐 1,000개의 가장 다양한 유전자의 계층적 클러스터링은 DAF가 EWS/FLI 표적 유전자를 억제하지 못하고 유전자 활성화 활성을 부분적으로만 유지한다는 것을 보여줍니다.상위 유전자 분석은 DAF가 활성화하는 유전자의 종류가 DAF가 작동하지 않는 EWS/FLI 활성화 표적과 기능적으로 구별된다는 것을 시사합니다. 흥미롭게도, DAF는 GGAA-microsatellite 활성화 유전자를 가장 잘 구할 수 있지만, 친화도가 높은 부위 근처에서 활성화된 유전자를 구할 수는 없다. transcriptomic output을 관련 표현형 분석과 페어링하면 구조 기능 분석이 완료됩니다.연구원들은 또한 다른 기술을 사용하여 다양한 전사 기능의 기계론적 동인을 연구할 수 있습니다.

mapping-structure-function-relationships-disordered-oncogenic

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

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여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 &gt; 1000 TFs 단일 실험에서.

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우리는 CorExplorer 웹 포털, 기계 학습 알고리즘 CorEx (상관 관계 설명)에 의해 발견 된 종양 RNA 염기서열 분석 인자의 탐구를위한 자원을 소개하고 생존, 데이터베이스 주석에 비해 요인을 분석 할 수있는 방법을 보여줍니다, 단백질-단백질 상호 작용, 그리고 종양 생물학 및 치료 내정간섭에 통찰력을 얻기 위하여 서로.

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전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

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