Name: 배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 배우세요 RNAi 라이브러리 스크리닝으로 암세포에서 전사 인자 조절자를 신속하게 식별하는 방법을. 이중 루시퍼라제 리포터 분석을 활용한 중간 처리량 기법으로 비용 효율적인 연구가 가능합니다.

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우리는 shRNA 벡터의 준비를 지원에 대한 에밀리 노턴과 미카엘란 쿠치아레 - 스툴리그로스에게 감사드립니다. 이 작품은 J.M.L.에 수여 수잔 G. 코멘 경력 촉매 그랜트에 의해 부분적으로 지원되었다 (#CCR17477184).

참고: 이 프로토콜의 회로도 요약은 그림 1에나와 있습니다.
1. 렌티 바이러스 벡터 라이브러리 준비
참고 : 시연 된 화면은 96 웰 플레이트에서 글리세롤 주식으로 구입 한 배열 된 shRNA 라이브러리를 사용했지만 라이브러리는 후보 목록을 기반으로 수동으로 조립 할 수도 있습니다. 적절한 컨트롤을 고려하고 라이브러리에 포함해야 합니다. 이는 비표적대조군 shRNA(shNTC), 조사중인 전사 인자를 표적으로 하는 대조군 shRNA를 포함하며, 가능하다면, 반딧불 루시퍼라아제를 표적으로 하는 shRNA를 포함한다.
<ol><li>1.3 mL의 루리아 국물 (LB) (1 % 바토 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 1 % NaCl, pH 7.5)을 100 μg / mL의 암피실린을 함유 한 96 웰 딥 웰 플레이트의 각 우물에 추가하십시오. 글리세롤 스톡 2 μL로 각 우물을 접종하고 225 rpm에서 일정한 교반으로 밤새 37 °C에서 성장합니다.</li>
	<li>각 세균 배양을 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 21,000 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 박테리아를 펠렛한다.</li>
	<li>제조자의 프로토콜에 따라 세균 미니 준비 키트를 사용하여 각 벡터를 정화합니다.</li>
	<li>분광광도계를 사용하여 각 벡터의 농도를 결정합니다.</li>
	<li>플라스미드를 -20°C에 보관합니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 배열 된 렌티 바이러스 라이브러리의 포장
참고 : 감염 된 세포의 포장, 감염 및 후속 배양을 포함하여 렌티 바이러스와 관련된 모든 작업은 엄격하게 제도적 생물 안전 규칙 및 규정을 따라야합니다.
<ol><li>완전한 성장 배지(Dulbecco의 변형 된 이글 배지(DMEM)를 사용하여 4mMM L-글루타민을 함유하는 293FT 세포를 확장, 4,500 mg/L 포도당과 나트륨 피루브산, 10% 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 100 단위 / mL, 100 μg / mL 스트렙토 마이신 항생제 및 2 mM L-글루타민으로 보충.</li>
	<li>1.4단계에서 라이브러리의 각 벡터에 대해, 1 x 105 293FT 셀을 가진 1개의 24웰 시드를 시드한다. 참고: 3단계로 진행하기 전에 대조군 바이러스 벡터의 일부 추가 웰을 패키징하고 바이러스의 적기를 테스트하는 데 사용하는 것이 좋습니다(아래 참조).</li>
	<li>37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다. 참고: 이전에설명한 렌티바이러스 포장에 대한 일반적인 프로토콜은 이 프로토콜에 대해 24개의 웰로 축소되었습니다. 렌티바이러스 포장에는 psPAX2를 사용하고 VSVG를 코트 단백질로 사용합니다. 에스트로픽 바이러스가 필요한 경우 VSVG 대신 Eco를 제공하는 벡터를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표적 세포의 30%-70% 감염 효율을 제공하는 바이러스 성 적기를 달성하도록 최적화되는 것이 좋습니다(토론 참조). 사용된 모든 벡터 목록은 보충 표 1을 참조하십시오.</li>
	<li>아래에 설명된 바와 같이 단계 1.4로부터 각 바이러스 벡터에 대한 형질감염 혼합물을 설정한다. 각 형질감염은 바이러스 벡터의 250 ng, psPAX2의 125 ng, VSVG의 125 ng, 형질감염 시약 1의 1.25 μL 및 23.75 μL의 형질전환 버퍼를 포함해야 한다(재료 표참조).<ol>
<li>각 렌티바이러스 벡터를 뉴클레아제없는 물로 50 ng/μL로 희석한 다음 5 μL (250 ng)을 96웰 PCR 플레이트의 우물로 옮니다.</li>
		<li>"X"가 총 형질 감염 수와 파이펫 팅 중 부피 손실을 고려한 몇 가지 추가 형질 전환 버퍼의 1.25 μL * X형형질 시약 1 및 23.75 μL * X를 혼합하여 형질감염 슈퍼 믹스를 만듭니다.</li>
		<li>5 분 동안 실온에서 형질 전환 슈퍼 믹스를 배양.</li>
		<li>2.4.3 단계에서 트랜스펙션 슈퍼 믹스 튜브에 psPAX2 및 125 ng * X의 125 ng * X를 추가하고 부드럽게 위아래로 파이펫을 섞습니다. 2.4.5단계로 빠르게 진행합니다.</li>
		<li>즉시 단계 2.4.4에서 PCR 스트립의 각 튜브로 혼합물을 알리쿼트한 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여 25 μL의 혼합물을 단계 2.4.1로부터 바이러스 벡터를 함유하는 각각의 웰내로 이송한다.</li>
		<li>실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>2.4.6단계에서 각 96웰로부터 30 μL을 2.3단계에서 293개의 FT 셀을 함유하는 24웰의 웰로 이송한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양한 다음 24웰 플레이트의 모든 웰에서 500 μL의 신선한 완전 성장 매체로 미디어를 교체합니다. 37°C에서 세포를 5%CO2로 배양하여 다른 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>멀티 채널 파이펫을 사용하여, 각각의 웰및 aliquot 220 μL (3 단계에서 1 감염에 충분하고 약간의 추가 부피)에서 바이러스 상급체를 2 개의 96 웰로 수집합니다. 이들은 배열 된 바이러스 상판 플레이트입니다.</li>
	<li>배열된 바이러스 상층 판을 -80°C에 보관한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 또한 3단계로 진행하기 전에 감염될 세포에 패키징된 추가 제어 바이러스(위 참조)를 테스트하는 것이 좋습니다. 이는 적시자가 적어도 30% 감염 효율을 달성하기에 충분한지 확인하기 위한 것이다.</li>
</ol>3. 스크린을 위한 세포의 감염
참고 : 인간 흑색종 세포 (A375)는이 접근법을 입증하는 데 사용되었지만,이 방법은 렌티 바이러스로 감염되는 모든 부착 세포에 적용 될 수 있습니다. 그러나, 세포 배양 및 도금 조건은 각 세포주별로 최적화되어야 한다(토론 참조).
<ol><li>완전한 성장 매체에 감염되는 세포를 확장한다.</li>
	<li>종자 24-웰 플레이트와 1 x 105 세포를 0.5 ml의 완전한 성장 매체당. 시드는 각 바이러스 벡터에 대해 잘 테스트(대조군 포함)하고 3.7단계에서 약물 선택을 위한 대조군역할을 할 감염되지 않을 여분의 웰을 포함한다.</li>
	<li>37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>3.2단계에서 각각 의기류로부터 상이한 바이러스성 상상류를 다음과 같이 동결배열된 렌티바이러스 상수체로 각각 잘 감염시켰다.<ol>
<li>20 μg/mL 폴리브렌을 포함하는 완전한 성장 매체를 준비하십시오.</li>
		<li>2.7단계에서 상온으로 배열된 렌티바이러스 라이브러리 과민제를 해동한다.</li>
		<li>3.2단계로부터 24웰 플레이트로부터 성장 매체를 흡인하고 즉시 각 웰에 200 μL의 폴리브레인 함유 성장 매체를 첨가한다.</li>
		<li>다중 채널 파이펫을 사용하여, 단계 3.4.2에서 24 웰에 각 96 웰에서 바이러스 상류의 200 μL을 전송 3.4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24-48 h에 대해 5%CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다. 참고: 몇몇 세포주 shRNA를 표현하고 puromycin 저항하기 위하여 24 시간 이상 요구할 수 있습니다. 여기서 사용되는 바이러스 벡터는 3'UTR의 puroR에서 miR30-기반 shRNA를 이용한 터보-GFP-IRES-puroR를제공한다(도 1). 감염 효율 및 puromycin 저항 성 유전자 및 shRNA의 발현은 녹색 형광 단백질에 의해 모니터링되었다.</li>
	<li>2.5 μg/mL 푸로마이신을 포함하는 완전한 성장 매체를 준비하십시오. 참고 : puromycin의 선택 농도는 세포주에 따라 다릅니다. 각 세포주마다 항생제 사살 곡선을 투여하여 스크린 에 앞서 분석하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>각 웰로부터 매폐를 흡인하고 500 μL의 푸로마이신 함유 완전 성장 매체로 교체한다. 참고 : 또한 puromycin 선택이 완료되도록 후속 단계에서 사용할 수있는 제어 비 감염 잘에 puromycin을 추가해야합니다.</li>
	<li>48 시간 동안 5 %CO2로 37 °C에서 세포를 배양하십시오. 참고 : 48 h를 선택하는 것이 가장 좋습니다, 그래서 도금 밀도와 바이러스 성가기는 세포가 48 시간 이전에 과잉 되지 않도록 최적화되어야한다.</li>
	<li>감염된 세포가 형광 현미경 의 밑에 녹색이고, puromycin으로 잘 처리된 통제에 세포가 4단계로 진행하기 전에 모두 죽은다는 것을 확인하십시오.</li>
</ol>4. 이중 루시퍼라아제 리포터의 형질전환용 시종 세포
참고: 각 새로운 세포주에 대한 최적의 시드 밀도를 결정하기 위해 테스트 형질감염이 이루어져야 합니다.
<ol><li>트립시니화 단계 3.9에서 각 웰을 전송하고 다음과 같이 새로운 24-웰 플레이트에 해당 위치에서 우물로 대략 1 x 105 셀을 전송합니다. 참고: 이 프로토콜은 수백 개의 shRNA가 있는 라이브러리의 스크리닝을 위해 설계되었기 때문에 감염된 세포의 모든 우물을 계산하는 것은 불가능합니다. 따라서, 아래 단계는 대략 동등한 도금 밀도를 보장하기 위해 각 우물의 셀 수를 추정하는 데 사용되었다.<ol>
<li>3.9단계에서 3-4그룹으로 웰을 그룹화하여 그룹의 모든 웰이 유사한 세포 밀도를 갖도록 한다.</li>
		<li>트립시니화 1 각 그룹에서 잘 1 트립신-EDTA의 200 μL (1 x PBS 보충 0.5 mM EDTA 와 0.1% 트립신) 5 분 동안 37 °C. 그런 다음 완전한 성장 매체를 함유하는 400 μL의 푸로마이신을 첨가하여 트립신-EDTA를 중화시켰다.</li>
		<li>각 대표자 수를 잘 계산하여 전체 성장 매체를 사용하여 각 대표자로부터 세포 현탁액을 2 x 105 셀/mL로 잘 희석한다.</li>
		<li>종자 0.5 mL (1 x 105 세포) 단계 4.1.3에서 새로운 24 웰 플레이트상에 해당 위치로 각 웰을 배양하고 37 °C에서 5 %CO2로 24 시간 동안 이 새로운 24 웰 플레이트를 배양합니다.</li>
		<li>단계 4.1.1에서 각 그룹에 대해, 4.1.3 단계에서 결정된 총 셀 번호를 사용하여 결과 셀 서스펜션이 1 x 106 셀/mL이 되도록 각 웰에 추가할 트립신-EDTA의 부피를 계산합니다.</li>
		<li>각 웰에 트립신-EDTA의 적절한 부피를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 참고 : 더 큰 화면의 경우 세포의 생존가능성을 보장하기 위해 24 웰 플레이트가 한 번에 아닌 그룹으로 트립시니화되고 보충되는 것이 좋습니다.</li>
		<li>상기 배양 동안, 다중 채널 파이펫을 사용하여 새로운 24웰 플레이트상에 상응하는 웰에 400 μL의 퓨로마이신 함유 완전 성장 매체를 첨가한다.</li>
		<li>4.1.7단계에서 제조된 새로운 24웰 플레이트상에서 각각의 웰으로부터 100 μL의 셀 현탁액(약 1 x 105 셀)을 이송한다.</li>
		<li>단계 4.1.6에서 4.1.8을 반복하여 단계 4.1.1에서 그룹화 된 우물의 모든 플레이트에 대해 한 번에 한 접시를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. 이중 루시퍼라제 기자의 변형
<ol><li>4.2단계에서 각각 잘 트랜스펙트 하는 이중 루시퍼라아제 리포터는 다음과 같이 구성한다. 참고: 레닐라 루시퍼라제 벡터를 제어하는 반딧불 루시퍼라아제 리포터 벡터의 총 DNA 량 및 최적 비율은 이 분석기를 시작하기 전에 결정되어야 한다. 여기서, 20개의 반딧불이 루시퍼라제 리포터와 1개의 부품 대조군 레닐라 루시퍼라아제를 포함하는 DNA 혼합물의 400ng을 사용하였다.<ol>
<li>각 시약의 지시된 부피를 혼합하여 형질전환 혼합물(튜브 A)과 리포터 희석 혼합물(TubeTable 1B)을 확인하여 총 형질감염 수(플러스 몇 가지 추가)를 곱하였다. 참고: 이 프로토콜은 트랜스펙션 시약 2에 최적화되어 있습니다(재료 표참조). 다른 형질감염 시약을 사용하는 경우, 이 단계 이전에 형질감염이 최적화되어야 한다.</li>
		<li>형질감염 혼합물(튜브 A)을 리포터 희석 혼합물(튜브 B)과 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하여 형질감염 혼합물을 생성한다.</li>
		<li>상기 배양 동안, 4.2단계에서 인산완충염수(PBS)의 0.25 mL로 각 24웰을 헹구고, 각각의 웰에 447 μL의 완전한 성장 매체를 첨가한다.</li>
		<li>15분 배양 후, 다중 채널 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 53 μl의 형질전환 혼합물을 분배한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 세포를 5%CO2로 24시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>6. 이중 루시퍼라아제 활성의 정량화
<ol><li>하기 아래에 설명된 바와 같이 플레이트 리더 및 이중 루시퍼라제 리포터 분석 키트를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 참고: 이 프로토콜은 표시된 리포터 분석 키트(재료 표참조)에 최적화되어 있으며 제조업체의 권장 프로토콜을 따릅니다.<ol>
<li>모든 웰에 대해 충분한 1x 수동 용해 버퍼를 준비하고 5x 수동 용해 버퍼(키트에 제공)를 탈이온수로 1-5로 희석하여 몇 가지 추가(웰당 75 μL필요)를 준비합니다. 또한 시약 A 및 시약 B 버퍼를 해동합니다(키트에 제공, 각 웰에 대해 각각 100 μL이 필요하다).</li>
		<li>5.2 단계에서 24 웰 플레이트의 각 웰로부터 미디어를 흡인합니다.</li>
		<li>각 웰에 75 μL의 1x 수동 용해 버퍼를 추가하고 가끔 흔들면서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>해동된 시약 B 완충액으로 50x 시약 B 기질(키트에 제공)을 1:50으로 희석하여 시약 B를 준비한다.</li>
		<li>블랭킹을 위해 4개의 웰에 1x 수동 용해 버퍼 30 μL을 추가합니다(보충 표 2참조).</li>
		<li>6.1.3단계에서 30 μL의 용해액을 96웰 의 평평한 바닥 백색 분석 판의 중복 우물로 옮김.</li>
		<li>멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 μL의 시약 A를 추가하고 플레이트 리더가있는 반딧불 루시 퍼라제 신호를 읽습니다.</li>
		<li>다중 채널 파이펫을 사용하여 6.1.4 단계에서 50 μL의 시약 B를 각 우물에 추가하고 플레이트 리더가 있는 Renilla 루시퍼라제 신호를 판독합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원시 데이터를 다음과 같이 처리합니다(자세한 설명은 보충 표 2참조).<ol>
<li>낮은 값이 바이러스 구조가 독성 또는 너무 적은 형질 감염 세포가 분석되었다는 것을 나타내기 때문에 매우 낮은 Renilla luciferase 신호와 샘플을 제외합니다. 참고: 토론에서 설명한 대로, 상당히 "낮은" 레닐라 루시퍼라아제 신호는 비정상적인 결과를 초래할 수 있습니다. 여기서, 레닐라 루시퍼라아제 신호가 평균 이하의 1표준 편차 이상인 웰을 배제하였다(보충표 2참조). 이는 이들세포(14)에서이 리포터 시스템을 사용하여 수행된 이전 연구에 기초하였으나, 다른 세포주에서 다를 수 있다.</li>
		<li>반딧불/레닐라 비율을 얻기 위해 동일한 웰의 원시 레닐라 루시퍼라아제 값으로 각각의 원시 반딧불 루시퍼라아제 값을 정규화한다.</li>
		<li>모든 복제 제어 우물의 반딧불 /레닐라 비율을 평균하고 배 변화를 얻기 위해 그 숫자로 다른 모든 우물의 반딧불 /레닐라 비율을 분할합니다.</li>
		<li>컨트롤 샘플을 할당하고반딧불/레닐라 비율 값을 1로 설정합니다.</li>
		<li>표준 편차로 중복 우물과 플롯의 반딧불 /레닐라 비율을 평균화합니다. 참고: 표준 편차는 통계 분석에 사용되지 않고 복제본이 크게 다른 웰을 식별하는 수단으로 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 연구에서, 우리는 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하고 테스트하는 데 사용할 수있는 이중 luciferase 기반 전사 기자 분석과 함께 배열 된 바이러스 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝에 대한 접근법을 보여줍니다. 모든 스크린에 앞서 각 세포주별로 리포터 시스템을 특성화하고 최적화하는 것이 중요합니다. 실험은 리포터가 조사중인 전사 인자의 변경 된 활동에 반응하고 활성의 변화 규모를 제어 벡터에 비해 테스트해야하는지 확인하기 위해 수행해야합니다. 리포터 구문과 함께 PRL-TK 구문의 공동 형질감염은 리포터와 함께 형질전환된 세포의 수와 리포터 구문의 카피 수를 제어하는 데 도움이 되기 때문에 중요하며, 둘 다 루시퍼라제 신호의 크기를 변경할 수 있다. 최적화 실험은 또한 전사 계수가 결과 해석을 복잡하게 할 수 있으므로 구성적인 Renilla 구문 또는 최소 프로모터 구제의 활동에 영향을 미치지 않도록 해야 합니다. 라이브러리에 포함할 컨트롤도 신중하게 고려해야 합니다. 이 프로토콜은 수백 개의 shRN...

이 분석의 목적은 바이러스 성 라이브러리를 사용하여 상대적으로 빠르고 저렴한 방식으로 전사 인자의 조절자를 식별하는 것입니다. 비정상적인 전사 활성은 암 및 전이1,2,23,34,45,6,,6따라서 암세포에서 전사 인자를 표적으로 하는 것은 유망한 치료 접근법이다. 그러나, 전사 인자는 종종 약리학적으로표적화하기 어렵고 많은 것이 성인 조직에서 정상적인 세포 기능에 요구되며8,,9,,10. 질병을 유도하기 위하여 전사 인자를 비정상적으로 활성화하는 암 관련 통로를 표적으로 하는 것은 보다 적게 가혹한 부작용이 있을 가능성이 있는 더 실행 가능한 접근입니다. 배열된 렌티바이러스 및 레트로바이러스 RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA 또는 ORF 라이브러리의 상업적 가용성은 연구원이 단일 실험에서 수많은 유전자의 중요성을 테스트할 수 있게 합니다. 그러나 변경된 전사 활동에 대한 신뢰할 수 있는 판독이 필요합니다.
여기에서, 우리는 암세포에 있는 전사 인자를 조절하는 단백질을 확인하기 위하여 이중 luciferase 기지를 둔 전사 기자 분석및 배열된 lentiviral 도서관의 사용을 기술합니다. 이 분석에서, 표적 암 관련 유전자가 렌티바이러스 전달을 통해 포유류 암 세포로 전달되고 세포는 puromycin을 사용하여 안정된 통합을 위해 선택된다. 세포는 조사되고 있는 전사 인자에 특이적인 프로모터에 의해 구동되는 반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 리포터 구조로 다음에 형질감염되고, 조사되고 있는 전사 인자에 반응하지 않는 구성활성 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라을 발현하는 제어 컨스트럭트. 우리는 YAP 및 TAZ, 하마 경로8,,10,,11의중요한 다운 스트림 이펙터의 규제 기관에 대한 개념 증명 화면으로이 접근 방식을 보여줍니다. YAP 및 TAZ의 비정상적인 활성은 전이성캐스케이드(11)의 여러 단계를 촉진하고 많은 암11,,12,,13에서관찰된다. 그러나, YAP와 TAZ가 몇몇 암세포에서 비정상적으로 활성화되는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. YAP와 TAZ는 DNA를 결합하지 않고, 대신 다른 전사 인자에 의해 발기인에게 모집됩니다. 전사 인자의 TEA 도메인 (TEAD) 가족의 구성원은 YAP 및 TAZ에 대한 주요 결합 파트너이며 대부분의 YAP 및 TAZ 의존적 기능에 중요합니다. 우리의 기자 구성은 YAP/TAZ-TEAD 반응 프로모터로부터 반딧불 루시퍼라아제를 표현하고 이전 연구는 YAP-TEAD 및 TAZ-TEAD 전사 활성2,,14,,15의변화를 충실하게 검출한다는 것을 입증하였다.
당사의 접근 방식은 신속하고 중간 처리량이며 스크리닝 시설, 자동화 된 로봇 또는 풀링 된 라이브러리의 깊은 시퀀싱이 필요하지 않습니다. 비용은 상대적으로 낮으며 상업적으로 이용 가능한 라이브러리가 많이 있습니다. 필요한 장비와 시약은 또한 대부분의 실험실에서 상대적으로 표준입니다. 루시퍼라제 기반 리포터가 존재하거나 생성되는 경우 거의 모든 전사 계수의 조절자를 스크리브하는 데 사용할 수 있다. 우리는 암세포에 있는 shRNAs를 스크린하기 위하여 이 접근을 이용합니다, 그러나 적당한 효율성으로 형질전환될 수 있는 어떤 세포주든지 배열된 도서관의 어떤 모형든지로 이용될 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml 96-웰 딥 웰 폴리프로필렌 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td>세균성 미니 프렙</td></tr><tr><td>트립신 - 2.50%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>트립신-EDTA</td></tr><tr><td>96 웰 플랫 바닥 흰색 어세이 플레이트</td>의 구성 요소 <td>Corning</td><td>3922</td><td>이중 루시페라제 분석용</td></tr><tr><td>암피실린 - 100 mg/ml</td><td>시그마-알드리치</td><td>45-10835242001-EA</td><td>세균성 미니 프렙용</td></tr><tr><td>Bacto 트립톤 - 분말</td><td>시그마 Aldrich</td><td>95039</td><td>LB 국물의 분대</td></tr><tr><td>LAR II 시약 (시약 A), 정지 & Glo 기질(시약 B 기질) 및 Stop & Glo 완충액 (시약 B 완충액) - Kit</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>이중 루시페라제 분석용</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드 제외) - 9.6 g/L</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>PBS EDTA용</td></tr><tr><td>- 0.5 M</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>트립신-EDTA</td></tr><tr><td>에탄올의 구성 요소 - 100%</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>세균성 미니 준비</td></tr><tr><td>태아용 소 혈청 - 100%</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>완전 성장 매체의 구성</td></tr><tr><td>요소 헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌) - 8 mg/ml</td><td>시그마-알드리치</td><td>45-H9268</td><td>바이러스 감염용</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/고포도당 - 4 mM L-글루타민; 4500 mg/L 포도당; 피루브산 나트륨</td><td>GE Healthcare 생명 과학</td><td>SH30243.01</td><td>완전 성장 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>I3-P/i3 다중 모드 마이크로플레이트/EA</td><td>분자 장치</td><td></td><td>이중 루시페라제 분석용</td></tr><tr><td>L-글루타민 - 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>완전 성장 배지</td></tr><tr><td>구성 요소 Lipofectamine 3000 (Transfection 시약 2) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Transfections용</td></tr><tr><td>분자 생물학 물 - 100%</td><td>VWR</td><td>02-0201-0500</td><td>바이러스 포장용 shRNA 벡터 희석용</td></tr><tr><td>NaCl - 분말</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>LB 국물의 구성 요소</td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>벡터 DNA 농도 측정</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Transfections용</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &micro; g/ml (스트렙토마이신)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>완전 성장 배지의 구성</td></tr><tr><td>요소 PureLink 퀵 플라스미드 Miniprep Kit - Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td>박테리아 미니 프렙용</td></tr><tr><td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>감염 후 항생제 선택용</td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA 형질주입 시약 (형질주입 시약 1) - 100%</td> <td>Roche</td><td>6365787001</td><td>바이러스 포장용</td></tr><tr><td>효모 추출물 - 분말</td><td>VWR</td><td>J850</td><td>LB 국물</td></tr><tr><td>P3000 (형질주입 시약 3)의 구성 요소 - 100%</td><td>생명 기술</td><td>L3000008</td><td>형질주입용</td></tr></tbody></table>

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

전사 인자는 항암 치료에 대한 좋은 표적을 만드는 다양한 다운스트림 과정에 영향을 미치는 수많은 표적 유전자의 발현을 바꿀 수 있습니다. 그러나, 직접 표적화 전사 인자는 종종 어렵고 전사 인자가 하나 이상의 성인 조직에서 필요한 경우 부작용을 일으킬 수 있다. 암세포에서 전사 인자를 비정상적으로 활성화시키는 업스트림 레귤레이터를 식별하는 것은 특히 이러한 단백질이 약물이 쉬운 경우 보다 실현 가능한 대안을 제공합니다. 여기서, 우리는 암세포에서 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하기 위해 배열된 중간 규모의 렌티바이러스 라이브러리 및 이중 루시퍼라제 기반 전사 리포터 분석기를 결합하는데 사용될 수 있는 프로토콜을 기술한다. 우리의 접근은 단 하나 실험에 있는 유전자의 수백을 시험하는 빠르고, 쉽고, 저렴한 쪽을 제안합니다. 이러한 접근법의 사용을 입증하기 위해, 우리는 예관련 단백질(YAP) 및 전사 공동 활성제와 PDZ 결합 모티프(TAZ)의 여러 조절제를 포함하는 배열된 렌티바이러스 RNAi 라이브러리의 스크린을 수행하였고, 이는 하마 통로의 하류 이펙터인 2개의 전사 공동 활성제이다. 그러나, 이 접근은 거의 모든 전사 요인 또는 공동 요인의 레귤레이터를 위해 스크린하기 위하여 수정될 수 있고 또한 CRISPR/CAS9, cDNA, 또는 ORF 라이브러리를 검열하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

우리의 YAP/TAZ-TEAD 리포터 구조(pGL3-5xMCAT(SV)-492,,14,,15)는반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 구동하는 정준적 TEAD 결합 요소(MCAT)15의 5회 반복을 가진 최소한의 SV-49 프로모터를 함유하고 있다(도1). 그것은 PRL-TK 대조군 벡터(Promega)와 함께 세포내로 병용되어, 이는 구성적으로 활성HSV TK 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라제를 발현한다(도1). YAP/TAZ-TEAD 리포터 구문이 테스트 중인 세포주에서 예상대로 작동하도록 하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 먼저 PRL-TK 및...

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

이 프로토콜은 암세포에 있는 전사 요인의 새로운 레귤레이터를 확인하기 위하여 배열된 렌즈피바이러스 또는 레트로바이러스 분석 라이브러리를 스크린하는 데 이용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신속하고 중간 처리량이며 저렴하며 대부분의 조사관이 일반적으로 접근 할 수있는 장비와 시약을 사용한다는 것입니다. 라이브러리의 각 렌즈피바이러스 벡터를 확장하고 정화하려면 먼저 96웰 의 깊은 웰 플레이트에 암피실린 밀리리터 당 100 마이크로그램으로 보충된 Luria 국물의 1.3 밀리리터를 추가합니다.글리세롤 재고 2마이크로리터로 각각 37도, 분당 225회전에서 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다. 다음 날, 원심 분리를 위한 개별 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 각 박테리아 배양을 전송합니다. 제조업체의 지침에 따라 적절한 세균 미니프렙 키트로 각 벡터를 정화합니다.준비된 라이브러리의 각 벡터에 대해, 24웰 플레이트의 우물을 10~5차 293FT 세포로 1회 시드하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 24시간 동안 배양한다. 라이브러리의 각 벡터에 대해 설정될 경질 혼합물을 준비하기 위해 먼저 각 렌티바이러스 벡터를 핵이 없는 물로 마이크로리터당 50나노그램의 최종 농도로 엘테한다. 각 희석제 의 5 마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트의 개별 우물로 옮는다.전동된 트랜스펙션 버퍼의 23.75 마이크로리터 배 x와 1.25 마이크로리터 배 x의 트랜스페트 시약 1개를 혼합하여 트랜스페션 슈퍼 믹스를 만듭니다. 실온에서 5분간 배양슈퍼 믹스를 배양한다. 그런 다음 psPAX2의 125 나노그램 배 x와 VSVG의 125 나노그램 배 x를 부드러운 파이펫팅과 함께 슈퍼 믹스에 추가합니다.즉시 PCR 스트립의 각 튜브에 슈퍼 믹스를 알리쿼트와 희석 된 바이러스 벡터의 각 우물에 혼합물의 25 마이크로 리터를 전송하는 멀티 채널 파이펫을 사용합니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후, 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 투명 혼합물의 30마이크로리터를 이전에 준비된 24웰 플레이트에서 293FT 셀의 해당 우물로 전송합니다. 세포 배양인에서 24시간 배양하기 위해 신선한 완전한 성장 배지 500마이크로리터로 매시를 교체하기 전에 24시간 동안 세포를 배양한다.다음 날, 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 바이러스 성 상체를 수집하고 각 슈퍼 나탄의 220 마이크로 리터를 새로운 96 웰 플레이트에 두 개의 우물로 알리 쿼트 하여 배열 된 바이러스 성 상체 플레이트를 생성합니다. 감염을 위한 A375 세포를 준비하기 위하여는, 라이브러리에 있는 각 바이러스 벡터에 대하여 잘 당 완전한 성장 매체의 0.5 밀리리터에 있는 24 웰 플레이트에 있는 다섯 번째 세포에 10번 종자. 약물 선택에 대한 제어 역할을 감염되지 않습니다 여분의 우물을 포함.세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양 후, 냉동 배열된 렌즈피바이러스 수퍼나탄을 실온으로 정한 후, 제조된 세포 배양판의 각 웰에서 성장 배지를 200 마이크로리터로 대체하여 폴리브레네밀리리터당 20마이크로그램으로 보충하였다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 96개에서 24웰 플레이트의 각 웰까지 200마이크로리터의 바이러스 성 상피리터를 이송합니다. 세포를 세포 배양 인큐베이터로 24~48시간 동안 되돌려 보라고 한다.인큐베이션의 끝에서, 각 우물의 배지를 500 마이크로리터의 성장 배지로 대체하여 푸오마이신으로 보충하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 돌려보도록 한다. 48시간 puromycin 선택에 따라, 세포를 3~4개의 그룹으로 분류하여 단일 그룹의 모든 우물이 비슷한 세포 밀도를 가지도록 하고, 섭씨 37도에서 5분 배양을 위해 각 그룹에서 잘 한 대표자에게 200마이크로리터를 추가합니다. 일단 세포가 분리되면, 푸오마이신으로 보충된 성장 매체의 400 마이크로리터로 트립신을 중화시키고 각 트립시네이션된 각 트립시니화세포의 수를 잘 계산한다.각 세포 현탁액을 밀리리터 농도당 2배 10~5번째 세포로 희석시키고, 새로운 24웰 플레이트에서 각 세포로부터 의 500 마이크로리터의 세포를 푸오마이신으로 보충하고 종자 500 마이크로리터를 동일한 웰 위치로 희석시켰다. 각 대표자로부터의 수를 잘 사용하여 각 군에서 잘 남아 있는 각 셀 수를 추정한 후, 각 웰에 트립신-EDTA의 적절한 부피를 추가하여 밀리리터 농도당 6번째 세포당 1회 10을 달성한다. 트립시니화 하는 동안, 새로운 24 웰 플레이트에 적절 한 해당 우물에 puromycin으로 보충 성장 매체의 400 마이크로 리터를 추가 하는 멀티 채널 파이펫을 사용 하 여.일단 세포가 분리되면, 각 우물의 내용을 부드럽게 혼합하고 새로운 24 웰 플레이트에 적합한 적절한 대응으로 각 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 전송합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 24시간 동안 되돌려 보입니다. 이중-루시파라제 리포터를 사용하여 세포를 변형시키기 위해, 표에 표시된 대로 경질 희석 혼합물을 준비한다.리포터 희석 혼합물을 준비하기 위해 각 시약의 부피를 총 형질량과 몇 개의 추가 볼륨을 곱한 혼합합니다. 다음으로, 광전사 희석 혼합물과 희석 혼합물을 혼합하고 15분 동안 실온에서 생성된 용액을 배양하여 트랜스페션 혼합물을 생성한다. 인큐베이션 하는 동안, PBS의 250 마이크로 리터와 세포 배양 판의 각 우물을 헹구고 각각의 우물에 신선한 완전 성장 매체의 447 마이크로 리터를 추가 합니다.그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 53마이크로리터의 형질 혼합을 세포 배양 판의 각 웰에 분배한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24시간 동안 배치합니다. 루시파아제 활성을 측정하기 위해, 오리파제활성 키트로부터 5배 수동 용해 버퍼를 1대 5 희석물로 희석하고 키트에서 필요한 시약 A 및 시약 B 버퍼를 해동한다.시약이 준비되면 각 우물의 상체를 75 마이크로리터의 수동 용해 버퍼로 교체하고 실온에서 30 분 동안 플레이트를 가끔 흔들어 보배합니다. 인큐베이션 동안, 50X 시약 B 기판을 키트에서 해동 시약 B 버퍼로 1-50 농도로 희석한다. 인큐베이션의 끝에서, 4 개의 빈 컨트롤 우물에 수동 용해 버퍼 30 마이크로 리터를 추가하고 96 웰 평평한 바닥 흰색 분석 플레이트의 중복 우물로 각 우물에서 30 마이크로 리터를 전송합니다.모든 lysate가 도금된 경우 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 마이크로리터의 시약 A를 추가하고 플레이트 판독기와 함께 반딧불 루시파라기 신호를 읽습니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 마이크로리터의 시약 B를 추가하고 플레이트 판독기와 함께 Renilla luciferase 신호를 읽습니다. 예상대로, YAP2SA는 반딧불 루시파라제 활성을 증가시키지만 레닐라 루시파아제 활성은 대조군 벡터와 비교하여 증가하지 않습니다.대조적으로, YAP2SA S94A는 반딧불 루시파라제 활동을 증가시키지 않습니다. 중요한 것은, YAP2SA는 MCAT TEAD 바인딩 요소가 없는 최소 프로모터 구조의 활동을 변경하지 않는다는 것입니다. YAP-TAZ-TEAD 리포터 구조와 감염된 세포에서 탠덤 YAP 및 TAZ 짧은 헤어핀은 반딧불 루시포아제 수준을 현저히 감소시켰지만, 대조군 짧은 헤어핀 비표적 제어는 그렇지 않다.대조적으로, 최소한의 리포터 구조로 전염되는 세포에서, YAP-TAZ 짧은 머리핀 RNA는 반딧불 루시파라기 수준을 크게 바꾸지 않습니다. 각 우물의 Renilla 신호는 또한 짧은 머리핀 비 표적화 대조군 또는 YAP-TAZ 짧은 머리핀 RNA에 의해 현저하게 변경되지 않습니다. 예상대로 YAP 및 TAZ, SARC 또는 PI3 키나아제를 대상으로 하는 짧은 헤어핀 RNA는 YAP-TAZ-TEAD 활성을 현저히 감소시킵니다.ATM, CDH1, CSK, ERBB2 및 gelsolin을 대상으로 하는 짧은 헤어핀 RNA는 각각 이러한 단백질이 YAP 및/또는 TAZ임을 보여주는 출판된 연구와 일치하는 정규화된 반딧불 루시파라기 수준을 증가시켰습니다. 다른 세포 유형에서 ATR, CCNE2 및 ERBB4에 대한 확립 된 역할에도 불구하고, 이러한 유전자를 대상으로 짧은 머리 핀 RNA는 크게 A375 세포에서 정규화 반딧불 luciferase 수준을 변경하지 않습니다. 이 화면 다음에는 레귤레이터를 식별하는 것이 전사 인자 활동에 대한 다른 판독을 사용하여 유효성을 검사해야 합니다.분석에 의해 식별 된 레귤레이터의 효과적인 녹다운도 확인되어야한다. 특히 바이러스가 인간전염성인 경우, 전염성 렌티바이러스로 작업할 때 주의하고 안전 지침을 따르는 것을 기억하십시오.

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