단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

중성자 결정학은 생물학적 거대분자에서 수소 원자 위치를 결정하기 위한 구조 기술입니다. 중성자 구조는 양성자화 상태와 물 분자 방향을 밝혀 반응 메커니즘과 결합 상호 작용을 밝힙니다. X선 회절과 달리 중성자 회절은 비파괴 기술이라는 장점이 있습니다.

감광성 그룹 또는 금속 센서를 가진 단백질은 방사선 손상 없이 연구할 수 있습니다. 중성자 단백질 결정학을 수행하기 위해 크고 깨지기 쉬운 단백질 결정이 실온 데이터 수집을 위해 석영 모세관에 장착됩니다. 결정 모세관 장착은 일상적으로 수행되지 않으므로 이 기술을 시연

결정 수확의 경우, 9웰 대용량 실리콘 유리판에 단백질 결정이 들어 있는 밀봉된 샌드위치 상자를 열고 마이크로피펫을 사용하여 결정화 저장 용액에서 10-20마이크로리터를 유리 슬라이드로 옮깁니다. 현미경으로 결정을 평가합니다. 적절한 크기의 마이크로루프를 사용하여 결정을 수확하고 결정을 저장 용액의 방울에 놓습니다.

크리스털 장착의 경우, 직경 2mm, 50mm 길이의 석영 모세관을 사용하여 피펫으로 흡입 reservoir buffer를 취하고 capillary의 한쪽 끝을 reservoir buffer로 채웁니다. 장착 루프를 사용하여 크리스탈을 석영 모세관 내의 저장 버퍼에 부드럽게 놓습니다. 튜브를 두드려 저장소 완충액과 결정을 모세관 아래로 이동하고 길고 얇은 피펫을 사용하여 결정 주변에서 용액을 흡입합니다.

얇은 종이 심지를 사용하여 결정을 조심스럽게 건조시키고 모세관 벽을 건조시킨 다음 모세관 끝에 20-50마이크로리터의 중수소화 완충 용액을 추가합니다. 열 봉을 사용하여 밀랍 일부를 녹이고 밀폐 밀봉이 형성될 때까지 녹은 밀랍에 모세관을 부드럽게 삽입합니다. 결정 장착 후 2일, 6일, 10일에 중수소화 완충액을 20-50마이크로리터의 새로운 중수소화 완충액으로 교체하고 시연된 바와 같이 각 증기 교환 후에 새로 녹은 밀랍으로 모세관을 다시 밀봉합니다.

최소 2주간의 증기 교환 후 퍼티를 사용하여 석영 모세관을 기기 샘플 스테이지에 고정된 IMAGINE 중성자 회절계 측각계 샘플 스틱에 고정하고 샘플을 내리고 중성자 빔 및 검출기 영역에 붙입니다. Beamline 제어 컴퓨터에서 데이터 수집 프로그램을 열고 설정 탭을 클릭하여 데이터 수집 전략을 설정하고 기기 이름 및 수집할 이미지 이름을 포함한 실험 매개변수를 입력합니다. collect(수집) 탭을 클릭하고 노출 시간 및 수집할 프레임 수를 포함한 데이터 수집 매개변수를 입력합니다.

광학 그래픽 사용자 인터페이스 내에서 람다 최소값으로 2.78을 클릭하고 람다 최대값으로 4.5를 클릭하여 데이터 수집의 유사 범위를 설정합니다. 스캔 시작을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 중성자 데이터 수집 후 동일한 온도에서 동일한 결정에 대한 해당 X선 데이터 세트를 수집합니다.

극저온 데이터를 수집하기 전에 샌드위치 상자에서 저장 용액을 제거하고 샌드위치 상자에 중수소화 저장 용기 완충 용액을 채우고 일주일 동안 평형을 유지하고 3회 반복합니다. 저장 용액을 3회 더 교환한 후 마이크로루프로 결정을 수확하고 결정을 동결 보호 용액에 2시간 동안 담근 후 극저온 결정 마운트에 부착된 마이크로 루프에 결정을 장착합니다. 장착된 크리스탈과 극저온 마운트를 액체 질소에 넣습니다.

결정이 동결되면 cryo stream이 장착된 고분자 중성자 회절계 시료 스테이지에 결정을 장착합니다. 크리스탈이 마운트되어 데이터 수집을 위해 중앙에 배치되었는지 확인하고, 제안서 정보를 입력하고, 폴더 아이콘을 클릭하여 데이터 수집 전략 테이블을 로드한 다음, 제출을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 회절된 중성자는 MaNDi 비행 시간 검출기에 의해 감지되는 대로 실시간으로 볼 수 있게 됩니다.

공동 X선 및 중성자 데이터 정제를 위해 먼저 CCP4를 열고 변환을 선택하여 중성자 데이터의 R 자유 데이터 플래그를 X선 데이터의 플래그와 일치하도록 MTZ 확장 프로그램을 수정합니다. 중성자 데이터 반사 파일을 MTZ 형식으로 가져옵니다. 다른 MTZ 파일에서 무료 R 데이터 가져오기를 선택하고 X-ray MTZ 파일을 가져옵니다.

일치하는 새 MTZ 파일의 이름을 지정하고 실행을 클릭합니다. 그런 다음 Phoenix 소프트웨어 패키지를 열고 구체화에서 ready set을 클릭합니다. 단백질 좌표 파일을 업로드하고, 없는 경우 모델에 수소를 추가하도록 선택하고, 드롭다운 메뉴에서 교환 가능한 부위에서 HD를 선택하고 다른 곳에서는 H를 선택합니다.

Add deuterium to solvent molecules(용매 분자에 중수소 추가)를 선택하고 run(실행)을 클릭하여 시작합니다. 구조 세분화를 위해 세분화 탭에서 피닉스를 엽니다. Refine 프로그램을 사용하여 X-ray 및 Neutron 데이터를 모두 사용하여 미세 조정을 설정합니다.

구성 탭에서 해결된 X-ray 구조의 PDB 파일을 입력합니다. 중성자 데이터에서 MTZ 파일을 업로드합니다. MTZ 파일 데이터를 neutron R free에서 중성자 데이터로 할당합니다.

X-ray 데이터에서 MTZ 파일을 업로드하고 X-ray 데이터 및 X-ray R free로 할당합니다. 미세 조정 설정에서 표준 미세 조정 전략이 선택되어 있는지 확인하고 사이클 수를 5로 늘립니다. 모든 파라미터, 고급 및 수소를 선택합니다.

수소 미세화 모델을 개별으로 변경하고 ADP를 타고 있는 힘을 끈 다음 원자력을 검색합니다. X-HD에서 핵 거리 사용을 선택합니다. 실행을 클릭하여 구체화를 시작합니다.

Phoenix에서 모델을 구축하려면 Coot에서 열기를 클릭합니다. Coot에서 X-ray electron density 및 neutron scattering length density 맵을 시각화합니다. 디스플레이 관리자를 선택하고 중성자 2FOFC 중성자 산란 길이 밀도 맵을 삭제합니다.

MTZ 열기를 선택하고 MTZ 열기를 선택하고 중성자 데이터 mtz 파일을 엽니다. 진폭 및 위상 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 no_fill_neutron 데이터를 선택하여 채워지지 않은 중성자 산란 길이 밀도 맵을 엽니다. 잔류물에 대한 육안 검사를 수행하여 모델이 데이터에 적합한지 여부를 확인하고 수소-중수소 교환 가능 부위의 차이 밀도 맵 피크를 분석하여 올바른 방향과 점유를 결정합니다.

중성자 SLD 맵과 수소 결합 상호 작용에 따라 물 분자의 방향을 변경합니다. 중성자 SLD 맵에 따라 단백질 잔류 수소-중수소 교환 가능 부위의 양성자화 상태와 방향을 조정합니다. 완전한 구조를 얻기 위해 대화식 모델 구축 및 미세 조정을 추가로 수행합니다.

수성 완충액에서 성장한 수소화 단백질 결정은 약 1, 000 x 900 미크론을 측정합니다. 결정은 중성자 회절 데이터를 수집하기 전에 3주 동안 중수소 산화물 기반 버퍼와 증기 교환을 위해 석영 모세관에 장착할 수 있습니다. 중성자 회절 데이터는 2.30 옹스트롬 해상도에서 며칠 동안 수집되었으며 동일한 결정에서 X선 회절 데이터 세트가 수집되었습니다.

FO의 피크에서 FC 중성자 산란 길이 밀도 맵은 아스파라긴과 같은 잔기의 방향에 대한 귀중한 정보를 제공하고 FO에서 FC 중성자 산란 길이 밀도를 뺀 양의 피크는 히스티딘과 같은 적정성 그룹을 가진 잔기의 양성자화 상태를 결정하는 데 매우 유익합니다. 물 분자에 대한 전자 및 중성자 산란 길이 밀도 맵의 맵 오버레이는 수소 결합 상호 작용이 X선 데이터에서 추론될 수 있지만 중성자는 이러한 수소 결합의 위치에 대한 명확한 정보를 제공한다는 것을 나타냅니다. 중성자 산란 길이 밀도 생략 맵은 수소-중수소 측쇄 작용기 방향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

교환할 수 없는 수소 원자가 탄소에 결합되는 중성자 산란 길이 밀도 맵은 밀도 상쇄로 인해 전자 밀도 맵과 비교할 때 불완전해 보입니다. 따라서 X선 및 중성자 데이터를 모두 사용하여 단백질 골격의 위치를 결정하는 데 사용할 수 있는 샘플의 공동 미세 조정을 수행하는 것이 좋습니다. 중성자 단백질 결정학에는 큰 결정이 필요합니다.

크리스탈을 취급하고 장착하는 동안 쉽게 깨질 수 있는 크리스탈이 손상되어 데이터 품질이 저하되지 않도록 주의해야 합니다. 중성자 단백질 결정학은 단백질 반응 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하여 동역학, 돌연변이 유발 또는 분광학으로 그 역할을 추가로 조사할 수 있는 촉매 관련 잔류 물 또는 물 분자를 잠재적으로 밝힐 수 있습니다.