Name: 단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 중성자 결정학을 활용한 단백질 내 수소 원자 위치 분석 방법을. 석영 모세관에 결정을 장착하고 데이터를 수집하여 단백질의 양성자화 상태와 물 분자 방향을 밝히는 구조 생물학 기법입니다.

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단백질 발현, 정제 및 결정화 실험은 오크 리지 국립 연구소의 미국 에너지 생물 및 환경 연구 사용자 시설인 구조 분자 생물학 센터(CSMB)에서 수행되었습니다. 중성자 회절 데이터는 미국 에너지부 기초에너지과학부 과학사용자시설부(ORNL)의 스Pallation 중성자 출처(SNS)에서 BL-11B MaNDi에서 수집되었습니다. 저자는 데이터 감소에 대한 도움을 브렌던 설리반 감사합니다. X선 회절 데이터는 노스캐롤라이나 주에서 지원하는 노스캐롤라이나 주립 대학의 분자 교육, 기술 및 연구 혁신 센터(METRIC) 시설에서 수집되었습니다. GCS는 ORNL에서 국립 연구 재단 (NRF), 남아프리카 공화국 및 대학원 기회 (GO!) 프로그램에서 부분적으로 지원을 인정합니다. FM은 USDA NIFA 해치 211001 지원을 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

중성자 단백질 결정학은 단백질에서 프로토네이션 상태와 물 분자 방향을 조사하는 매우 민감한 기술입니다. 이 정보는 프로토네이션과 수소 결합 상호 작용의 변화가 종종 효소 화학10의 중심이기 때문에 단백질 촉매 메커니즘에 빛을 비추는 경우가 많습니다. 중성자 단백질 결정학은 유익한 기술이기는 하지만 중성자 회절 실험을 수행하기 전에 고려해야 할 여러 가지 요인이 있습니다.
<ol><li>데이터 수집을 위한 대형 단백질 결정의 요구 사항입니다.</li>
	<li>수소 및 금속 이온과 같은 기타 원소의 산란 특성.</li>
	<li>단정된 샘플로 작업할 때 구조 개선 및 모델 구축 소프트웨어의 제한사항입니다.</li>
</ol>중성자 단백질 결정학은 플럭스 한정 기술이다. X선 회절 데이터 집합과 는 달리, R-팩터가 높고 완전도가 낮으며, 중복성 및 신호 대 잡음 비율은 고유한 제한(플럭스 제한, 준 라우, 긴 파장)으로 인해 중성자 데이터 집합에 대해 예상됩니다. 단일 프레임의 데이터 수집은 일반적으로 12 - 18 시간입니다. 실험의 성공은 샘플 크기와 품질에 크게 좌우되며, 크리스탈은 0.1 mm3의 경우가 종종 최소 요구 사항3입니다. 중성자 회절은 10에서 800 μL에 이르는 결정화 방울을 설정하기 위해 다량의 단백질생산을 요구합니다. 충분히 큰 결정을 성장하기위한 최소 부피는 결정 및 샘플 매개 변수 (https://neutrons.ornl.gov/imagine)를 감안할 때 볼륨 계산기를 사용하여 추정 될 수있다. 큰 결정의 성장은 가장 널리 증기 확산에 의해 달성되었다3. 매달려 있는 낙하 결정화는 10-25 μL에 이르는 큰 방울에서 결정의 성장을 허용하며, 최대 ~ 50 μL에 이르는 더 큰 방울은 시판 가능한 착하 장비14,54를 사용하여 설정할 수 있습니다. 실리콘 9웰 유리 플레이트는 최대 800μL의 부피를 사용하여 매우 큰 방울을 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 유리 판은 햄프턴 연구에서 시판되는 "샌드위치 상자"에 배치됩니다. 추가 결정화 기술은 배용기에 의해 낙하 크기의 한계가 결정되는 배치 결정화를 포함한다. 배치 결정화 실험은 마이크로리터에서 밀리리터55까지 다양할 수 있습니다. 결정화는 또한 단백질이 투석막을 통해 침전제와 평형되는 투석 기술을 사용하거나 침전성 농도 그라데이션을 따라 또는 아가로오스56,57과 같은 다공성 플러그를 통해 역확산에 의해 수행될 수 있다. 시드는 원하는 부피의 결정을 얻기 위한 또 다른 대안을 제공합니다. 마이크로 및 매크로 시드는 NcLPMO9D45의 큰 크리스탈을 포함하여 큰 결정 성장을 위해 성공적으로 채택되었습니다. 용해도에 대한 온도의 영향을 포함하여 단백질 상 다이어그램에 대한 일부 지식은 큰 결정 성장에 도움이 됩니다.
중성자 회절 실험을 계획할 때, 회절 데이터 수집 시 신호 대 잡음 비율을 최대화하기 위한 단백질 제제의 최적화가 필수적이다7. H 원자에 의한 밀도 취소및 높은 일관성 있는 산란을 우회하기 위해, 중성자 SLD 지도는 양극성 산란 길이와 낮은 일관성 산란 길이를 가진 동위원소 D에 H 원자를 교환하여 개선될 수 있습니다. 이를 달성하기 위해, 중수소 결정화 완충제에 대한 수소단백질 결정의 증기교환이 수행된다. 이를 통해 용매 분자와 비열성, 틸트라테이블 단백질 H 원자23의 H/D 교환을 보장합니다. 증기 교환은 D2O 기반의 결정화 버퍼 "플러그"를 사용하여 석영 모세관에 수소화 결정을 장착하여 수행되며 가장 자주 적용되는 효과적이고 부드러운 기술을 나타냅니다14,23,35. 교환은 몇 주가 걸릴 수 있으며 바람직하게는 최대 H/D 교환을 보장하기 위해 중음 버퍼를 자주 변경해야합니다. H/D 교환은 또한 결정화 된 버퍼에 직접 침전시킴으로써 수행 될 수있다. D2O 노출로 인한 응력 하에 결정을 두지 않으려면 D2O:H2O 비율을 점진적으로 증가시킴으로써 침을 흡수 공정을 점진적으로 수행해야 합니다58. 이 외에도, 수소화 단백질의 결정화는 또한 음순 H 사이트에서 H/D 교환을 위한 유정완에서 수행될 수 있다22,59. 그러나 D2O 기반 완충은 알려진 H2O 기반 조건3,59의 추가 조정을 요구하는 단백질 용해도에 영향을 미친다는 점에 유의해야 한다. D2O 기반 버퍼는 또한 어떤 경우에는 더 작은 결정으로 이끌어 내는 관찰되었습니다59. 정족성 및 탄소바운드 H 원자를 D로 완전히 교환하면 유족 매체에서 단백질을 발현하여 정해각된 시료20을 생성함으로써 달성될 수 있다. 결과 중성자 SLD 맵은 감전된 시료의 크게 향상되고, 더 이상 수소화시 샘플의 밀도 취소를 표시하지 않는다. 이것은 단백질 또는 공동 인자에 있는 교환할 수 없는 사이트에 H/D 바인딩을 특성화할 때 유익합니다. 그러나, 변성 단백질의 발현은 비용이 높고 수율60이 낮다. 오크 리지 국립 연구소 (ORNL) 구조 분자 생물학 센터 (CSMB) perdeuterated 샘플을 생성 하고자 하는 사용자를 위한 중성 시설 (https://www.ornl.gov/facility/csmb). 전형화된 발현은 전형적으로 정제된 단백질61의 50 mg을 산출하는 1 L 스케일에 대한 생물 반응기에서 수행됩니다.
중성자 회절 데이터의 수집에 따라 개선 및 대화형 모델 구성이 수행됩니다. 페닉스.refine, nCNS 또는 SHELXL28,31,32,33을 포함한 여러 소프트웨어 제품군을 사용하여 개선이 실행될 수 있습니다. Phenix 제품군은 중성자 SLD maps34에서 모델을 수동으로 빌드하는 데 사용되는 Coot와 함께 중성자 회절 데이터를 구체화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 소프트웨어입니다. Phenix와 Coot 모두 중성자 회절 데이터의 처리를 허용하지만 중성자 데이터 및 증식 샘플과 관련된 특이성을 처리하는 데 필요한 특정 기능이 부족할 수 있습니다. 예를 들어, Coot는 "실제 공간 정제"기능은 "폭발"잔류물 (보충 도 26)62결과 때문에 모델 빌드 중에 합병증으로 이어질 수있는 미결 잔류물에 대한 기하학적 최적화를 포함하지 않습니다. 이 문제는 모든 증단된 잔류물에 대한 구속 파일을 생성하여 해결할 수 있습니다. 그러나 이것은 집중적인 프로세스이며 이러한 라이브러리는 현재 공개적으로 사용할 수 없습니다. Phenix에서 세련미를 수행할 때 교환 가능한 H/D 사이트는 처음에는 H 및 D의 0.50 점유율로 설정됩니다. 정교함이 수행됨에 따라 H와 D의 점유율은 중성자 SLD 맵에 따라 개선됩니다. 대화형 모델 구축 중에 차이 밀도 Fo-Fc 맵은 H/D 점유율을 평가하는 데 매우 유익합니다. 지도는 높은 D 점유율을 가진 사이트를 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 이는 프로토 네이션 상태가 촉매 적으로 관련되는 활성 사이트에서 특히 유익하다63. 그러나 H:D가 모호한 상황이 발생합니다. 점유율은 0.70:0.30에 가까우며 중성자 SLD 맵64에서 완전한 신호 가취소됩니다. 또한 준 라우에 중성자 데이터 세트는 종종 약 80 %의 완전성을 가지고 있다는 것을 고려해야하며, 이는 X 선 회절 데이터에 대해 일상적으로 관찰 된 ≥ 98 %보다 낮습니다. Phenix에서 중성자 회절 데이터를 정제할 때 누락된 관찰된 진폭(Fo)은 모델에서 계산되어 반사 목록을 완료하여 모델 바이어스를 도입합니다. 이러한 잠재적 편향 "no_fill" 맵을 고려하려면 대화형 모델 빌드 중에 "채워진" 맵이 아닌 검사해야 합니다.
사용자는 구조의 조인트 X 선/중성자 데이터 구체화 또는 중성자 데이터만 구체화하도록 선택할 수 있습니다. 특히 낮은 해상도의 중성자 SLD 맵을 시각화하는 것은 H/D 증기 교환에도 불구하고 교환할 수 없는 사이트에 H가 여전히 존재하는 수소 단백질에 대해 특히 당황스러울 수 있습니다. 이로 인해 중성자 밀도 맵이 취소되어 불연속 맵65,66의 인상을 줍니다. 해당 X선 데이터 집합을 수집하는 것은 공동 개선에서 이러한 취소를 유리하게 보완합니다(그림 13A 및 도 13B). 관절 정제 전략은 일반적으로 X 선 데이터에 대한 단백질 백본 좌표를 정제하는 것을 포함하며 중성자 회절 데이터는 교환 가능한 사이트에서 H/D 원자의 위치와 점유율을 구체화하는 데 사용됩니다28. 교환 가능한 사이트에 조인트 H/D 점유율을 도입하면 구체화되는 매개 변수의 수가 증가하므로 X선 데이터와의 관절 개선도 데이터 대 매개 변수 비율을 증가시킵니다. 조인트 정제는 동일한 결정 또는 동일한 조건하에서 자라는 결정에서 동일한 온도로 수집되는 해당 X선 데이터 집합을 필요로 합니다. 실온(300K)에서 수집된 중성자 회절 데이터의 경우, 해당 X선 데이터 세트는 방사선 손상을 제한하기 위해 저용량 데이터 수집 전략을 사용하여 실온에서 수집되어야 합니다. 반면, Perdeuterated 샘플은 H/D 신호 취소의 동일한 크기를 가지고 있지 않기 때문에 개선되고 연속적인 중성자 SLD 맵을 제공합니다. 그러나, 금속과 황을 포함한 특정 원소의 중성자 산란 길이는 단백질이 멸폐된 경우에도 중성자 SLD 맵에서 제대로 보이지 않게 만든다(도 13C-F)18. 금속을 특성화해야 하는 경우, 관절 미세 조정에서 X선 회절을 활용하거나 회절 실험을 보완하기 위해 분광 기술을 적용하는 것이 가장 좋습니다. 중성자 전용 데이터 정제는 중성자 데이터 세트가 고해상도를 가지고 있거나 perdeuterated 단백질을 사용할 때 종종 수행됩니다. 또한, 중성자 전용 데이터 정제는 방사선 손상에 매우 민감한 단백질이 연구되고 있는 경우 특히 유용하며, X선 유래 구조는 방사선 유발 유물을 보유할 수 있기 때문입니다. 중성자 데이터 전용 구체화를 수행하려면 해당 중성자 데이터 집합에 충분한 완전성과 해상도가 있는지 확인해야 합니다.
ORNL은 중성자 회절 데이터 수집을 위한 두 가지 시설을 제공합니다: HFIR의 IMAGINE 빔라인과 SNS36,67의 MaNDi 빔라인. 두 계측기 모두 유사한 원리를 사용하는 중성자 회절 데이터 집합을 수집하는 효과적인 수단을 제공하지만, 각 계측기는 빔 시간을 신청할 때 고려해야 할 고유한 사양을 가지고 있습니다. IMAGINE은 준 Laue 데이터를 수집하고 최대 ~ 100 Å의 단위 셀로 결정의 실온 데이터 수집에 최적화되어 있습니다. MaNDi는 최대 ~ 300 Å의 단위 셀이있는 결정에 TOF-Laue 컬렉션을 사용하는 실온 및 극저온 데이터의 수집에 사용할 수 있습니다. 완전한 데이터 집합을 수집하기 전에, 결정이 단일 프레임에 대한 중성자 빔에 노출되는 얻어진 회절 패턴의 품질을 평가하기 위해 크리스탈에서 시험이 수행됩니다. 결정이 충분한 품질인 경우, X선 데이터 처리와 유사한 공정에서 전체 중성자 회절 데이터 집합을 수집, 인덱싱, 통합, 스케일링 및 병합합니다. IMAGINE은 라우에겐과 Lscale 및 MaNDi를 사용하여 맨티드 패키지를 사용하고 3차원 프로파일 피팅48,50,51,68,69,70을 사용합니다. 이러한 시설 중 하나에서 사용자가 되는 과학자는 추가 분석을 위해 MTZ 또는 HKL 형식으로 데이터 집합을 제공합니다.
중성자 회절은 생물학적 거대 분자의 대영 상태 및 수소 결합 상호 작용을 조사하기위한 비 파괴적이고 매우 민감한 기술입니다. 그것은 특히 사진에 민감한 단백질과 금속 단백질에 대 한 유용. 실험을 수행하기 전에 기술및 데이터 처리에 관한 몇 가지 고려 사항을 고려해야하지만, 결과는 관심있는 단백질의 촉매 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 줄 수있는 결과를 산출합니다. 중성자 단백질 결정예학은 전산, 구조, 생화학 및 분광 연구를 보완하여 생물학적 거대 분자를 특성화하는 데 사용되는 생물학자의 도구 상자에서 귀중한 도구입니다.

중성자 대분자 결정학은 단백질의 구조와 근본적인 화학에 독특한 창을 제공하는 기술입니다. 개념적으로 X선 회절과 유사하게 중성자 회절은 거세 분자 구조의 원자학적 세부 사항을 제공하지만, 중성자와 핵의 상호 작용은 종종 X 선 회절로 감지하기 어려운 빛 원자의 국소화를 가능하게합니다. X선 회절 동안 X선은 전자 구름에서 흩어져 있어 수소(H)와 같은 가벼운 원자가 서브-Ångström 해상도2 근처에 없는 전자 밀도 맵에서 제대로 보이지 않게 됩니다. 대조적으로, 중성자의 산란 강도는 다른 산란 길이를 표시하는 동일한 요소의 동위원소와 핵과의 복잡한 상호 작용에 따라 달라집니다. 따라서, 수소(1H) 및 중수소(2H 또는 D)와 같은 가벼운 원자와 동위원소는 중성자 산란 길이 밀도(SLD) 맵에서 중추 탄소, 질소 및 산소 원자에 대한 유사한 가시성을 갖습니다. 더욱이, 중성자 산란의 크기는 전자의 수와 무관하기 때문에, 광원으로부터 산란하는 것은 X선 산란에서 관찰되는 바와 같이, 서로 가까이에 있을 때 무거운 원소에 의해 가려지지 않는다. 중성자 회절을 사용할 때 H와 동위원소 D의 향상된 가시성은 촉매적으로 중요한 잔류물, 공동 요소 및 리간드의 프로토네이션 상태에 대한 귀중한 정보를 제공하고 물 분자의 방향을 돕고 촉매 메커니즘 및 단백질 화학에 대한 중요한 정보를 드러냅니다3. 중성자 회절은 또한 비파괴 적 기술인 이점을 제공하며, 특히 금속 센터 또는 감광성 Redox cofactors2를 가진 단백질과 같은 이온화에 민감한 생물학적 샘플에 특히 적합하다는 이점을 제공합니다. 이 문서의 주요 초점은 고품질 중성자 단백질 결정 구조를 얻기 위해 워크플로우에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 우리는 중성자 단백질 회절및 Ashkar 등 al.7의 훌륭한 개요를 위해 Podjarny 외.4, 블레이클리 5, 블레이클리 외.6 및 O'Dell 외.3에 관심있는 독자를 참조합니다.
중성자는 주로 원자로 원천의 핵 분열 또는 가속기 기반 소스8의 접합이라는 두 가지 공정 중 하나를 사용하는 핵 반응 중에 생성됩니다. 원자로 공급원은 235U 동위원소의 핵핵을 채택하여 연속 중성자 빔을 제공하며, 스환화 중성자 소스는 대상, 예를 들어 수은과 같은 액체 금속, 양성자9를 통해 표적을 포격하여 펄스 중성자 빔을 생성한다. 테네시 주 오크 리지에 있는 오크 리지 국립 연구소(ORNL)는 하이 플럭스 동위원소 원자로(HFIR)와 60Hz 펄스 소스에서 안정된 상태 중성자 소스를 모두 보유하고 있습니다(SNS). HFIR에 위치한 IMAGINE 빔라인은 생물학적 거대 분자에 최적화된 중성자 디프라토계(보충 도 1)10입니다. IMAGINE은 중성자 이미지 플레이트 검출기를 사용하여 단위 셀 가장자리가 있는 단일 결정에서 2.8 - 4.5 Å 범위의 좁은 밴드패스를 사용하여 준 라우 데이터를 측정합니다 <150 Å. SNS에 위치한 거대 분자 중성자 디프라토미터(MaNDi)는 구형 검출기 어레이 프레임(DAF)(보충 도 2)11을 장착한 비행 시간(TOF) 라우중성자 디프라토계이다. MaNDi는 2.0 ~ 6.0 Å12 사이의 튜닝 가능한 2 Å 파장 대역폭을 사용하여 10 - 300 Å 범위의 단위 셀 가장자리가있는 단일 결정의 데이터를 측정합니다.
중성자를 생성하는 과정은 에너지 집약성이 높으며, 싱크로트론 소스13에서 X선 빔 플럭스와 대조될 때 상대적으로 약한 중성자 빔 플럭스를 생성합니다. 데이터 수집 중에 충분한 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 적절한 크기와 품질의 결정을 키워야 합니다14. 일반적으로 0.1 mm3의 부피가 > 있는 결정은 적절한 통계15로 데이터를 수집하는 데 필요합니다. 낮은 유동성 이외에, 중성자와 시료 핵 사이의 상호 작용의 고유 한 특성을 고려해야합니다16. 중성자의 산란 길이는 동일한 요소의 동위원소에 대해 다르며, 작은 각도 중성자 산란(SANS)에서 유리하게 활용될 수 있는 특성으로 시료의 영역을 마스크하거나 강조하여 대조 매칭17로 알려져 있다. 회절 실험에서, 음의 일관된 중성자 산란 길이 H(-3.741 fm for 1H)는 탄소(6.6511 fm), 질소(14N 산소용 9.37fm), 질소(9.37 fm) 등 생물학적으로 관련된 원자의 일관된 중성자 산란 길이 이후 중성자 산란 밀도 맵 기능의 취소로 이어질 수 있다. 인(31P용 5.13 fm)과 유황(32S용 2.804 fm)은 양성(표 1)12,14이다. 또한 H(25.274 fm)의 큰 분산 길이는 데이터 수집 중 배경을 증가시켜 데이터 집합의 품질을 저해하고 데이터 해상도7을 손상시킵니다. H에 의해 도입 된 이러한 한계를 회피하기 위해, 중성자 회절에 대한 H를 교환할 필요가, 2H (D), 이는 긍정적 인 일관된 중성자 산란 길이 (6.671 fm) 상당히 낮은 일관성 산란 길이 (4.04 fm)19. 이는 H 사이트20에서 D의 완전한 통합을 보장하는 완전히 유족 매체에서 자란 유기체에 의해 단백질이 발현되는 과정인 감쇠에 의해 달성될 수 있다20. 또한 교환 가능한 부위(titratable groups)에서만 H를 D로 교체하여 단백질을 부분적으로 중음화할 수 있으며, 교환가능한 탄소바운드 부위는 수소화21을 유지한다. 이것은 중음 어머니에게 수소화한 단백질 결정의 성장에 의해 달성될 수 있습니다22. 그러나 가장 일반적으로, 수소화 단백질의 H/D 교환은 H2O 기반 완충23에서 적당하게 큰 결정의 성장에 따라 증기 교환에 의해 수행된다. 이러한 경우, 결정은 석영 모세관에 장착되고 D20 기반의 어머니 술과 함께 증기로 평형화됩니다.
중성자 소스의 제한된 중성자 플럭스는 며칠에서 몇 주에 이르기까지 더 긴 데이터 수집 시간을 초래합니다24. ORNL에서는 IMAGINE과 MaNDi모두 2-6 Å 범위에서 좁은 파장 밴드패스를 사용하여 데이터 수집25를 최적화합니다. 데이터는 실온 또는 극저온에서 수집할 수 있습니다. Cryo 데이터 수집은 잠재적으로 데이터 품질을 개선하고 동결 트래핑 촉매 중간체의 가능성을 열어줍니다. 중성자 회절 데이터 수집에 이어, X선 데이터 세트는 전형적으로 동일한 온도또는 동일한 조건에서 재배된 결정에서 동일한 결정으로 수집됩니다26. 동일한 온도에서의 데이터 수집을 통해 X선 및 중성자 데이터 모두에 대해 구조 개선이 수행될 수 있으므로 물의 가시성 및 위치 변경 또는 대체 적합성을 가진 잔류물의 점유 와 같은 잠재적인 온도 유발 유물을 방지할 수 있습니다27. 조인트 X-ray 중성자 데이터 정제는 데이터 대 파라미터 비율을 증가시키고 단백질 백본 좌표를 X선 데이터에 대해 정제할 수 있도록 하는 이점을 제공하며, 중성자 회절 데이터는 H/D 원자28의 위치를 구체화하는 데 사용된다. 이것은 단백질에 교환할 수 없는 사이트에 H 원자로 인한 밀도 취소가 존재하는 부분적으로 유족 시료를 사용할 때 특히 유용합니다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 증착된 중성자 구조의 수를 훨씬 초과하지만, X선 데이터의 정제를 위해 처음 설계된 소프트웨어 패키지는 중성자 데이터를 포괄하도록 확장되었습니다3,29,30. 데이터 수집에 따라 페닉스.refine, CNSsolve(nCNS) 또는 SHELXL28,31,32,33과 같은 정제 패키지를 사용하여 모델을 구체화할 수 있습니다. 정제 과정에서 중성자 산란 밀도 맵은 COOT34를 사용하여 수동 피팅을 위해 시각화할 수 있습니다. 구조 솔루션에 따라 좌표 및 중성자 및/또는 X선 회절 데이터 파일을 PDB에 제출할 수 있으며, PDB는 모델을 검증하고 입금하여 공용 access18,29,30에 사용할 수 있습니다.
단백질의 구조적 분석은 수많은 기술이 그들의 기능 및 기계장치를 조사하는 데 사용되는 다각적인 접근 방식입니다35. 중성자 단백질 결정학은 X 선 회절, 분광법, 핵 자기 공명 (NMR) 또는 마이크로 결정 전자 회절 (microED)36과 같은 추가 연구에서 결과를 확장하고 보완하기 위해 귀중한 화학 적 통찰력을 제공합니다. H 원자가 화학의 중심이기 때문에 중성자 단백질 회절은 효소 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 독특하게 배치됩니다. 중성자에 의해 유도된 방사선 손상의 부재는 그(것)들에게 금속로단백질37의 연구 결과에 예외적으로 적합한 프로브를 만듭니다. 여기서는 시료 제제에서 데이터 수집, 정제 및 분석에 이르기까지 중성자 단백질 회절 과정의 대표적인 예를 제시한다(도 1). 중성자 회절 실험을 위한 충분한 크기의 결정은 금속 단백질 Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D)의 성장되었습니다. 노스캐롤라이나 LPMO9D는 글리코시딕 본드38,39에서 산소 원자 삽입에 의한 재발성 셀룰로오스의 분해에 관여하는 구리 함유 금속 단백질이다. NcLPMO9D 활성 부위에는 N단 히스티딘과 제2 보존 히스티딘(보충 도 3)40으로 구성된 특징적인 "히스티딘 브레이스"내에 단핵 구리 센터가 포함되어 있습니다. 곰팡이 LPMOs의 N 단말은 메틸화되지만 효모에서 재조합 식 중에 전환 후 수정이 발생하지 않습니다. NcLPMO9D 휴게 상태에서 구리 센터는 Cu2+ 산화 상태로 존재하며 단일 전자 감소에 의해 Cu1+로 활성화되어 분자 산소가 결합되어 슈퍼옥사이드 종41,42로 빠르게 감소하여 활성화될 수 있습니다. 전반적인 NcLPMO9D 반응은 하이드록실화 다당류 생성물43을 형성하기 위해 전자 1개와 양성자 2개를 추가해야 한다. 다당류 기판으로부터 수소 원자 추상화(HAA)를 담당하는 활성 산소 종의 정체가 확인되지 않았으며 집중적인 구조 및 계산 연구가 현재 진행 중이다44,45. NcLPMO9D 활성 부위의 레독스 화학을 감안할 때, 방사선 손상의 완화는 특히 관련이 있습니다. NcLPMO9D 결정에 대한 실온 및 극저온 데이터 수집을 여기서 설명하여 휴식 상태 및 활성화된 감소 형태로 NcLPMO9D 구조를 결정한다46. 단백질 결정 마운팅, 데이터 수집을 위한 빔라인 계측기 설치, 데이터 준비 및 좌표 파일 및 모든 원자 중성자 구조를 모델링하는 데 필요한 미세 조정 단계에 중점을 둡니다.

<table><tbody><tr><td>흡수성 종이 포인트 크기 #30-#40, 길이 60mm</td><td>DiaDent/DiaVet</td><td>218-292</td><td></td></tr><tr><td>모세관 왁스</td><td>Hampton</td><td>HR4-328</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td></td><td>버전 7.0.077</td><td></td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브(15mL)</td><td>코닝</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브(50mL)</td><td>코닝</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td>버전 0.8.9.2</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap ALS</td><td>Hampton</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>곡선 팁 집게</td><td>Mitegen</td><td>TW-CTF-1</td><td></td></tr><tr><td>염화중수소 용액, 35 wt. % in D2O, &ge; 99 원자 % D</td><td>시그마-알드리치</td><td>543047</td><td></td></tr><tr><td>중수소 산화물 99.9 원자 % D</td><td>시그마-알드리치</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>이중 두께 MicroLoops 1000 &마이크로; m</td><td>Mitegen</td><td>M5-L18SP-1000</td><td></td></tr><tr><td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td><td>Mettler Toledo</td><td>30266626</td><td></td></tr><tr><td>Foam Dewars 표준 용기 800 ml</td><td>Spearlab</td><td>M-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Four Color Mounting Clay</td><td>Hampton</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &ge; 99.5% (T),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>EIGER 4M 검출기가 있는 고플럭스 회전 양극 X선 회절계</td><td>Rigaku, Oxford Cryostream 및 Dectris</td><td>XtaLAB Synergy-R</td><td>홈 소스 X선 회절계</td></tr><tr><td>자기 완드 스트레이트</td><td>Mitegen</td><td>M-R-1013198</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더, 펨토팁 및 기타 유리 마이크로캐필러 충전용 팁(연구용으로만 사용), 0.5 &ndash; 20 & 마이크로; L, 100mm, 라이트 그레이, 192개 (2 랙 &횟수; 96 개)</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes 용량 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix</td><td></td><td>버전 1.14-3260</td><td></td></tr><tr><td>핀 통 18 mm</td><td>Mitegen</td><td>M-R-1013196</td><td></td></tr><tr><td>피펫 용량 0.1-2.5 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683779</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Volume 100-1000 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683825</td><td></td></tr><tr><td>피펫 볼륨 10-100 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683809</td><td></td></tr><tr><td>피펫 볼륨 20-200 &mu; L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683817</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, 평균 mol wt 3,350, 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>석영 모세관, 1.00 mm 내경, 80 mm 길이</td><td>Hampton</td><td>HR6-146</td><td>얇은 벽 모세관</td></tr><tr><td>연구 실체 현미경 시스템</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>재사용 가능한 B3 (SSRL/SAM 스타일) 고니오미터 베이스</td><td>Mitegen</td><td>GB-B3-R</td><td></td></tr><tr><td>라운드 - 미니어처 중공 유리관(VitroTubes) 투명 융합 석영 / 1.00mm 내경, 100mm 길이</td><td>VitroCom</td><td>CV1012</td> 덮개가 있는 <td>두꺼운 벽 모세관</td></tr><tr><td>샌드위치 상자</td><td>Hampton</td><td>HR3-132</td><td></td></tr><tr><td>실리콘화 9웰 유리판</td><td>Hampton</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>좌식 드롭 결정화 플레이트(24 Big Well)</td><td>Mitegen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td></td></tr><tr><td>소듐 듀테로옥사이드 용액, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176788</td><td></td></tr><tr><td>두꺼운 실리콘 서클 커버 슬라이드 (22 mm x 0.96 mm)</td><td>Hampton</td><td>HR3-247</td><td></td></tr><tr><td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &micro; L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>유니버설 피펫 팁, 1 - 100 &마이크로; L</td><td>VWR</td><td>76322-136</td><td></td></tr><tr><td>유니버설 피펫 팁, 100 - 1000 &마이크로; L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>유니버설 피펫 팁, 20 - 200 &마이크로; L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>유니버설 피펫 팁, 1 - 20 &마이크로; L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>왁스 펜</td><td>햄튼</td><td>HR4-342</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

중성자 결정예학은 생물학적 거대 분자 내에서 수소 원자 위치를 측정할 수 있는 구조 기술로, 방사선 손상을 유도하지 는 않지만 프로토네이션 및 수화 상태에 대한 기계적으로 중요한 정보를 산출합니다. 반면 X선 회절은 광 원자의 위치에 대한 제한된 정보만 제공하며 X선 빔은 감광성 보조인 및 금속 센터의 방사선 손상을 빠르게 유도합니다. 여기에 제시된 오크 리지 국립 연구소(ORNL)의 IMAGINE 및 MaNDi 빔라인에 사용되는 워크플로우가 적절한 크기의 단백질 결정이 커지면 중성자 회절 구조를 얻습니다(> 0.1 mm3). 중성자 회절 데이터 수집을 위해 석영 모세혈관에 수소화 단백질 결정의 장착을 시연합니다. 또한 중수소가 있는 교환 가능한 현장에서 수소 원자의 교체를 보장하기 위해 D2O 함유 버퍼를 장착한 결정의 증기 교환 공정도 제시된다. 중수소의 통합은 수소 원자의 일관되지 않은 산란으로 인한 배경을 줄이고 부정적인 일관된 산란 길이로 인한 밀도 취소를 방지합니다. 샘플 정렬 및 실온 데이터 수집 전략은 높은 플럭스 동위원소 반응기(HFIR)에서 IMAGINE에서 준 Laue 데이터 수집을 사용하여 설명됩니다. 또한, 황량한 반응 중간체를 트랩하기 위해 극저온 데이터 수집을 위한 액체 질소의 결정 장착 및 신속한 동결은 스발레이션 중성자 소스(SNS)의 MaNDi 비행 시간 계측기에서 입증된다. 모델 좌표 및 회절 데이터 파일 및 중성자 산란 길이 밀도(SLD) 맵의 시각화준비도 해결됩니다. 중성자 데이터 전용 또는 관심 있는 단백질의 모든 원자 구조를 얻기 위한 관절 X선/중성자 데이터에 대한 구조 개선이 마침내 논의될 것이다. 중성자 구조를 결정하는 과정은 글리코시딕 본드의 산화 분열을 통해 반발성 다당류의 분해에 관여하는 구리 함유 금속 단백질인 리시성 다당류 단산소효소 단산소효소 의 결정으로 입증될 것이다.

중성자 단백질 결정학은 수소 원자의 국소화화를 허용하여 단백질 기능의 중요한 기계학적 세부 사항을 제공하는 구조 기술입니다. 우리는 여기에 단백질 결정, 중성자 회절 데이터 수집, 구조 미세 조정 및 중성자 산란 길이 밀도 지도의 분석을 장착하기위한 워크플로우를 제시한다.

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

중성자 결정학은 생물학적 거대분자에서 수소 원자 위치를 결정하기 위한 구조 기술입니다. 중성자 구조는 양성자화 상태와 물 분자 방향을 밝혀 반응 메커니즘과 결합 상호 작용을 밝힙니다. X선 회절과 달리 중성자 회절은 비파괴 기술이라는 장점이 있습니다.감광성 그룹 또는 금속 센서를 가진 단백질은 방사선 손상 없이 연구할 수 있습니다. 중성자 단백질 결정학을 수행하기 위해 크고 깨지기 쉬운 단백질 결정이 실온 데이터 수집을 위해 석영 모세관에 장착됩니다. 결정 모세관 장착은 일상적으로 수행되지 않으므로 이 기술을 시연하는 것은 유익합니다.결정 수확의 경우, 9웰 대용량 실리콘 유리판에 단백질 결정이 들어 있는 밀봉된 샌드위치 상자를 열고 마이크로피펫을 사용하여 결정화 저장 용액에서 10-20마이크로리터를 유리 슬라이드로 옮깁니다. 현미경으로 결정을 평가합니다. 적절한 크기의 마이크로루프를 사용하여 결정을 수확하고 결정을 저장 용액의 방울에 놓습니다.크리스털 장착의 경우, 직경 2mm, 50mm 길이의 석영 모세관을 사용하여 피펫으로 흡입 reservoir buffer를 취하고 capillary의 한쪽 끝을 reservoir buffer로 채웁니다. 장착 루프를 사용하여 크리스탈을 석영 모세관 내의 저장 버퍼에 부드럽게 놓습니다. 튜브를 두드려 저장소 완충액과 결정을 모세관 아래로 이동하고 길고 얇은 피펫을 사용하여 결정 주변에서 용액을 흡입합니다.얇은 종이 심지를 사용하여 결정을 조심스럽게 건조시키고 모세관 벽을 건조시킨 다음 모세관 끝에 20-50마이크로리터의 중수소화 완충 용액을 추가합니다. 열 봉을 사용하여 밀랍 일부를 녹이고 밀폐 밀봉이 형성될 때까지 녹은 밀랍에 모세관을 부드럽게 삽입합니다. 결정 장착 후 2일, 6일, 10일에 중수소화 완충액을 20-50마이크로리터의 새로운 중수소화 완충액으로 교체하고 시연된 바와 같이 각 증기 교환 후에 새로 녹은 밀랍으로 모세관을 다시 밀봉합니다.최소 2주간의 증기 교환 후 퍼티를 사용하여 석영 모세관을 기기 샘플 스테이지에 고정된 IMAGINE 중성자 회절계 측각계 샘플 스틱에 고정하고 샘플을 내리고 중성자 빔 및 검출기 영역에 붙입니다. Beamline 제어 컴퓨터에서 데이터 수집 프로그램을 열고 설정 탭을 클릭하여 데이터 수집 전략을 설정하고 기기 이름 및 수집할 이미지 이름을 포함한 실험 매개변수를 입력합니다. collect(수집) 탭을 클릭하고 노출 시간 및 수집할 프레임 수를 포함한 데이터 수집 매개변수를 입력합니다.광학 그래픽 사용자 인터페이스 내에서 람다 최소값으로 2.78을 클릭하고 람다 최대값으로 4.5를 클릭하여 데이터 수집의 유사 범위를 설정합니다. 스캔 시작을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 중성자 데이터 수집 후 동일한 온도에서 동일한 결정에 대한 해당 X선 데이터 세트를 수집합니다.극저온 데이터를 수집하기 전에 샌드위치 상자에서 저장 용액을 제거하고 샌드위치 상자에 중수소화 저장 용기 완충 용액을 채우고 일주일 동안 평형을 유지하고 3회 반복합니다. 저장 용액을 3회 더 교환한 후 마이크로루프로 결정을 수확하고 결정을 동결 보호 용액에 2시간 동안 담근 후 극저온 결정 마운트에 부착된 마이크로 루프에 결정을 장착합니다. 장착된 크리스탈과 극저온 마운트를 액체 질소에 넣습니다.결정이 동결되면 cryo stream이 장착된 고분자 중성자 회절계 시료 스테이지에 결정을 장착합니다. 크리스탈이 마운트되어 데이터 수집을 위해 중앙에 배치되었는지 확인하고, 제안서 정보를 입력하고, 폴더 아이콘을 클릭하여 데이터 수집 전략 테이블을 로드한 다음, 제출을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 회절된 중성자는 MaNDi 비행 시간 검출기에 의해 감지되는 대로 실시간으로 볼 수 있게 됩니다.공동 X선 및 중성자 데이터 정제를 위해 먼저 CCP4를 열고 변환을 선택하여 중성자 데이터의 R 자유 데이터 플래그를 X선 데이터의 플래그와 일치하도록 MTZ 확장 프로그램을 수정합니다. 중성자 데이터 반사 파일을 MTZ 형식으로 가져옵니다. 다른 MTZ 파일에서 무료 R 데이터 가져오기를 선택하고 X-ray MTZ 파일을 가져옵니다.일치하는 새 MTZ 파일의 이름을 지정하고 실행을 클릭합니다. 그런 다음 Phoenix 소프트웨어 패키지를 열고 구체화에서 ready set을 클릭합니다. 단백질 좌표 파일을 업로드하고, 없는 경우 모델에 수소를 추가하도록 선택하고, 드롭다운 메뉴에서 교환 가능한 부위에서 HD를 선택하고 다른 곳에서는 H를 선택합니다.Add deuterium to solvent molecules(용매 분자에 중수소 추가)를 선택하고 run(실행)을 클릭하여 시작합니다. 구조 세분화를 위해 세분화 탭에서 피닉스를 엽니다. Refine 프로그램을 사용하여 X-ray 및 Neutron 데이터를 모두 사용하여 미세 조정을 설정합니다.구성 탭에서 해결된 X-ray 구조의 PDB 파일을 입력합니다. 중성자 데이터에서 MTZ 파일을 업로드합니다. MTZ 파일 데이터를 neutron R free에서 중성자 데이터로 할당합니다.X-ray 데이터에서 MTZ 파일을 업로드하고 X-ray 데이터 및 X-ray R free로 할당합니다. 미세 조정 설정에서 표준 미세 조정 전략이 선택되어 있는지 확인하고 사이클 수를 5로 늘립니다. 모든 파라미터, 고급 및 수소를 선택합니다.수소 미세화 모델을 개별으로 변경하고 ADP를 타고 있는 힘을 끈 다음 원자력을 검색합니다. X-HD에서 핵 거리 사용을 선택합니다. 실행을 클릭하여 구체화를 시작합니다.Phoenix에서 모델을 구축하려면 Coot에서 열기를 클릭합니다. Coot에서 X-ray electron density 및 neutron scattering length density 맵을 시각화합니다. 디스플레이 관리자를 선택하고 중성자 2FOFC 중성자 산란 길이 밀도 맵을 삭제합니다.MTZ 열기를 선택하고 MTZ 열기를 선택하고 중성자 데이터 mtz 파일을 엽니다. 진폭 및 위상 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 no_fill_neutron 데이터를 선택하여 채워지지 않은 중성자 산란 길이 밀도 맵을 엽니다. 잔류물에 대한 육안 검사를 수행하여 모델이 데이터에 적합한지 여부를 확인하고 수소-중수소 교환 가능 부위의 차이 밀도 맵 피크를 분석하여 올바른 방향과 점유를 결정합니다.중성자 SLD 맵과 수소 결합 상호 작용에 따라 물 분자의 방향을 변경합니다. 중성자 SLD 맵에 따라 단백질 잔류 수소-중수소 교환 가능 부위의 양성자화 상태와 방향을 조정합니다. 완전한 구조를 얻기 위해 대화식 모델 구축 및 미세 조정을 추가로 수행합니다.수성 완충액에서 성장한 수소화 단백질 결정은 약 1, 000 x 900 미크론을 측정합니다. 결정은 중성자 회절 데이터를 수집하기 전에 3주 동안 중수소 산화물 기반 버퍼와 증기 교환을 위해 석영 모세관에 장착할 수 있습니다. 중성자 회절 데이터는 2.30 옹스트롬 해상도에서 며칠 동안 수집되었으며 동일한 결정에서 X선 회절 데이터 세트가 수집되었습니다.FO의 피크에서 FC 중성자 산란 길이 밀도 맵은 아스파라긴과 같은 잔기의 방향에 대한 귀중한 정보를 제공하고 FO에서 FC 중성자 산란 길이 밀도를 뺀 양의 피크는 히스티딘과 같은 적정성 그룹을 가진 잔기의 양성자화 상태를 결정하는 데 매우 유익합니다. 물 분자에 대한 전자 및 중성자 산란 길이 밀도 맵의 맵 오버레이는 수소 결합 상호 작용이 X선 데이터에서 추론될 수 있지만 중성자는 이러한 수소 결합의 위치에 대한 명확한 정보를 제공한다는 것을 나타냅니다. 중성자 산란 길이 밀도 생략 맵은 수소-중수소 측쇄 작용기 방향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.교환할 수 없는 수소 원자가 탄소에 결합되는 중성자 산란 길이 밀도 맵은 밀도 상쇄로 인해 전자 밀도 맵과 비교할 때 불완전해 보입니다. 따라서 X선 및 중성자 데이터를 모두 사용하여 단백질 골격의 위치를 결정하는 데 사용할 수 있는 샘플의 공동 미세 조정을 수행하는 것이 좋습니다. 중성자 단백질 결정학에는 큰 결정이 필요합니다.크리스탈을 취급하고 장착하는 동안 쉽게 깨질 수 있는 크리스탈이 손상되어 데이터 품질이 저하되지 않도록 주의해야 합니다. 중성자 단백질 결정학은 단백질 반응 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하여 동역학, 돌연변이 유발 또는 분광학으로 그 역할을 추가로 조사할 수 있는 촉매 관련 잔류 물 또는 물 분자를 잠재적으로 밝힐 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

헬름홀츠 젠트럼 베를린의 결정적 단편 스크리닝은 전용 복합 라이브러리, 크리스탈 처리 도구, 빠른 데이터 수집 시설 및 대부분 자동화된 데이터 분석이 있는 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 다운스트림 구조 기반 리간드 설계에 대한 유망한 출발점을 제공하기 위해 이러한 실험의 출력을 극대화할 계획입니다.

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

여기서, 우리는 다이아몬드 광원에서 빔 라인 I23에 진공 엔드 스테이션으로 결정의 극저온 샘플 준비 및 전송을위한 프로토콜을 제시, 긴 파장 대식차 X 선 결정학 실험.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

배우세요 중성자 결정학을 활용한 단백질 내 수소 원자 위치 분석 방법을. 석영 모세관에 결정을 장착하고 데이터를 수집하여 단백질의 양성자화 상태와 물 분자 방향을 밝히는 구조 생물학 기법입니다.

단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

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