항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드 S 시탈 로프 람

이 절차의 전반적인 목표는 구조 연구에 충분히 안정적인 수송체를 생성하고, 이 변형된 수송체를 사용하여 X선 결정학에 의해 고해상도로 굴절되는 결정을 생성하는 것입니다. 이 방법은 중요한 약물 표적인 막 단백질의 구조를 해결하는 방법과 같은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능적 분석을 사용하여 약물 결합 형태에서 선택하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 신경전달물질 수송체에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 높은 친화력으로 작은 분자와 결합하는 수용체, 채널 및 용해성 단백질에도 적용할 수 있습니다. 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM에서 트립슨화된 HEK293S GnTI에서 세포를 일회용 피펫 저장소에서 밀리리터당 50만 개의 세포 밀도로 완전히 재현탁합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 세포를 poly-D-lysine 코팅 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 각 플레이트를 채운 후 피펫 저장소에 세포를 재현탁합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 8%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 형질주입 1시간 전에 세포 배지를 교체합니다.

스크리닝할 cert TC 배경의 각 구조체에 대해 450나노그램의 DNA와 45마이크로리터의 무혈청 DMEM을 혼합하여 DNA transvection 시약 복합체를 준비합니다. 그런 다음 1.6마이크로리터의 트랜스벡션 시약을 45마이크로리터의 무혈청 DMEM에 첨가하고 혼합합니다. 즉시 희석된 형질주입 시약 용액을 DNA 용액에 첨가하고 혼합합니다.

용액을 역순으로 혼합하지 마십시오. 10-15분 정도 기다렸다가 20마이크로리터의 형질주입 시약 DNA 혼합물을 4개의 웰에 추가합니다. 실온에서 5분 동안 200나노몰의 시탈로프람과 25마이크로리터의 TBS로 세포를 배양합니다.

세포를 가용화하기 위해 TBS에 25마이크로리터의 8밀리몰 C12M, 1밀리몰 CHS 및 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가합니다.실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 20 나노몰 트리티화 시탈로프람, 0.1% 소 혈청 알부민 및 태그 친화성 섬광 근접 분석 또는 SPA 비드의 밀리리터당 밀리그램이 포함된 TBS 50마이크로리터를 각 구성에 대한 3개의 웰에 추가합니다.

마지막 웰에 대해 동일한 TBS 용액을 추가하되 100 마이크로몰 세르트랄린을 보충하여 비특이적 결합을 결정합니다. his 태그 친화성 SPA Beads를 96웰 플레이트에 추가할 때 완전히 혼합되었는지 확인합니다. 실온에서 96 웰 섬광 계수기를 사용하여 웰당 1분 계수 시간으로 삼중화 시탈로프람 결합을 측정합니다.

약 36시간 동안 총 계수 정체될 때까지 플레이트를 계속 계수합니다. 측정 후 섭씨 15도의 가열된 뚜껑이 있는 가열 블록에서 33분 동안 플레이트를 가열합니다. 가열 후 트리티화 시탈로프람 결합을 다시 측정합니다.

가열 단계를 수정하여 이 단계를 반복합니다. 타겟 단백질의 겉보기 용융 온도와 가장 안정적인 구조체의 열 안정성에 따라 가열 온도를 조정합니다. 모든 구성물이 특정 개수가 낮아질 때까지 플레이트를 계속 가열합니다.

130RPM의 쉐이커에서 8%의 이산화탄소와 85%의 습도로 섭씨 37도의 현탁액과 2%의 소 태아 혈청이 보충된 293개의 발현 배지에서 GnTI를 뺀 세포를 HEK293S 성장시킵니다. 10리터의 세포를 2의 다중감염과 밀리리터당 300만 개의 세포 밀도로 P2 바이러스에 감염시킵니다. 감염 후 12-16시간 후에 1몰 스톡에서 10밀리몰 농도로 부티레이트나트륨을 첨가합니다.

감염 후에 48 60 시간은, 4, 15 분 동안 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 세포를 추수한다. 상층액을 제거합니다. 150ml의 TBS에서 2마이크로몰 에스시탈로프람 또는 기타 SERT 억제제로 세포를 재현탁합니다.

약 섭씨 30도의 따뜻한 물에서 10리터의 배양에서 세포를 재현탁하고 균질해질 때까지 10밀리리터 피펫을 통해 세포를 빠르게 통과시켜 세포를 재현탁합니다. 교반 막대가 있는 비커에 모든 셀을 추가하고 교반하는 동안 모든 세제 용액을 셀에 추가합니다. 교반으로 섭씨 4도에서 1시간 동안 세포를 용해시킵니다.

8, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 lysate를 회전시키십시오. 상층액을 깨끗한 울트라 원심분리기 튜브에 넣고 펠릿을 버립니다. 그런 다음 초원심분리기에서 1시간 동안 100, 000회 G로 상층액을 회전시킵니다.

초원심분리 후 0.2미크론 필터를 통해 상등액을 여과하고 펠릿을 버립니다. 다음으로, 세척 버퍼에서 평형을 이룬 페리염 펌프를 사용하여 10ml 이상의 연쇄상구균 친화성 수지 패킹을 용해물을 컬럼에 전달합니다. 그런 다음 연쇄상구균 친화성 컬럼을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 연결하고 66ml의 세척 버퍼로 분당 2ml의 속도로 컬럼을 세척합니다.

33ml의 완충액을 사용하여 분당 0.5ml의 속도로 5밀리몰 데스티오비오틴을 보충한 동일한 세척 완충액에서 정제된 단백질을 용리화합니다. 1 밀리리터 분획을 수집합니다. 피크 분율은 약 10밀리리터가 될 것입니다.

수송체 항체 복합체를 형성하려면 먼저 정제된 단백질을 실온에서 하룻밤 동안 트롬빈으로 분해하여 태그를 제거하고 Endo H를 사용하여 탈글리코실화를 수행합니다. 100 킬로달톤 분자량 차단 원심분리기 단백질 농축기를 사용하여 단백질을 밀리리터당 10 밀리그램의 농도와 250 - 300 마이크로리터의 부피로 농축합니다. 농축된 SERT 단백질을 500마이크로리터 미만의 부피에서 1 - 1.2의 몰 비율로 8B6 Fab와 혼합합니다.

20 분 동안 100, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 혼합물을 원심 분리하십시오. 원심분리 후 SERT Fab 복합체를 포함하는 상층액을 수집하고 펠릿을 폐기합니다. 크기 배제 컬럼에서 빠른 단백질 액체 크로마토그래피를 사용하여 복합체를 분리합니다.

분당 0.5밀리리터로 보충된 TBS로 평형을 이룹니다. 결정화하기 전에 100킬로달톤 분자량 컷오프 원심분리기 단백질 농축기를 사용하여 복합체 분리로 인한 피크 분율을 밀리리터당 2mg으로 농축합니다. 280나노미터에서 2AU의 흡광도는 밀리리터당 1밀리그램과 같습니다.

1:0.05 복합체의 비율로 Fab을 추가하여 Fab을 확보합니다. 또한 10마이크로몰이 없는 S 시탈로프람을 첨가합니다. 샘플을 원심분리한 후 SERT Fab 복합체를 포함하는 상등액을 수집하고 펠릿을 폐기합니다.

텍스트 프로토콜의 표 1에 따라 섭씨 4도에서 행잉 드롭 24웰 스크린을 설정합니다. 각 웰에 밀봉제가 도포된 로우 프로파일 24 웰 플레이트에 각 저장 용액의 500마이크로리터를 피펫팅합니다. SERT Fab 복합체의 피펫 1.5, 1.75 및 2마이크로리터를 18mm 실리콘 유리 커버 슬립에 넣습니다.

그런 다음 단백질 샘플 위에 1마이크로리터의 저장 용액을 피펫으로 주입합니다. 단결정은 약 3일 이내에 나타나고 14일 후에 100-175마이크로미터로 성장합니다. 여기에 표시된 것은 트리티화 시탈로프람의 존재 하에서 열 안정성을 스크리닝하기 위한 대표적인 결과입니다.

최대 결합에 대해 표시된 용융 온도 값은 높은 열 안정성과 발현을 가진 돌연변이를 보여줍니다. 여기에는 야생형 SERT TC와 상위 3개 돌연변이인 Y110A, I291A 및 T439S에 대한 열안정성 곡선이 표시되어 있습니다. 이 현미경 이미지는 GnTI에서 세포막에 녹색 형광이 존재하는 SERT CC를 발현하는 세포를 뺀 HEK293S 보여줍니다.

SERT CC의 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피는 15ml에서 주요 피크를 보여줍니다. SDS-PAGE에 의한 분석은 오염 물질이 거의 없는 단일 단백질 종을 보여줍니다. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 수송체 항체 복합체의 대표적인 분리가 표시됩니다.

11.5 밀리리터에서 회피하는 주요 피크는 SDS-PAGE 겔에 표시된 바와 같이 SERT와 Fab을 모두 함유하고 있습니다. 성장 2주 후 S 시탈로프람에 결합된 SERT 항체 복합체의 광학 현미경은 약 100 - 175미크론의 프리즘 모양 결정을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 리간드 결합 확인에서 막 단백질을 안정화하는 돌연변이를 식별하는 방법과 단백질 항체 복합체로 결정화 스크리닝을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 수행하려고 할 때 리간드가 SERT TC의 안정화에 필요하고 SERT CC의 결정화에 필수적이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다.SERT는 많은 항우울제의 분자 표적으로 작용하기 때문에 이 기술의 의미는 정신 질환의 치료로 확장됩니다. 이 절차에 따라 정제된 SERT의 기능은 생화학적 및 생물물리학적 방법을 사용하여 특성화할 수 있습니다.