항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드

본 절차의 전반적인 목표는 구조 연구에 충분히 안정적인 수송체를 생성하고, 이렇게 변형된 수송체를 사용하여 X선 결정학을 통해 고해상도로 회절되는 결정을 만드는 것입니다. 이 방법은 중요한 약물 표적인 막 단백질의 구조를 어떻게 해결할 것인가와 같은 구조 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능 분석을 통해 약물이 결합된 구조를 선택하여 사용할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 신경전달물질 운반체에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 소분자를 높은 친화도로 결합하는 수용체, 채널 및 수용성 단백질에도 적용할 수 있습니다. 트립신 처리된 HEK293S GnTI minus 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM에 0.5 million cells per milliliter 밀도로 일회용 피펫 리저버에서 완전히 재현탁합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 poly-D-lysine이 코팅된 플레이트의 각 웰에 세포 100 microliters를 분주합니다.

각 플레이트를 채운 후, 세포가 균일하게 분포되도록 피펫 리저버에서 세포를 다시 부유시킵니다. 37 °C, 8% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 트랜스펙션 1시간 전에 세포 배지를 교체합니다.

스크리닝 대상인 cert TC 배경의 각 컨스트럭트당 450 nanograms의 DNA를 45 microliters의 무혈청 DMEM과 혼합하여 DNA 트랜스벡션 시약 복합체를 준비합니다. 그다음, 1.6 microliters의 트랜스벡션 시약을 45 microliters의 무혈청 DMEM에 넣고 혼합합니다. 희석된 트랜스벡션 시약 용액을 DNA 용액에 즉시 첨가하고 혼합합니다.

용액을 역순으로 혼합하지 마십시오. 4개의 웰에 20 µL의 transvection 시약 DNA 혼합물을 첨가하기 전에 10~15분 동안 기다립니다. 세포를 200 nM citalopram 및 25 µL TBS와 함께 실온에서 5분 동안 배양합니다.

세포를 가용화하기 위해 8 mM C12M, 1 mM CHS 및 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 TBS 25 µL를 첨가합니다. 세포를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 각 컨스트럭트당 3개의 웰에 20 nM 삼중수소 표지 citalopram, 0.1% 소 혈청 알부민 및 mg/mL의 His-tag 친화성 신틸레이션 근접 분석 또는 SPA Beads가 포함된 TBS 50 µL를 첨가합니다.

마지막 웰에는 동일한 TBS 용액을 첨가하되, 비특이적 결합을 결정하기 위해 100 micromolar sertraline을 보충합니다. his tag 친화성 SPA Beads를 96-웰 플레이트에 첨가할 때 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 96-웰 신틸레이션 카운터를 사용하여 실온에서 웰당 1분간 측정하여 삼중수소 표지 citalopram 결합을 측정합니다.

총 수치가 약 36시간에 도달하여 정체될 때까지 플레이트 계수를 계속합니다. 측정 후, 가열 덮개가 있는 히팅 블록에서 33 °C로 15분 동안 플레이트를 가열합니다. 가열 후 삼중수소 표지 citalopram 결합력을 다시 측정합니다.

가열 단계를 수정하여 이 과정들을 반복하십시오. 표적 단백질의 겉보기 용융 온도와 가장 안정적인 컨스트럭트의 열안정성에 따라 가열 온도를 조절하십시오. 모든 컨스트럭트가 낮은 비방사능 수치를 보일 때까지 플레이트를 계속 가열하십시오.

HEK293S GnTI minus 세포를 2% fetal bovine serum이 첨가된 293 expression media에서 37 °C, 8% carbon dioxide, 85% humidity 조건으로 130 RPM 셰이커를 사용하여 부유 배양합니다. mL당 3백만 개의 세포 밀도에서 감염 다중도(multiplicity of infection) 2로 P2 바이러스를 10 liters의 세포에 감염시킵니다. 감염 12~16시간 후에 1 molar 스톡 용액을 사용하여 sodium butyrate의 농도가 10 millimolar가 되도록 첨가합니다.

감염 후 48~60시간에 4,000 ×g에서 15분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 제거합니다. 2 µM escitalopram 또는 다른 SERT 억제제가 포함된 150 mL TBS에 세포를 재현탁합니다.

약 30 °C의 온수에서 10 리터 배양액의 세포를 수확하고, 균질해질 때까지 10 밀리리터 피펫으로 세포를 빠르게 통과시켜 재부유시킵니다. 교반자가 들어 있는 비커에 모든 세포를 넣고, 교반하면서 모든 세제 용액을 세포에 첨가합니다. 4 °C에서 1시간 동안 교반하며 세포를 가용화합니다.

용해물을 4°C에서 8,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 깨끗한 초원심분리 튜브에 옮겨 담고 펠릿은 폐기합니다. 그다음, 초원심분리기를 사용하여 상층액을 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다.

초원심분리 후, 상층액을 0.2 micron 필터로 여과하고 펠렛은 폐기합니다. 다음으로, 세척 버퍼로 평형화시킨 후 연동 펌프를 사용하여 10 milliliters의 strep affinity resin이 충진된 컬럼에 용해물을 통과시킵니다. 그런 다음 strep affinity 컬럼을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 연결하고, 66 milliliters의 세척 버퍼를 사용하여 분당 2 milliliters의 속도로 컬럼을 세척합니다.

5mM desthiobiotin이 첨가된 동일한 세척 버퍼 33mL를 사용하여 0.5mL/min의 속도로 정제된 단백질을 용출합니다. 1mL씩 분획하여 수집합니다. 피크 분획은 약 10mL가 될 것입니다.

수송체 항체 복합체를 형성하려면, 먼저 정제된 단백질을 thrombin으로 처리하여 태그를 제거하고 Endo H로 탈당쇄화시키기 위해 실온에서 하룻밤 동안 소화시킵니다. 100 kilodalton 분자량 컷오프 원심분리 단백질 농축기를 사용하여 단백질을 10 mg/mL 농도와 250~300 µL 부피로 농축합니다. 농축된 SERT 단백질과 8B6 Fab를 1:1.2 몰비로 혼합하여 최종 부피가 500 µL 미만이 되도록 합니다.

혼합물을 100,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후 SERT Fab 복합체가 포함된 상층액을 수집하고 펠릿은 제거합니다. 크기 배제 컬럼을 이용한 고속 단백질 액체 크로마토그래피로 복합체를 분리합니다.

0.5 mL/min의 속도로 보충된 TBS로 평형화합니다. 결정화 전, 100 kDa 분자량 컷오프 원심분리 단백질 농축기를 사용하여 복합체 분리 단계에서 얻은 피크 분획물을 2 mg/mL로 농축합니다. 280 nm에서의 흡광도 2 AU는 1 mg/mL와 동일합니다.

복합체와 유리 Fab의 비율이 1:0.05가 되도록 Fab를 추가로 첨가합니다. 또한 10 µM의 유리 S-citalopram을 첨가합니다. 샘플을 원심분리한 후, SERT Fab 복합체가 포함된 상층액을 수집하고 펠릿은 폐기합니다.

텍스트 프로토콜의 표 1에 따라 4°C에서 현수적(hanging drop) 24-웰 스크리닝을 준비합니다. 각 웰에 밀봉제를 도포한 로우 프로파일(low profile) 24-웰 플레이트에 각 리저버 용액 500 µL씩을 피펫으로 분주합니다. 18 mm 실리콘화 유리 커버슬립 위에 SERT Fab 복합체 1.5, 1.75 및 2 µL를 피펫으로 분주합니다.

그런 다음 단백질 시료 위에 리저버 용액 1 µL를 피펫으로 분주합니다. 약 3일 이내에 단결정이 나타나며, 14일 후에는 100에서 175 µm까지 성장합니다. 여기에는 삼중수소 표지된 citalopram 존재 하에서 열안정성을 스크리닝한 대표적인 결과가 제시되어 있습니다.

최대 결합력에 대해 도식화한 용융 온도 값은 열안정성과 발현 수준이 높은 변이체들을 보여줍니다. 여기에는 야생형 SERT TC와 상위 3가지 변이체인 Y110A, I291A, T439S의 열안정성 곡선이 표시되어 있습니다. 이 현미경 이미지는 세포막에 녹색 형광이 나타나는, SERT CC를 발현하는 HEK293S GnTI minus 세포를 보여줍니다.

SERT CC의 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 결과 15 milliliters에서 주요 피크가 나타납니다. SDS-PAGE 분석 결과, 오염 물질이 거의 없는 단일 단백질 종이 확인됩니다. 크기 배제 크로마토그래피를 통한 수송체 항체 복합체의 대표적인 분리 양상이 제시되어 있습니다.

SDS-PAGE 젤에서 확인된 바와 같이, 11.5밀리리터에서 용출되는 주요 피크에는 SERT와 Fab가 모두 포함되어 있었습니다. 2주간의 성장 후 S-citalopram에 결합된 SERT 항체 복합체를 광학 현미경으로 관찰하면 약 100에서 175마이크론 크기의 프리즘 모양 결정이 보입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 리간드가 결합된 형태에서 막 단백질을 안정화하는 돌연변이를 식별하는 방법과 단백질 항체 복합체를 이용한 결정화 스크리닝을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 수행할 때 리간드가 SERT TC의 안정화에 필요하며 SERT CC의 결정화에 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. SERT가 많은 항우울제의 분자 표적이므로, 이 기술의 영향은 정신 질환의 치료로 확장됩니다. 이 절차를 마친 후, 정제된 SERT의 기능은 생화학적 및 생물물리학적 방법을 사용하여 특성화할 수 있습니다.