Name: 항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드 S 시탈 로프 람 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 배우세요 인간 세로토닌 전달체의 항온 돌연변이 선별, 정화, 항체 복합체 형성 및 결정화 방법을. 이 기법은 막 단백질 구조 생물학 및 약물 표적 연구에 활용됩니다.

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우리는 단클론 항체를 생성해 준 D. Cawley에게 감사를 표합니다. 도파민 수송체에서 개발된 아이디어와 전문 지식을 공유해 주신 A. Penmatsa와 K. Wang에게 감사드립니다. 그림에 대한 도움을 준 L. Vaskalis, 원고 준비를 도와준 H. Owen, 그리고 도움이 되는 토론을 위해 다른 Gouaux 실험실 구성원들. J.A.C.는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research)의 Banting 박사후 연구원의 지원을 받고 있습니다. E.M.G.는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship의 지원을 받습니다. 우리는 특히 Bernie와 Jennifer LaCroute의 관대한 지원과 NIH(5R37MH070039)의 자금 지원에 감사드립니다. E.G.는 Howard Hughes Medical Institute의 연구원입니다.

<ol><li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li>
<li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solute+carrier+6+family+of+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li>
<li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li>
<li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li>
<li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li>
<li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688(2015).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li>
<li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+membrane+protein+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li>
<li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+%28EGFP%29+in+BALB%2Fc+mice%3A+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li>
<li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability%3A+a+crystallographer%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li>
</ol>

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생물 리 학적 기술에 의해 세포막 단백질 구조의 결정은 많은 심각한 의학적 수송 수용체 및 채널 (11) 발굴 사업 남아있다. 여기에서 우리는 S의 시탈 로프 람 바인딩 인간의 세로토닌 수송 체의 구조 결정을 위해 개발 된 상세한 전문 지식을 공유 할 수 있습니다. 우리는 이러한 방법은 다른 구조적 상태뿐만 아니라 다른 어려운 막 단백질의 구조에 SERT의 구조를 결정하기 유용 할 것으로 기대. 또한, 여기에 설명 된 기술들은 생화학 세제 정제 SERT 및 가까운 천연 지질 환경의 기능을 연구하는데 사용될 수있다. SERT 결정화 여러 도구와 방법의 개발에 힌지. 첫째, 수송 열 안정성 개선은 막 6에서 수송의 추출 다음과 같은 다양한 세제 미셀에 잘 행동했다 SERT의 변종을 생산했다. 둘째, 사용정제 및 결정화에 걸쳐 높은 친 화성 리간드 S의 시탈 로프 람 더욱 향상된 안정성 및 감소 된 구조적 이질성. 셋째, 접종 결정화 양을 용이하게 이주 단기간에 SERT 대량 생산에 허용 BacMam 발현 시스템 (7)의 발전. 마지막으로, 전략의 개발이 결정에 SERT - 항체 복합체의 잘 정렬 된 포장을 촉진 8B6 항체의 발견 허용 3D 에피토프를 인식 높은 친 화성 항체를 선택합니다. 종종 프로토콜에 걸쳐 발생할 중요한 단계 및 시약뿐만 아니라 공통의 문제점이있다. 먼저, 높은 역가 SERT P2 바이러스의 발생이 문제가 될 수있다. 이 프로토콜에 기재된 P2 바이러스를 생성 P1 바이러스의 낮은 농도를 추가하는 것은 일반적으로 이러한 문제를 완화하고, P2 바이러스 역가가 낮은 경우에, P3 바이러스 날기하게 할 수있다0.0001의 MOI에서 g 바이러스. 1 × 10 8 바이러스 입자 미만의 역가와 바이러스 / mL를 사용할 수 없습니다 거의 항상 낮은 단백질 수율가 발생합니다. 표현의 경우, 감염된 HEK293S GnTI은 - 그들은 N 복잡한 N의 -glycans를 합성 할 수 없습니다, 따라서 내가 활동을 -acetylglucosaminyltransferase 및 부족하기 때문에 세포 대신 만 높은 만노스의 N의 -glycans 생산, 선택되었다. EndoH의 절단은 N은 아스파라긴에 부착 된 N의 -acetylglucosamine을 떠나, 세포 외 루프 2 (EL2)의 두 사이트에서 높은 만노스 글리 칸의 글리코 실화를 -linked. N의 소화는 설탕이 결정화 가능성이 중요하다 EL2의 표면 엔트로피를 감소 -linked. 항체의 생성을 위해 상기 IC SERT 예방 접종에 사용되어야한다. GFP 12 고도로 면역 원성이고 완전히 SEC에 의해 제거하는 것이 곤란하기 때문에 항체를 생성하는 융합 태그로서 사용되어서는 안된다. SERT의가요 N- 및 C- 말단은 없었다이들 영역에 대한 항체를 방지하기 위해 구조물에 포함. 마우스는 재구성 된 단백질의 30 μg의와 예방 접종을 할 수있다; 항체의 높은 혈청 농도를 검출 할 수있을 때까지 면역화 된 마우스를 계속 설명 (13) 하이 브리 도마 세포를 생성한다. thermostabilized 구조는 일반적으로 예방 접종을위한 최선의 선택; 반송 장치가 바르게 행동이며, 정제 다음의 생물학적 활성을 유지한다면, 이것은 종종 항체를 발생하기에 충분하다. 8B6 항체는 WT SERT에 대해 제기되었다. 결정화, FSEC 판단으로 단 분산 복합체를 함유 SEC 만 피크 분획을 합치고 농축한다. SERT-8B6 결정은 조건의 좁은 범위에서 성장하고 구체적으로 SERT의 결정 성장과 관련된 문제를 해결하기 위해주의해야 단계가 있습니다. HCl로 조정 트리스 염기의 버퍼가 결정 성장을 지원하지 않기 때문에, 저류 액에 사용되어서는 안된다; 그것은 따라서 CRI입니다광 케이블 (optical) 대신 NaOH로 조정 트리스를 사용합니다. 결정이 성장하지 않거나 많은 작은 결정이 관찰되면, PEG 400 농도도 작은 증감이 의뢰 될 것인지 결정하도록 SERT은 PEG 400의 좁은 농도 범위로 성장한다. 또한, 첨가제 -6- 아미노 헥산 산 또한 핵을 향상시키기 위해 최적화 된 스크린에 사용되었다. 단백질의 감소 비율 : 웰 용액은 결정 성장 인자를 결정하는 핵심이다. 일반적으로 큰 3 차원 결정의 성장을 지원하는 1 : 2에 가까운 드롭 비율로, 권장 1 : 2-1.5의 비율을 삭제합니다. 마지막으로, 낮은 프로파일 24- 웰 플레이트의 사용은 아마도 때문에 증기의 확산 속도 수정을 또한 결정 성장 방향으로 중요하다. 인민 방법으로 다른 방법이 시험 5를 결합하는 필터를 사용하여 코카인 - 결합 된 형태로 래트 세로토닌 전달체를 안정화 변이체 스크리닝하기 위해 개발되었다. 대조적으로, SPA 바SED 분석은 리간드에 결합 남아 SERT의 비율의 결정에 의해 다음과 같은 순서 가열 단계 수 있습니다. 따라서,이 샘플의 소수의 용융 온도의 신속한 측정을 허용한다. 스파 방법은 방사성 표지 높은 친 화성 리간드의 가용성에 의존하고 더 리간드가 submicromolar 선호도와 결합되는 알려져 있지 않은 경우 다음 다른 방법이 필요합니다. 많은 다른 방법이 일반적으로 형광 염료 및 열량 (14)의 결합으로 단백질 안정성을 측정하는 데 사용되어 있지만 낮은 처리량을 직접 측정 기능 또는 단백질을 다량 필요로하거나없는된다. SPA에 법을 사용할 수없는 경우, 하나의 대안 높은 처리량 방법은 샘플을 수송 잔여 분획을 분리 하였다 가열 FSEC 계 열 안정성 분석 15 (FSEC-TS)이다. FSEC-TS는 크로마토 동작 및 올리고머 상태에 액세스하기위한 유용한 방법이며 AP 인인민 방법과 함께 사용할 수 있습니다 owerful 보완적인 도구입니다. 다양한 일반적인 단백질 발현 시스템의 비교도 SERT 식 (16)에 대한 포유 동물 세포의 사용을 선호하는 것으로하고, 당연히이 가능성 포유류 기원의 다양한 단백질에 대한 경우이다. 우리는 표현을 위해 사용한 방법은 SERT에 맞게 조정하지만 가능성이 쉽게 적응할 수있다. 발현의 높은 수준을 선호하는 조건은 신중 나트륨 부티레이트 히스톤 데 아세틸 라제 억제제의 발현 온도 바이러스 농도, 및 현재의 시간 변화에 의해 식별되어야한다. 우리는 일반적으로 이전 바인딩 높은 친 화성 리간드를 유지하기 위해 재구성하는 CHS와 함께 같은 C12M 같은 가벼운 긴 사슬 세제의 선호도 정화를 선호. 소수성 흡수를 사용하여 재구성은 우리가 여러 가지 다른 운송 및 수용체에 대한 효과적인 것으로 나타났습니다 가벼운 기술이다. 이 경우투석, 희석, 또는 SEC에 의해 높은 임계 미셀 농도 세제의 제거 (17)가 항원은 세제 충분히 안정 제공 성공적으로 이용 될 수 없습니다. 더 적합한 항체가 발견되지 않는 경우에, 우리는 거의 항상 문제가 기능 또는 항원의 변성의 손실에 기인하며 이러한 경우 우리가 성공적으로 단백질의 생화학에 특별한주의를 지불하는 새로운 예방 접종을 실시 찾을 수 있습니다. 마지막으로 높은 친화 도로 결합 리간드 및 항체를 합리적으로 계획된 정석 실험을위한 기초를 형성해야하며, 내열성 변형을 이용하여, 하나는 다른 계면 활성제의 성질을 변화시킴으로써 조건의 넓은 범위를 선별 할 수있다. 또한, 지질 메소 18 bicelles 결정화 또는 19을 사용하여 항상 미셀 결정화 대안으로 고려되어야한다. 이러한 원리 및 방법은 약간의 후 변형과 함께 사용될 수있다표현하고 다른 표현 호스트에서 정화, 높은 친 화성 약물의 표적의 구조 결정에 특히 유용하기 어려운 다른 많은 횡단 단백질 양이온.

세로토닌 운반체 (SERT)는 세포막에 걸쳐 1 세로토닌의 수송을 용이하게하는 세포막 단백질이다. SERT 또한 도파민과 노르 에피네프린 수송 (2) 신경 전달 물질 나트륨 Symporters (NSSS)의 가족에 속한다. 세로토닌 SERT 경쟁적 수송층 (3)을 억제하는 작용을 널리 처방 우울 및 항 불안 약물의 분자 표적이다. SERT는 시냅스 틈새에서 신경 전달 물질을 제거하는 나트륨의 에너지 적으로 유리한 cotransport을 이용한다. 세로토닌 시스템의 광범위한 특성은 세로토닌 대사의 변화가 거의 기분, 수면, 통증,인지 등 모든 신경 프로세스에 영향을 미칠 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다, 그리고 침략은 4 행동들. SERT 함수 S의 시탈 로프 람과 같은 항우울제 및 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 (SSRI는)의 사용을 통해뿐만 아니라 psychostimula 의해 변형 될 수있다국세청 및 암페타민과 3,4- 메틸렌 디 옥시 N의 -methylamphetamine 또는 &quot;엑스터시&quot;1, 2 등의 중독의 약물. SSRI는 기분 장애의 치료에 대단히 중요하다, 그러나 자신의 행동에 대한 정확한 구조적으로는 잘 이해되지 않습니다. WT SERT 따라서 SERT 5,6의 3 차원 구조의 진전을 저해 세제 미셀 불안정하다. 최근에는 세제의 넓은 범위에서 견고하게 안정하고 활성 6 바인딩 SSRI 유지 SERT의 변이체를 개발 하였다. 이 내열성 SERT의 변형은 섬광 근접 기반의 열 안정성 분석을 이용하여 선정되었다. 여기에서 우리는 항체 및 S의 시탈 로프 람 복잡한에, SERT을 결합 할 수있는 높은 친 화성 항체의 생성을위한 절차 및 내열성 SERT의 정제 및 결정화에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 SERT 및 8B6 유전자가 성공적인 된 것으로 가정Y는 각각 BacMam 7 및 곤충 발현 벡터에 클로닝. 항체를 생성하려면, cDNA를 코딩하는 잔류 WT SERT의 73-616은 C 말단 연쇄상 구균 II 태그 (SERT IC)와 BacMam 벡터에 클로닝 하였다. 열 안정성 화면 들어 SERT 잔기 C 말단 GFP와 73-616, 패 혈성 II 및 10 그의 태그 (SERT의 TC)를 사용 하였다. 개별 점 돌연변이는 SERT TC 배경에서 발생했다. 결정화 프로토콜의 경우, SERT-GFP 융합 단백질 표면 시스테인 C554A, C580A의 열 안정성 돌연변이, Y110A, I291A, 및 T439S 돌연변이를 들고, 트윈 연쇄상 구균 [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] 10-그의 태그 사용 및 C622A (SERT의 CC). 트롬빈 절단 서열 (LVPRGS)도 N- 제거 및 C 말단을 허용 Q76 및 T618 후 SERT의 CC에 삽입 하였다. 8B6 팹을 코딩하는 플라스미드는 무거운 빛을 모두 표현하기 위해 설계되었다두 개의 별도의 폴리 헤드린 프로모터의 조절하에 GP67 분비 서열과 항체의 사슬. 8B6 항체의 중쇄의 C- 말단 8 His 태그를 태그로하고, 트롬빈 ​​절단 부위는 중쇄 및 태그 사이에 삽입 하였다.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection 시약</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>프리스타일 293 미디어</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 표현 미디어</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> <td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 부티레이트</td><td>시그마</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>S-citalopram</td><td>시그마</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테릴 헤미숙시네이</td>트 <td>시그마</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar</td><td>lipid Avanti polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>소수성 흡수 수지</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>2차 항체로 사용 웨스턴 블로팅</td></tr>: <tr><td>Lauryl maltose, neopentyl glycol</td>, <td>Anatrace</td><td>NG310</td>, <td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin,</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr>, <tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td>, 저자<td>:</td></tr><tr><td>pEG, Bacmam SERT, Strep II</td><td></td><td></td>, <td>SERTIC, 저자:</td></tr><tr><td>pEG, Bacmam, SERT, GFP, twin, Strep, His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, 저자</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, 저자</td></tr><tr><td>Imidazole</td>, <td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-maltoside</td>, <td>Anatrace</td><td>O310</td>, <td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin,</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris는 결정화 저장소</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td>의 준비에 사용됩니다.<td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>포말리아 세포용 폴리머 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>구리 HIS-Tag YSI SPA 비드</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag 친화성 SPA 비드</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, PCR 플레이트용 Thermoblock</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m 주사기 필터</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L 필터 시스템</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L 편평한 조직 배양 플라스크</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L 당황한 조직 배양 플라스크</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin 수지</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep 친화성 수지</td></tr><tr><td>압출기</td><td>북부 지질</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor 이미징 시스템</td><td>Odyssey</td><td></td><td>웨스턴 블롯 이미징 시스템</td></tr><tr><td>XK16 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>컬럼 Strep-Tactin 및 Talon purificaiton에 사용</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO 단백질 농축기</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO 단백질 농축기</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>FSEC</td></tr><tr><td>접선 흐름 장치에</td> 사용 <td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m 필터 접선 플로우 셀</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30kDa MWCO 접선 유동 농축기</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon 수지</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>Fab 정제에 사용되는 His-tag 친화성 수지</td></tr><tr><td>1mL HiTrap SP 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Fab 정제에 사용되는 양이온 교환기</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>SERT-8B6</td></tr><tr><td>24웰 VDXm 플레이트</td>의 SEC 분리에 사용 <td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18mm 커버슬립</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt 바이러스 계수기</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96웰 섬광 카운터</td></tr><tr><td>HiTrap SP 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>시그마</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; s</em&gt; 시탈 로프 람

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

세로토닌 전달체는 세포로 세포 세로토닌 &quot;펌프&quot;는 나트륨과 염소 결합 수송된다. S의 시탈 로프 람은 세로토닌 재 흡수를 차단하는 고 친화력 세로토닌 운반체에 결합함으로써 우울증 및 불안증의 치료에 사용되는 약물이다. 여기에서 우리는 효율적인 절차 및 명시 적, 안정 정화 및 S의 시탈 로프 람과 다른 항우울제에 결합 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 구체화 할 수있는 도구 세트를보고한다. 세로토닌 전달체를 안정화 돌연변이는 결합 분석을 S - 시탈 로프 람을 사용하여 확인 하였다. 배큘로 바이러스 - 형질 감염된 HEK293S GnTI 발현 세로토닌 운반자 - 세포로 재구성 테오 높은 친 화성 항체를 발생하기 위해 사용되었다. 우리는 구조 연구를위한 유용한 항체를 발견하는 전략을 개발했습니다. Sf9 세포에서의 항체 단편의 발현을위한 직접적인 방법은 확립되어있다.이 절차를 사용하여 정제 수송 - 항체 복합체는 잘 행동하고 쉽게 3-4 Å 해상도에 X 선을 회절 S의 시탈 로프 람과 복합체를 생산, 결정화입니다. 여기서 개발 된 전략은 다른 도전 막 단백질의 구조를 결정하는데 이용 될 수있다.

SERT TC 배경에 하나의 점 돌연변이의 라이브러리는 돌연변이를 thermostabilizing위한 화면으로 만들어졌습니다. 각각의 돌연변이 체는 표준 돌연변이 유발을 이용하여 생성 하였다. 그림 1A에 설명 된대로 선별 프로토콜은 일시적으로 빠르게 정체성 결정에 유용한 돌연변이에 감염된 HEK293S 세포와 섬광 근접 기반의 열 안정성 화면을 형질 사용한다. 플로팅 Tm은 값을 바운드 [3 H] RT에서 시탈 로프 람은 높은 열 안정성과 표현 수준에 적합한에게와 구조를 보여준다 대 단백질 정제 용 (그림 1B). 세 돌연변이 (Y110A, I291A 및 T439S)은 매우 안정한 구조체 (도 1C)를 생성하기 위해 결합시켰다. 내열성도 SERT 팹 복합체의 결정화에 필요한 단쇄 세제 증가 된 안정성과 관련된다. 배큘-TR을 사용하여 SERT 인간의 대규모 발현ansduced 감염된 HEK293S GnTI는 - 세포는 2 주 미만 걸릴 수 있으며,도 2a에 도시 된 바와 같이, 밀리그램 양을 생산할 수있다. GFP의-태그 SERT의 CC 단백질의 사용은 SERT 편리 형광 (그림 2B)에 의해 발현 및 정제하는 동안 다음에 할 수 있습니다. ; 안정화 지질 등 CHS의 존재 C12M 셀 - 우리의 정제 전략은 1) 감염된 HEK293S GnTI에서 S의 시탈 로프 람에 결합 SERT의 가용화를 포함 2) 연쇄상 구균 친 화성 기질에 SERT의 결합; 광범위한 세정하여 오염 단백질 3) 제거; 4) 버퍼 포함 desthiobiotin (그림 2C)와 기능 SERT의 용출. FSEC (그림 2D, E)에 의해 판단으로 용출 된 단백질은 크게 쿠마 블루 염색에 의해 다른 검출 가능한 단백질의 자유 단 분산이다. 유사한 전략 reconstitutio에 사용 된 연쇄상 구균 II 태그 SERT를 정화 찍은n 및 예방 접종 (그림 3A, B). 테오으로 SERT의 설립은 SERT의 혈청 반감기과 안정성을 향상 높은 친 화성 항체의 분리 가능성을 향상시킨다. 또한, 지질 A의 포함은 세균 세포벽의 성분은 유력한 보조제 구로서 기능한다. 다중 층 리포좀 유리 튜브에 건조 된 지질의 혼합물에 완충액을 첨가하여 제조하고, 완충액에 재현 탁 하였다. 200 nm의 공극 크기의 필터를 통해 리포좀 압출 단 분산 단층 라멜라 리포좀 현탁액을 생성한다. 리포좀이어서 세제 정제 SERT 첨가 한 후 세제로 포화된다. 세제 액 : 마지막으로, 세제 지질 소수성 흡착 수지의 첨가에 의해 제거된다. 추가 리간드는 항우울제 결합 된 형태를 인식하는 항체를 선택하기 위해 재구성 된 샘플에 추가해야합니다. 테오 SERT에서의 존재가 확인되어야SDS-PAGE 로딩 염료 또는 C12M와 작은 샘플을 용해 및 SDS-PAGE 및 FSEC (그림 3C, D)에서 실행. SERT 항체를 발현하는 하이 브리 도마 세포주는 3D 에피토프를 인식 고친 화성 바인더에 대해 스크리닝 할 수있다. 항체가 완전히 균일 한, 잘 정렬 된 도메인의 크리스탈 포장을 촉진하기 위해 구조화 된 영역에 결합되어 있어야 이러한 특성은 결정의 궁극적 인 성공에 매우 중요하다. 첫 번째 단계에서는, 비 구조화 영역을 인식하는 항체가 식별된다. SERT 변성하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏; 변성 SERT을 결합하는 항체는 서쪽 긍정적 가능성 선형 에피토프를 인식합니다. 도 4a에서, 우리는 서부 양성 및 crystallogenesis을 촉진 할 가능성이 유용하지 않습니다 항체의 2 예를 보여줍니다. 도 4b에서, 나머지 웨스턴 음성 항체가 100 nM의 SERT-GFP와 인큐베이션에 의해 구분FSEC. SERT가 이전 위치로 GFP 양성 피크를 이동합니다 결합하는 항체. SERT - 항체 복합체가 FSEC에 의해 분석 한 다음 나노 몰 친화력으로 결합 할 수 있는지 확인하기 위해 추가로 세제를 희석 할 수있다. 구조적 운반체 변화하므로 항체 세로토닌 결과의 첨가가 특히 SSRI 바인딩 형태를 인식 할 수 있는지 확인 rescreened 수있다. 도 4C에서, 상기 항체는 항원 (S)이 결합 된 상태로 기판에 SSRI로 변경하지 않는 것이 도시 세로토닌의 존재 SERT 바인딩 나타낸다. 마지막으로,도 4d에 항체의 조합은 상기 좌측 시프트의 결과로, 고유의 에피토프에 결합하는 능력에 대해 시험한다. 다음은 15B8 또는 8A11 항체 8B6 다른 에피토프를 인식하고 있습니다. 8B6 항체를 파파인 누와 예비 결정 심사에 따라 추가 구조 분석을 위해 선택되었다테드 팹. 8B6 팹의 유전자를 곤충 세포 발현 벡터에 클로닝 하였다. 팹 표현 및 정지에서 성장 Sf9 세포에서 분비 될 수있다. 8B6 팹은 그의 태그 친 화성 (그림 5A, B) 및 SDS-PAGE 젤에 오염 물질이 나타납니다 단백질의 결과 양이온 교환 크로마토 그래피 (그림 5C, D)에 의해 인 Sf9 세포 상층 액에서 정제 할 수있다. 도 5E에서, 재조합 8B6 팹은 SERT 바인딩 도시되고 후속 생화학 및 생물 물리학 실험에 사용된다. 친화도 정제 SERT의 CC는 트롬빈과 EndoH로 분해 및 S의 시탈 로프 람의 존재 복합체를 형성 8B6 팹와 혼합된다. 운반체 - 항체 복합체는 C8M (도 6A)에 SEC에 의해 분리하고 SDS-PAGE (도 6b)로 도시 된 바와 같이 피크 분획 SERT 팹을 모두 포함한다. C8M의 사용은 결정 형성 아마 때문에 매우 중요하다단쇄 세제는 결정 격자에서 분자간 잘 포장 할 수있다. FSEC 결정화를위한 풀링되어야하는 분획을 확인하기 위해 사용된다 (도 6c); 단 분산되지 않고 / 또는 자유 SERT 또는 팹의 많은 양을 함유하는 분획을 결합되어서는 안된다. 프리즘 형상 SERT 항체 결정 드롭 증기 확산 (도 7A)를 매달아이 프로토콜을 이용하여 S의 시탈 로프 람의 존재 하에서 성장시킬 수있다. 생성 된 결정을 3.15 10 (도 7b)의 해상도에 X 선을 회절. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> 그림 1 :. 섬광 열 안정성 분석을 근접 기반. [3 H] 시탈 로프 람. B의 존재 내열성 스크리닝 프로토콜의 개요. 최대 바인딩 [3 </겉보기 융점 (Tm)이 대 SUP&gt; H] 시탈 로프 람. 점선은 WT 수송에 대한 값을 나타냅니다. 3 가장 내열성 돌연변이가 표시되어 있습니다. 회색 영역은 낮아 신호대. WT C에 따라서 Tm은 부정확 한 값에 대하여 결합 [3 H] 시탈 로프 람의 10 % 미만이 돌연변이 체를 나타낸다. WT SERT TC 및 상위 3 돌연변이에 대한 열 안정성 곡선. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> 그림 2 :. 포유 동물 이종 단백질 식 (A)의 개요. 감염된 HEK293S GnTI에서 BacMam 바이러스 발생 및 SERT의 표현의 도식화 개요 -. 세포 B. 그K293S GnTI -. SERT의 CC (GFP의 형광) C를 발현하는 세포. 패 혈성 친 화성 수지에 SERT의 CC의 용출 프로파일. 100 % (0 - - 5 mM)을 D. 녹색 추적 desthiobiotin의 농도, 0을 나타냅니다. 15 % SDS-PAGE 젤 E -. 4에 친 화성 정제 SERT의 CC의 분석. GFP의 형광 검출 친 화성 정제 SERT의 CC의 FSEC (여진 : 480 nm의, 방출 : 510 ㎚). 15 mL의에서 용출 피크는 SERT (#)이며, 18 mL의 무료 GFP (*)입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> 그림 3 :. SERT IC (A)의 대표 선호도 정화와에서 재구성. 항체 생성의 도식 개요. &lt;강한&gt; B. 용출 프로파일은 패 혈성 친 화성 수지에 SERT IC의 친화력 정화의 280 nm에서 관찰했다. 100 %. (0 - - 5 mM)을 C 녹색 추적 desthiobiotin의 농도, 0을 나타냅니다. 친화도 분석 정제와 4 SERT를 재구성 - 15 % SDS-PAGE 겔 D.. 재구성 다음 가용화 SERT의 FSEC. 트립토판 잔기의 형광 SERT (: 280 nm의, 방출 : 여진 335 nm의)를 감지하는 데 사용되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> 그림 4 :. 대표 SERT 항체 분석를했다. 웨스턴 블롯에 의한 항체 검사. 약 1 μg의 GFP 유무에 관계없이 SERT의 CC의는 4인가 - 15 % SDS-PAGE 겔 및 니트로 셀룰로오스 막 상에 블 롯팅. 바인딩은 IR 염료에 접합 된 염소 항 - 마우스 항체를 사용하여 검출 하였다. 2G4 및 10F2 서부 긍정적. B입니다. FSEC 100 나노 GFP - 태그 SERT 및 검출에 대한 항체의 결합 GFP의 형광을 이용하여 검출. C를. 1 mM의 세로토닌. D의 존재에서 100 나노 미터 GFP - 태그 SERT에 선정 된 Fab의 결합. 8A11 또는 15B8 팹의 바인딩 르트-8B6하는 팹을. 18 mL의에서 용출 작은 피크가 무료 GFP입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> 그림 5 : Sf9 세포에서 8B6 팹의 대표적인 정제를했다.. 용출 프로파일은 그의 태그 친 화성 chromatograp하여 8B6 팹의 정제의 280 nm에서 관찰<html> HY. 50 % (0 - - 250 밀리미터) B. 녹색 추적은 이미 다졸의 농도, 0을 나타냅니다. 비 감소 및 그의 태그 친 화성 정제 한 후 SDS-PAGE 젤을 줄일 수있다. 50 kDa의 단백질 근처 실행 비 환원 팹 (#)와 kDa의 팹 (*). C를 감소 부 25 종이다. 용출 프로파일은 선형 염화나트륨 구배 용출 하에서 단일 대칭 피크를 표시 양이온 교환하여 8B6 팹의 정제의 280 nm에서 관찰했다. 100 %. (0 - - 500 밀리미터) D 녹색 추적 염화나트륨의 농도, 0을 나타냅니다. 양이온 교환. E 그래피 다음 12.5 % SDS-PAGE 겔상의 8B6 된 Fab의 분석. GFP의 형광을 이용하여 검출, 10 나노 GFP - 태그 SERT에 8B6 팹의 결합. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 전자 6 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6 :. 임재 S의 시탈 로프 람 A의 SERT-8B6 단지의 대표 젤 여과 크로마토 그래피. 정제 SERT-8B6 단지의 젤 여과 용출 프로파일. 11.5 용액에 용출 주 피크는 SERT-8B6의 복잡합니다. 15에서 피크 -. 17 mL를 GFP 및 팹 B가 포함되어 있습니다. 15 % SDS-PAGE 젤 - 4에 정제 된 SERT-8B6 복합체의 분석. SERT 및 팹의 중쇄 및 경쇄의 위치는 대시. C에 의해 도시된다. 크기 구분 분수의 FSEC. SERT-8B6 단지는 트립토판 형광을 사용하여 검출 하였다. 분수 (17)는 팹으로 복잡하지 않았다 SERT의 더 큰 금액이 포함되어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot;/&gt; 그림 7 :. S 시탈 로프 람 (A)에 바운드 SERT-8B6 단지의 결정화. 성장 2 주 후 SERT-8B6 단지의 평행 모양의 결정의 광학 현미경. 스케일 바는 200 μm의. B와 동일합니다. SERT-8B6 결정은 3.15 Å으로 X 선을 회절. 블루 링은 3.15 Å를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 1 :. S의 시탈 로프 람에 바인딩 SERT-8B6 단지에 대한 결정화 화면 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

본 절차의 전반적인 목표는 구조 연구에 충분히 안정적인 수송체를 생성하고, 이렇게 변형된 수송체를 사용하여 X선 결정학을 통해 고해상도로 회절되는 결정을 만드는 것입니다. 이 방법은 중요한 약물 표적인 막 단백질의 구조를 어떻게 해결할 것인가와 같은 구조 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기능 분석을 통해 약물이 결합된 구조를 선택하여 사용할 수 있다는 점입니다.이 방법은 신경전달물질 운반체에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 소분자를 높은 친화도로 결합하는 수용체, 채널 및 수용성 단백질에도 적용할 수 있습니다. 트립신 처리된 HEK293S GnTI minus 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM에 0.5 million cells per milliliter 밀도로 일회용 피펫 리저버에서 완전히 재현탁합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 poly-D-lysine이 코팅된 플레이트의 각 웰에 세포 100 microliters를 분주합니다.각 플레이트를 채운 후, 세포가 균일하게 분포되도록 피펫 리저버에서 세포를 다시 부유시킵니다. 37 °C, 8% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 트랜스펙션 1시간 전에 세포 배지를 교체합니다.스크리닝 대상인 cert TC 배경의 각 컨스트럭트당 450 nanograms의 DNA를 45 microliters의 무혈청 DMEM과 혼합하여 DNA 트랜스벡션 시약 복합체를 준비합니다. 그다음, 1.6 microliters의 트랜스벡션 시약을 45 microliters의 무혈청 DMEM에 넣고 혼합합니다. 희석된 트랜스벡션 시약 용액을 DNA 용액에 즉시 첨가하고 혼합합니다.용액을 역순으로 혼합하지 마십시오. 4개의 웰에 20 µL의 transvection 시약 DNA 혼합물을 첨가하기 전에 10~15분 동안 기다립니다. 세포를 200 nM citalopram 및 25 µL TBS와 함께 실온에서 5분 동안 배양합니다.세포를 가용화하기 위해 8 mM C12M, 1 mM CHS 및 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 TBS 25 µL를 첨가합니다. 세포를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 각 컨스트럭트당 3개의 웰에 20 nM 삼중수소 표지 citalopram, 0.1% 소 혈청 알부민 및 mg/mL의 His-tag 친화성 신틸레이션 근접 분석 또는 SPA Beads가 포함된 TBS 50 µL를 첨가합니다.마지막 웰에는 동일한 TBS 용액을 첨가하되, 비특이적 결합을 결정하기 위해 100 micromolar sertraline을 보충합니다. his tag 친화성 SPA Beads를 96-웰 플레이트에 첨가할 때 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 96-웰 신틸레이션 카운터를 사용하여 실온에서 웰당 1분간 측정하여 삼중수소 표지 citalopram 결합을 측정합니다.총 수치가 약 36시간에 도달하여 정체될 때까지 플레이트 계수를 계속합니다. 측정 후, 가열 덮개가 있는 히팅 블록에서 33 °C로 15분 동안 플레이트를 가열합니다. 가열 후 삼중수소 표지 citalopram 결합력을 다시 측정합니다.가열 단계를 수정하여 이 과정들을 반복하십시오. 표적 단백질의 겉보기 용융 온도와 가장 안정적인 컨스트럭트의 열안정성에 따라 가열 온도를 조절하십시오. 모든 컨스트럭트가 낮은 비방사능 수치를 보일 때까지 플레이트를 계속 가열하십시오.HEK293S GnTI minus 세포를 2% fetal bovine serum이 첨가된 293 expression media에서 37 °C, 8% carbon dioxide, 85% humidity 조건으로 130 RPM 셰이커를 사용하여 부유 배양합니다. mL당 3백만 개의 세포 밀도에서 감염 다중도(multiplicity of infection) 2로 P2 바이러스를 10 liters의 세포에 감염시킵니다. 감염 12~16시간 후에 1 molar 스톡 용액을 사용하여 sodium butyrate의 농도가 10 millimolar가 되도록 첨가합니다.감염 후 48~60시간에 4,000 ×g에서 15분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 제거합니다. 2 µM escitalopram 또는 다른 SERT 억제제가 포함된 150 mL TBS에 세포를 재현탁합니다.약 30 °C의 온수에서 10 리터 배양액의 세포를 수확하고, 균질해질 때까지 10 밀리리터 피펫으로 세포를 빠르게 통과시켜 재부유시킵니다. 교반자가 들어 있는 비커에 모든 세포를 넣고, 교반하면서 모든 세제 용액을 세포에 첨가합니다. 4 °C에서 1시간 동안 교반하며 세포를 가용화합니다.용해물을 4°C에서 8,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 깨끗한 초원심분리 튜브에 옮겨 담고 펠릿은 폐기합니다. 그다음, 초원심분리기를 사용하여 상층액을 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다.초원심분리 후, 상층액을 0.2 micron 필터로 여과하고 펠렛은 폐기합니다. 다음으로, 세척 버퍼로 평형화시킨 후 연동 펌프를 사용하여 10 milliliters의 strep affinity resin이 충진된 컬럼에 용해물을 통과시킵니다. 그런 다음 strep affinity 컬럼을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 연결하고, 66 milliliters의 세척 버퍼를 사용하여 분당 2 milliliters의 속도로 컬럼을 세척합니다.5mM desthiobiotin이 첨가된 동일한 세척 버퍼 33mL를 사용하여 0.5mL/min의 속도로 정제된 단백질을 용출합니다. 1mL씩 분획하여 수집합니다. 피크 분획은 약 10mL가 될 것입니다.수송체 항체 복합체를 형성하려면, 먼저 정제된 단백질을 thrombin으로 처리하여 태그를 제거하고 Endo H로 탈당쇄화시키기 위해 실온에서 하룻밤 동안 소화시킵니다. 100 kilodalton 분자량 컷오프 원심분리 단백질 농축기를 사용하여 단백질을 10 mg/mL 농도와 250~300 µL 부피로 농축합니다. 농축된 SERT 단백질과 8B6 Fab를 1:1.2 몰비로 혼합하여 최종 부피가 500 µL 미만이 되도록 합니다.혼합물을 100,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후 SERT Fab 복합체가 포함된 상층액을 수집하고 펠릿은 제거합니다. 크기 배제 컬럼을 이용한 고속 단백질 액체 크로마토그래피로 복합체를 분리합니다.0.5 mL/min의 속도로 보충된 TBS로 평형화합니다. 결정화 전, 100 kDa 분자량 컷오프 원심분리 단백질 농축기를 사용하여 복합체 분리 단계에서 얻은 피크 분획물을 2 mg/mL로 농축합니다. 280 nm에서의 흡광도 2 AU는 1 mg/mL와 동일합니다.복합체와 유리 Fab의 비율이 1:0.05가 되도록 Fab를 추가로 첨가합니다. 또한 10 µM의 유리 S-citalopram을 첨가합니다. 샘플을 원심분리한 후, SERT Fab 복합체가 포함된 상층액을 수집하고 펠릿은 폐기합니다.텍스트 프로토콜의 표 1에 따라 4°C에서 현수적(hanging drop) 24-웰 스크리닝을 준비합니다. 각 웰에 밀봉제를 도포한 로우 프로파일(low profile) 24-웰 플레이트에 각 리저버 용액 500 µL씩을 피펫으로 분주합니다. 18 mm 실리콘화 유리 커버슬립 위에 SERT Fab 복합체 1.5, 1.75 및 2 µL를 피펫으로 분주합니다.그런 다음 단백질 시료 위에 리저버 용액 1 µL를 피펫으로 분주합니다. 약 3일 이내에 단결정이 나타나며, 14일 후에는 100에서 175 µm까지 성장합니다. 여기에는 삼중수소 표지된 citalopram 존재 하에서 열안정성을 스크리닝한 대표적인 결과가 제시되어 있습니다.최대 결합력에 대해 도식화한 용융 온도 값은 열안정성과 발현 수준이 높은 변이체들을 보여줍니다. 여기에는 야생형 SERT TC와 상위 3가지 변이체인 Y110A, I291A, T439S의 열안정성 곡선이 표시되어 있습니다. 이 현미경 이미지는 세포막에 녹색 형광이 나타나는, SERT CC를 발현하는 HEK293S GnTI minus 세포를 보여줍니다.SERT CC의 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 결과 15 milliliters에서 주요 피크가 나타납니다. SDS-PAGE 분석 결과, 오염 물질이 거의 없는 단일 단백질 종이 확인됩니다. 크기 배제 크로마토그래피를 통한 수송체 항체 복합체의 대표적인 분리 양상이 제시되어 있습니다.SDS-PAGE 젤에서 확인된 바와 같이, 11.5밀리리터에서 용출되는 주요 피크에는 SERT와 Fab가 모두 포함되어 있었습니다. 2주간의 성장 후 S-citalopram에 결합된 SERT 항체 복합체를 광학 현미경으로 관찰하면 약 100에서 175마이크론 크기의 프리즘 모양 결정이 보입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 리간드가 결합된 형태에서 막 단백질을 안정화하는 돌연변이를 식별하는 방법과 단백질 항체 복합체를 이용한 결정화 스크리닝을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때 리간드가 SERT TC의 안정화에 필요하며 SERT CC의 결정화에 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. SERT가 많은 항우울제의 분자 표적이므로, 이 기술의 영향은 정신 질환의 치료로 확장됩니다. 이 절차를 마친 후, 정제된 SERT의 기능은 생화학적 및 생물물리학적 방법을 사용하여 특성화할 수 있습니다.

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이종 발현 및 낭포 성 섬유증 막 관통 전도 조정기 (CFTR)의 정제는 중요한 과제이며, 낭성 섬유증을위한 약물 요법의 개발에 제한 요소. 이 프로토콜은 구조와 기능 연구에 적합 CFTR의 밀리그램 수량의 분리를위한 두 가지 방법을 설명합니다.

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜   콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.

인간의 과발현과 정제 시스 - 프레 닐 트랜스퍼 라제 대장균

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

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표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

이 문서는 살모넬라 타이피무륨 트립토판 synthase의 발현 및 정화를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 이 프로토콜은 하루에 단백질 복합체를 정화하는 신속한 시스템이다. 커버되는 방법은 현장 지향 돌연변이 발생, 대장균의단백질 발현, 친화 성염색로그래피, 젤 여과 크로마토그래피 및 결정화입니다.

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배우세요 인간 세로토닌 전달체의 항온 돌연변이 선별, 정화, 항체 복합체 형성 및 결정화 방법을. 이 기법은 막 단백질 구조 생물학 및 약물 표적 연구에 활용됩니다.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드

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