Name: 자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 배우세요 자기 적고 기술을 이용한 혈액 세포 밀도 분석 및 항원 검출 방법입니다. 이 기술은 최소 침습으로 적혈구의 Rh 인자를 빠르게 식별하여 빈혈과 패혈증 등의 질병 진단에 활용됩니다.

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저자는 세포 외 소포 작업에 대한 그의 도움에 대한 박사 Getulio 페레이라에게 감사드립니다.
이 작품은 ICG에 다음과 같은 국립 보건 원에 의해 지원되었다: RO1CA218500, UG3HL147353, UG3TR002881.

이 연구에서 사용된 실험 프로토콜은 베스 이스라엘 Deaconess 의료 센터 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.
1. 악기 설정
참고: 이미징 부양 세포는 자기장을 생성하기 위해 서로 마주보고 동일한 극으로 배치하기 위해 z 축에 자화 된 두 개의 희토류 네오디뮴 자석이 필요합니다. 자석 사이의 거리는 자기장의 강도와 대상의 밀도에 따라 사용자 정의 할 수 있습니다. 이 경우 자석은 50mm 길이의 1x1 mm 제곱 유리 모세관 튜브를 삽입하기에 충분한 1mm 공간으로 분리됩니다. 이 장치는 요청 시 사용할 수 있는 AutoCAD 설계를 사용하여 3D 인쇄되었습니다.
<ol><li>현미경을 측면에 완벽하게 수평으로 놓습니다. 참고: 표준 직립 위치에 배치된 현미경은 응축기 및 목표에 대하여 자석의 위치 때문에 응고물 객체를 화상 진찰에 직접 적당하지 않습니다. 이러한 제한은 현미경을 측면에 배치하여 우회할 수 있으며, 완벽하게 수평으로 응축기가 모세관에 빛을 집중할 수 있게 하고, 객관적인 렌즈는 Köhler 조명 요구 사항을 유지하면서 자석 사이에 부풀어 올리는 세포를 이미지화할 수 있습니다.</li>
	<li>2~3개의 랩 잭을 사용하여 브레드보드 테이블에서 스탠드를 지원하고 레벨.</li>
	<li>진동을 제한하려면 고무 가미 된 발로 브레드 보드 테이블을 지원합니다.</li>
	<li>스테이지를 제거하고 부양장치(y축)의높이를 조정하기 위한 컴팩트한 랩 잭과 2개의 단일 축 번역 단계로 교체한다. 초점(z축)을조정하기 위한 것, 그리고 두 번째는 모세관 튜브를 스캔한다.</li>
	<li>두 개의 미니 시리즈 광학 포스트를 사용하여 자기 부상 장치를 실험실 잭에 부착합니다.</li>
</ol>2. 카복시 미세 입자 / 구슬에 항체의 결합 (폴리안에 의해 프로토콜에서 수정)
참고: 저밀도 구슬(1.05g/mL)만 Rh(+) 검출을 위해 코팅해야 하지만, 세포외 소포를 검출하기 위해 고밀도 및 저밀도 구슬을 코팅합니다.
<ol><li>비드 서스펜션의 1 mg 상당을 꺼내 서 활성화 버퍼의 0.5 mL에 추가 (50 mM MES (MW195.2, 9.72 mg 에 1 mL)) pH 5.0 및 0.001% 폴리소르 바테-20).</li>
	<li>갓 만든 1.5 M EDC (MW 191.7, 0.28755 g 1 mL)와 얼음 차가운 물에 0.3 M Sulfo-NHS (MW 217.14, 0.0651 g)의 12 μL을 추가하십시오.</li>
	<li>궤도 셰이커에 튜브를 놓고 실온에서 1 시간 동안 격렬하게 흔들어 구슬에 카복실 그룹을 활성화하십시오.</li>
	<li>결합 버퍼의 0.5 mL (10x PBS, 또는 0.1 M 인산염 pH 7-9)를 추가하여 1 시간 후에 활성화를 중지합니다.</li>
	<li>10분 동안 20,000 x g에서 원심분리하여 구슬을 펠렛하거나, 구슬을 펠렛할 수 없는 경우 0.45 μm 원심분리기 튜브 필터를 사용합니다. 슈퍼나플로루를 흡인한다.</li>
	<li>비드를 10x PBS 1mL로 3배, 2.5단계로 씻어낸다.</li>
	<li>mg 구슬 당 항체의 25 μg를 계산하고 10X PBS에서 0.7-1.0 mg/mL 최종 항체 농도로 활성화된 구슬과 원하는 항체를 혼합합니다.</li>
	<li>튜브를 저속으로 설정된 튜브 로커에 놓습니다. 커플링을 위해 밤새 실온에서 튜브를 부드럽게 굴려보십시오.</li>
	<li>2.5단계를 반복하고 10x PBS의 1mL로 구슬을 두 번 씻으세요.</li>
	<li>완충 pH 8.0에서 0.5mL(98% 재고 = 16.2M)로 세척하여 실온에서 1시간 동안 1h로 부드럽게 흔들어 주세요.</li>
	<li>2.5단계를 반복하고 DPBS 의 1mL에서 한 번 구슬을 씻으세요. 구슬은 필요할 때까지 4°C에서 DPBS의 200 μL에 보관할 수 있습니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Rh (+) 검출을 위한 혈액 의 수집 및 준비
<ol><li>한 번의 클릭 으로 랜싱 장치를 사용하여 Rh (+) 기증자의 손가락을 찌르고 10 μL의 혈액을 DPBS 1 mL로 수집합니다.</li>
	<li>형광 혈장 막 얼룩을 가진 Rh+ 세포를 얼룩. 선택적으로, Rh+ 세포의 1mL 현탁액에 형광 염료 1μL을 추가합니다(1:1000 희석).</li>
	<li>15 분 동안 37 °C에서 형광 염료로 세포를 배양합니다.</li>
	<li>15s용 5,600 x g에서 회전하여 세포를 펠렛하고 DPBS 1mL을 사용하여 3번 세척합니다. 칼슘과 마그네슘 (HBSS ++)과 HBSS의 1 mL에서 다시 중단.</li>
	<li>원클릭 랜싱 장치를 사용하여 Rh(-) 기증자의 손가락을 찌르고 2 μL의 혈액을 수집합니다. 참고: 2개 이상의 조건을 준비하는 경우, 각 튜브에 1 μL의 혈액을 추가하기에 충분한 혈액을 모으십시오.</li>
	<li>필요한 실험 튜브를 준비하십시오 : 구슬 혼자, IgG 제어, 샘플.<ol>
<li>비드만: HBSS++의 174 μL, IgG 제어 구슬 1μL, 고밀도 구슬 1μL(1.2g/mL), 500m MD 3+(60mMMM)의 24μL을 추가합니다.</li>
		<li>IgG 제어: HBSS++의 172 μL, IgG 대조구 1μL, 고밀도 구슬 1μL, Rh-혈액 1 μL, 스테인드 Rh+ 혈액 현탁액 1μL, 500mM Gd3+의24 μL을 추가합니다.</li>
		<li>샘플 튜브는 HBSS++의 172 μL, 항 RhD 코팅 구슬 1μL, 고밀도 구슬 1μL, Rh-혈액 1μL, 스테인드 Rh(+) 혈액 현탁액 1μL, 500m Gd3+의24 μL을 추가합니다. 참고: 고밀도 구슬을 참조하기 위해 Rh 샘플에 추가됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 분리 데모를 위한 PMN 격리
<ol><li>호중구의 고립<ol>
<li>40mL의 정맥혈액을 구연산 나트륨 6mL(0.15M, pH 5.5) 및 6%의 Dextran-70의 14mL을 포함하는 60mL 주사기에 그립니다.</li>
		<li>퇴적물까지 50분 기다립니다.</li>
		<li>피콜-파크 20mL 위에 버피 코트 세포를 천천히 겹쳐서 혈액 수집 튜브를 통해 50mL 튜브를 밀어 퇴적한 RPC로 오염을 피하십시오. 원래 혈액 수집 튜브에 남은 잔류 RBC로 오염을 최소화하기 위해 신선한 혈액 수집 세트를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>3,000 x g에서20 분 동안 원심 분리에 의해 버피 코트 세포를 펠렛. 호중구와 오염 RBC는 튜브의 바닥에 펠릿 것입니다. PBMC는 피콜-파크 위에 흰색 레이어를 형성합니다.</li>
		<li>호중구를 새로운 50mL 튜브로 옮기십시오.</li>
		<li>25초 동안 0.2% 콜드 NaCl 용액의 20mL로 호중구를 배양하고, 1.6%의 추가 20mL를 순으로 배양하여 잔류 RBC를 Lyse. NaCl의 최종 콘서트는 0.9 %(동위)여야 합니다.</li>
		<li>3,000 x g에서10 분 동안 서스펜션원심분리.</li>
		<li>상체를 제거하고 호중구를 원하는 농도로 되감습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
림프구의 격리
	<ol>
<li>6웰 배양판에 5%의 열 비활성화 세럼으로 RPMI의 PBMC를 플레이트.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 단핵구는 접시에 부착되며 림프구는 자유롭게 떠있을 것입니다.</li>
		<li>림프구가 들어 있는 버퍼를 제거하고 RPMI로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>원하는 농도에서 림프구를 다시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
레이블 RPC, PMN, 림프구.
	<ol>
<li>각 세포 유형에 다른 형광염으로 라벨을 부착하십시오. 각 염료형은 다른 채널에서 형광을 염색해야 합니다. 선택한 각 염료에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 보완 활성화를 통한 RBC 세포 외 소포 생성
<ol><li>EDTA 튜브를 사용하여 정맥을 통해 전혈을 얻습니다.</li>
	<li>백혈구 필터를 통해 혈액을 통과한 다음 원심분리기를 500 x g에서 3번 씩 10분 동안 적혈구를 분리합니다. HBSS++를 세척 버퍼로 사용합니다.</li>
	<li>1.5mL 튜브에 100 μL 포장 된 RBC의 알리쿼트를 만들고 HBSS ++를 추가하여 1 mL로 볼륨을 구성합니다.</li>
	<li>HbSS++에서 0.18 μg/mL 최종 농도에 C5b,6을 추가한 다음 소용돌이를 넣습니다.</li>
	<li>실온에서 15분 동안 슬로우 셰이커를 착용하십시오.</li>
	<li>0.2 μg/mL의 최종 농도에 C7 단백질을 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시켜 섞는다. 이 시점에서 앞으로 소용돌이하지 마십시오.</li>
	<li>튜브를 실온에서 5분 동안 저속으로 설정된 튜브 셰이커에 놓습니다.</li>
	<li>C8 단백질을 0.2 μg/mL, C9 단백질을 0.45 μg/mL에 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시켜 섞는다.</li>
	<li>37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>10 분 동안 10,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>새로운 튜브에서 EV 함유 상체를 수집합니다. 셀 펠릿에 너무 가까이 있는 상체를 제거하지 마십시오.</li>
</ol>6. 자기 부상 장치의 세포 분석
<ol><li>제조업체 지침에 따라 계측기 시동을 수행합니다.</li>
	<li>튜브가 채워질 때까지 50 μL의 샘플을 모세관 튜브에 적재합니다. 모세관 실란트로 모세관 관의 끝을 밀봉하여 기포가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>모세관 튜브를 상단과 하단 자석 사이의 홀더에 적재합니다. 스테이지와 포커스를 조정하여 최적의 시청을 할 수 있습니다. 참고: 세포/구슬은 밀도와 GD3+의농도에 따라 자기 평형 위치에 도달하기 위해 5-20 분에서 어디서나 걸릴 수 있습니다. Gd3+의농도가 높을수록 시간이 짧아지수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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그라데이션 원심분리는 현재 고유한 밀도를 기반으로 하위 셀룰러 구성 요소를 격리하는 표준 기술입니다. 그러나 이러한 접근 방식은 전문 그라데이션 미디어와 원심분리기 장비를 사용해야 합니다. 여기에 제시된 자기 부양 접근법은 순환 세포의 형태학적 및 기능적 특성에 대한 상세한 조사를 최소한으로 허용하며, 세포의 조작이 있는 경우 순환 세포에 대한 생체 내 접근을 제공한다.
그러나 자기 부상을 사용할 때 몇 가지 점을 언급 할 가치가 있습니다. 첫째, 이미징에 사용되는 현미경은 설정이 시간이 많이 걸리기 때문에 이 방법에 전념해야 하며, 현미경이 부분적으로 분해되고 자석과 모세관 튜브와 정확하게 정렬된 광학과 수평으로 완벽하게 배치되어야 합니다. 둘째, 실험실 잭과 모세관 유리의 움직임을 조정하는 데 사용되는 번역 단계와 초점은 세 축 각각에 정확한 위치와 자유로운 움직임이 필요합니다. 아마도 전체 설정의 가장 중요한 정렬은, 상단 및 하단 자석이 완벽하게 수평뿐만 ...

자기부상은 세포 유형1,2,3,단백질4,5 및 오피오이드6을 특정 밀도 및 파라자성 특성에 기초하여 분리, 분석 및 식별하도록 개발된 기술입니다. 세포 밀도는 대사율 및 분화상태7,8,9,10,11,12,13,14와직접 관련된 각 세포 유형의고유하고본질적인 특성이다. 꾸준한 상태 조건 동안 세포 밀도에 미묘 하 고 일시적인 변화를 정량화, 그리고 다양 한 세포 과정 동안, 세포 생리학 및 병리 생리학에 대 한 타의 추종을 불허 하는 통찰력을 감당할 수 있습니다. 세포 밀도의 변화는 세포분화(15,16,세포 주기 진행9,17,18,19,세포 세포세포20,21,22, 23및 악성 변환24,25,26)와 연관된다. . 따라서, 세포 밀도의 특정 변화의 정량화는, 다양한 활성화 과정을 겪고 있는 세포의 동일 모형 사이에서 차별할 뿐만 아니라, 다른 모형의 세포를 분화하기 위하여 이용될 수 있다. 이를 통해 특정 세포 하위 집단을 대상으로 하는 실험을 가능하게 하며, 밀도의 동적 변화는 변화된 세포대사(27)의지표역할을 한다. 변화하는 환경에 대응하여 세포가 밀도를 변경할 수 있다는 것이 확립된 바와 같이7,그 밀도와 관련하여 세포의 역학을 측정하여 이를 완전히 이해하는 것이 필수적이며, 현재 의 방법은12를제공하지 않을 수 있다. 반면에 자기 부상은 세포 및 그성질(28)의동적 평가를 허용한다.
세포는 영구적인 자기 이폴 순간이 없다는 것을 의미하는 다각성입니다. 그러나, 외부 자기장에 노출되면, 약한 자기 이폴 모멘트는 적용된 필드의 반대 방향으로, 세포에서 생성된다. 따라서, 세포가 파라마그네틱 용액에서 중단되고 강한 수직 자기장에 노출된 경우, 자기 원에서 벗어나 높이로 멈추게 되며, 이는 주로 개별 밀도에 따라 달라집니다. 두 가지 기준이 충족될 때 불균일 자기장의 최소에 국한된 물체의 다이내자기 부유가 가능합니다: 1) 입자의 자기 감수성은 주변 매체보다 작아야 하며, 2) 자기력은 입자의 부력력에 대항할 만큼 충분히 강해야 한다. 두 기준 모두 자기 완충에서 RBC를 일시 중단하고 작고 저렴하며 시판되는 영구 자석1을가진 강력한 자기장 그라데이션을 만들어 달성 할 수 있습니다. 중력방향을 따라 축상에 자기적으로 갇힌 입자의 평형 위치는 밀도(버퍼밀도에 비해), 자기 감수성(완충의 자기 감수성에 대한) 및 적용된 자기장의 시그니처에 의해 결정된다. 용액의 밀도와 자기 특성이 시스템 전반에 걸쳐 일정하기 때문에, 세포의 본질적인 밀도 특성은 덜 조밀한 세포에 비해 더 낮은 상승하는 조밀한 세포와 함께 세포의 부양 높이를 결정하는 주요 요인이 될 것이다. 이 방법은 밀도 측정을 위해 정밀하고 비율 측정 분석을 사용할 수 있는 두 개의 밀도 참조 구슬(1.05 및 1.2 g/mL) 집합을 사용합니다. 자기 용액의 농도를 변경하면 순환 세포의 밀도가 세포에 특정이므로 CBC에서 RBC와 같은 다른 세포 집단을 분리하여 격리 프로토콜 또는 기타 세포 조작의 필요성을 제거할 수 있습니다.
생물학 연구에 사용되는 검출 방법의 대부분은 선형 신호를 정량화하기 쉬운 특정 결합 이벤트의 추정에 의존한다. 이러한 판독 방법은 종종 복잡하고 특수 장비 및 전담 과학 인력이 포함됩니다. 세포의 혈장 막또는 세포외 소포의 혈장 막에서 발견되거나 플라즈마에서 용해되는 항원의 검출을 겨냥한 접근법은 하나 또는 두 개의 항체 코팅 구슬을 사용하여 본원에 설명되어 있습니다. 구슬은 서로, 심문대상의 밀도가 서로 달라야 한다. 임의의 주어진 생체 유체에서 표적 항원의 존재는 검출 비드에 바인딩되는 항원 양성 세포의 부양 높이에 있는 특정, 측정 가능한 변화로 변환됩니다. 용해성 항원 또는 세포 외 소포의 경우, 비드 세포 복합체가 아닌 비드 비드 복합체를 형성하여 포획 및 검출 비드 모두에 바인딩됩니다. 부양 높이의 변화는 비드 셀 또는 비드 비드 복합체의 새로운 밀도에 따라 달라집니다. 생물유체에서 항원의 존재를 나타내는 복합체의 부양 높이의 변화 외에도, 복합체의 수는 표적의 양에도 의존하여 자기 적 발화를 하는 것 또한 항원검출(24)에대한 정량적 접근법이다.

<table><tbody><tr><td>2 (N-Morpholino) ethanesulfonic 산성 수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M-2933</td> <td>(MES); 활성화 완충기</td></tr><tr><td>50x2.5x1 mm 자석, 도금된 니켈 (Ni Cu Ni), 급료 N52, 5mm (0.197") 간격 K&를 통해 자화되는</td> 분대<td>; J Magnetics</td><td>맞춤형</td><td>자석 자기 부상 장치에 사용</td></tr><tr><td>모세관 실란트 (Critoseal)</td><td>Leica Microsystems</td><td>267620</td><td>모세관 끝을 덮는 데 사용</td></tr><tr><td>원심 분리기 튜브 필터 (Corning Costar Spin-X)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>CLS8163</td><td>비드 세척에 사용</td></tr><tr><td>Compact Lab Jack</td><td>Thorlabs</td><td>LJ750</td><td>자기 부상 장치 조정에 사용</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>비드 현탁액용 솔루션</td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>E9508-100ML</td><td>비드 세척 단계에서 사용</td></tr><tr><td>형광 플라즈마 멤브레인 염색제(CellMask Green)</td><td>Invitrogen</td><td>C37608</td><td>Rh+ 세포 염색에 사용</td></tr><tr><td>가도테리돌 주입</td><td>ProHance</td><td>NDC 0270-1111-03</td><td>가돌리늄 (Gd3+); 세포를 현탁시키는 데 사용되는 자성 용액</td></tr><tr><td>HBSS++</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>시료 준비를 위한 용액</td></tr><tr><td>Human C5b,6 complex</td><td>Complement Technology, Inc</td><td>A122</td><td>RBC Evs</td></tr><tr><td>Human C7 protein</td><td>Complement Technology, Inc</td><td>A124</td><td>RBC Evs</td></tr><tr><td>Human C8 protein</td><td>Complement Technology, Inc</td><td>A125</td>를 생성하는 <td>데 사용 RBC 생성에 사용 Evs</td></tr><tr><td>Human C9 protein</td><td>Complement Technology, Inc</td><td>A126</td><td>RBC Evs</td></tr><tr><td>Mini Series Post Collar</td><td>Thorlabs</td><td>MSR2</td> 생성에 사용 <td>자기 부상 장치를 실험실 잭</td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1769-10G</td><td>(EDC)에 고정하는 데 사용; 항체 결합 반응에 사용</td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG Control</td><td>R& D Systems</td><td>AB-105-C</td><td>제어 조건으로 비드 코팅에 사용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(10X 용액, pH 7.4)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td>세척 단계에 사용되는 커플링 버퍼의 구성 요소</td></tr><tr><td>폴리소르베이트 20(트윈 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td>활성화 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>폴리스티렌 카르복실 폴리머</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PC06004</td><td>항체 결합에 사용되는 최고 밀도 비드 (1.05 g / mL)</td></tr><tr><td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-112694</td><td>적혈구에서 Rh 인자의 감지를 위해 비드를 코팅하는 데 사용</td></tr><tr><td>연구 학년 현미경</td><td>Olympus</td><td>Provis AX-70</td><td>Sensorsd 자기 부상 장치를 장착하고 공중 부양 세포를 보는 데 사용</td></tr><tr><td>고무 댐핑 피트</td><td>Thorlabs</td><td>RDF1</td><td>브레드보드 테이블을 지지하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Square Boro Tubing</td><td>VitroTubes</td><td>8100-050</td> Maglev Sulfo-NHS<td>에 시료를 적재하는 데 사용되는 모세관</td></tr><tr><td>Thermoscientific</td><td></td><td>24510</td><td>항체 결합 반응에 사용</td></tr><tr><td>Translational Stage</td><td>Thorlabs</td><td>PT1</td><td>초점 및 모세관 스캔에 사용</td></tr></tbody></table>

자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

설명된 방법은 자기 적 부상의 원리에 기초하여 개발되었으며, 이는 밀도와 자기 특성에 따라 세포와 입자를 분리합니다. 밀도는 그 대사 속도, 분화 및 활성화 상태와 직접적으로 관련된 특성을 식별하는 세포 유형입니다. 자기 부양은 순환 혈액 세포를 성공적으로 분리, 이미지 및 특성화하고 빈혈, 겸상적혈구 질환 및 밀도 및 자기 특성에 따라 순환 종양 세포를 검출하는 1 단계 접근법을 허용합니다. 이러한 접근법은 또한 각각 포획 및 검출 항체로 코팅된 저밀도 비드 세트를 사용하여 용액에 존재하는 수용성 항원들을 검출할 수 있다. 항원이 용액에 존재하는 경우, 두 세트의 구슬을 교개하여 항체 코팅 구슬의 행 사이에 부과되는 새로운 구슬 비드 복합체를 생성합니다. 용액에서 표적 항원의 농도가 증가하면 항원 농도가 낮아지면 더 많은 수의 비드 비드 복합체가 생성되어 표적 항원의 정량적 측정이 가능합니다. 자기 부상은 감소된 시료 준비 시간과 고전적인 판독 방법에 대한 의존도 부족으로 인해 다른 방법에 유리하다. 생성된 이미지는 스마트폰이나 태블릿과 같은 표준 현미경 또는 모바일 장치를 사용하여 쉽게 캡처및 분석할 수 있다.

자기 부상은 물체의 밀도, 자기 서명, 파라마그네틱 용액의 농도 및 두 개의 강한 희토류 자석에 의해 생성된 자기장의 강도에 따라 서로 다른 굴밀도의 물체를 집중시킵니다. 두 자석이 서로 위에 놓이기 때문에, 시료를 부유시키는 것은 Köhler 조명을 유지하면서, 그 측에 켜진 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다(도 1). 각 세포 유형에 의해 도달된 최종 부양 높이는 파라마그네틱 용액의 농도를 변경하여 쉽게 변형될 수 있다. 도 2는 가돌리늄의 다양한 농도를 이용하여 상이한 순환 혈액세포의 분리를 도시한다. 밀도가 다른 두 비드 유형(1.05 및 1.2 g/mL)은 밀도 부양 높이 및 크기 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 주어진 세포 유형의 부양 높이는 본질적인 밀도에 따라 달라지므로 자기 부상은 중요한조작(24)없이관심 있는 세포를 격리하는 직접적인 수단을 제공한다. 이 프로...

이 논문은 고정 밀도를 가진 포획 구슬의 부양 높이의 변화를 정량화하여 용해성 또는 멤브레인 바운드항원들의 존재를 구체적으로 검출할 수 있는 자기 부양 기반 방법을 설명합니다.

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

이 기술은 짧은 기간에 거의 또는 전혀 조작없이 밀도에 전적으로 기초하여 다양한 과정을 겪고 다양한 세포 유형과 세포의 분리를 할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 최소 침습으로, 작은 볼륨을 필요로하고, 빠른 결과를 제공하고, 고전적인 판독에 의존하지 않으며, 전문 인력이 필요하지 않다는 것입니다. 이 기술은 여러 질병, 예를 들면 빈혈및 패혈증을 검출하기 위하여 적용될 수 있습니다.원클릭 랜싱 장치를 사용하여 계골 계수 양성 혈액 기증자의 손가락을 찌르고 DPBS의 1 밀리리터에서 10 마이크로리터의 혈액을 수집합니다. 류수스 인자 양성 세포의 1 밀리리터 현탁액에 형광 염료 1개를 첨가하여 혈장 막을 형광으로 염색하고 15분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 15초 동안 5, 600회 G에서 회전하여 세포를 펠릿으로 만들고, DPBS의 1밀리리터를 사용하여 펠릿을 세 번 세척합니다.칼슘과 마그네슘으로 HBSS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 원 클릭 랜싱 장치를 사용하여 rhesus 요인 음성 혈액 기증자의 손가락을 찌르고 혈액의 두 마이크로 리터를 수집합니다. 구슬만 포함하는 실험 관을 준비하려면 칼슘과 마그네슘을 곁들인 HBSS 174 마이크로리터, IgG 제어 구슬 1개, 밀리리터 밀도당 1.2그램의 무거운 구슬 1개, 500밀리올라 가돌리늄 24마이크로리터를 추가합니다.IgG가 함유된 실험 제어 관을 준비하기 위해 칼슘과 마그네슘을 함유한 HBSS 172마이크로리터, IgG 대조구의 마이크로리터 1개, 무거운 구슬 1개, 거액의 마이크로리터, 레서스 인자 음성 혈액 1편, 스테인드 리서스 인자 양성 혈액 현탁액 1편, 500밀리알륨 24마이크로리터를 첨가한다. 시료 실험 튜브를 준비하려면 칼슘과 마그네슘을 곁들인 HBSS 172마이크로리터, 항 RhD 코팅 구슬 1개, 무거운 구슬 1마이크로리터, 레서스 인자 음성 혈액의 마이크로리터 1개, 스테인드 레서스 인자 양성 혈액 현탁액 1편, 500밀리알륨 24마이크로리터를 첨가한다. 자기 부상 장치를 설정합니다.그리고 튜브가 채워지때까지 샘플의 50 마이크로리터를 모세관 튜브에 적재합니다. 모세관 실란트로 모세관 튜브의 끝을 밀봉하여 거품이 없도록 하십시오. 모세관 튜브를 모세관 홀더에 상부와 하단 자석 사이에 놓고 스테이지와 포커스를 조정하여 최적의 시야를 제공합니다.세포와 구슬이 자기 평형 위치에 정착할 때까지 약 5~20분 정도 기다립니다. 이 프로토콜을 사용하여, 혈액 세포는 자기 부양 장치를 사용하여 부양 높이에 따라 분리되었다. 저밀도 구슬은 밀도 상승 높이 및 크기 참조를 제공하는 데 사용되었습니다.다형성 핵 세포는 21 밀리알 가돌리늄 이온 농도에서 적혈구 위에 부풀어 있었다. 오래된 혈액 세포는 60 밀리마일라 가돌리늄 이온 농도에서 부풀어 있었습니다. 적혈구, 다형성핵세포 및 림프구는 본질적인 밀도에 기초하여 40밀리알라 가돌리늄 이온 농도로 분리되었다.rhesus 인자 항원은 IgG 및 항RhD 항체 코팅 구슬을 사용하여 적혈구에서 검출되었다. 비드 적혈구 복합체는 IgG 대조군 샘플에서 생성되지 않았지만, 류수스 인자 양성 구슬에 의해 포획된 형광 염색적 적혈구가 검출되었다. rhesus 인자 양성 세포에 대한 항 RhB의 결합은 불바운드 구슬과 부정적인 적혈구의 간헐적 밀도에서 중심에 비드 세포 복합체를 생성하였다.또한, 복합성 형성은 방출된 형광을 관찰함으로써 확인되었다. CR1 및 CD47용 항체로 코팅된 고밀도 구슬과 저밀도 비드 사이에 형성된 B 비드 복합체는 세포외 소포 유래적 혈구의 존재를 나타낸다. 거품을 소개하지 않고 모세관을 캡핑하는 것은 가장 어려운 단계이며 연습이 필요합니다.이 방법은 혈액학에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다., 특히 적혈구 질환에 초점을 맞춘.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 자기 부상 기구를 사용하여 혈액 샘플에서 Rhesus(Rh) 인자를 검출하는 방법을 보여줍니다. 자기장은 밀도에 따라 구슬과 혈액 세포를 정렬하고 공중에 띄웁니다. 샘플을 항-Rh 항체로 처리하면 중간 밀도의 비드 세포 복합체가 형성되어 Rh 양성 적혈구와 Rh 음성 적혈구를 구별할 수 있습니다.

자기 부상(Magnetic Levitation)을 이용한 인간 혈액 샘플에서 붉은털 인자(Rhesus Factor) 검출

이 비디오는 별개의 세트로 염색된 카르복실화 자성 폴리스티렌 미세구를 사용하여 다중화된 정량적 박테리아 검출을 보여줍니다. 이 절차는 비드-박테리아 복합체의 형성, 자기 분리 및 흐름 기반 분석을 포함하여 동일한 반응 웰에서 여러 박테리아를 정확하고 동시에 정량화할 수 있습니다.

Dye-Labeled Magnetic Microspheres를 사용한 Multiplexed Quantitative Bacterial Detection

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

우리는 스마트폰 호환 장치와 이미징 및 처리 기능이 내장된 장치 모두에서 자동화된 이미징 및 분석과 결합된 자기 부상 기술을 제시합니다. 이는 두 가지 입증된 생물 의학 응용 분야, 즉 겸상 적혈구 질환 진단과 백혈구와 적혈구 분리를 통해 세포의 밀도 분포를 측정하는 데 적용됩니다.

질병 진단을위한 휴대용 이미징 및 분석과 결합 자기 부상

바이러스 또는 세포외 소포체는 표면 항원을 인식하는 항체에 결합된 15nm 자성 나노입자로 면역포획되었습니다. 포획된 비리온 또는 소포는 다른 표면 항원에 대한 형광 항체로 표지되었습니다. 그 결과로 생성된 복합체는 높은 자기장에서 분리되고 형광에 트리거된 기존 유세포 분석기로 분석되었습니다.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

여기에 제시된 1 차적인 인간 혈액 단화 절연을 위한 프로토콜은 대식세포 및 수지상 세포로의 분화뿐만 아니라 다세포 인간 폐 모델로 상피 세포를 조립한다. 염증 성 자극에 노출되면 갓 분리되거나 해동 된 단핵구로부터 분화 된 면역 세포로 구성된 공동 배양의 생물학적 반응이 비교됩니다.

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

배우세요 자기 적고 기술을 이용한 혈액 세포 밀도 분석 및 항원 검출 방법입니다. 이 기술은 최소 침습으로 적혈구의 Rh 인자를 빠르게 식별하여 빈혈과 패혈증 등의 질병 진단에 활용됩니다.

자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화

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