인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

다음 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포로부터 인간 장 및 결장 오가노이드의 세대를 설명합니다. 이 기술을 통해 사용자는 장 패턴화와 관련된 경로를 조사할 수 있습니다. 이 기술을 통해 사용자는 동종 인 지역별 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장 패턴의 확립 및 유지를 조절하는 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

[해설자] 세포외 매트릭스 또는 ECM 코팅된 24웰 플레이트를 생물안전 캐비닛 내부에 30분 동안 넣어 실온에 도달하는 것으로 시작합니다. mTeSR1 완전 배지 세포 박리 용액과 고급 DMEM을 섭씨 37도 비드 욕조 안에 넣고 30분 동안 예열합니다. 13밀리리터의 mTeSR1과 13마이크로리터의 10밀리몰 Y-27632 Rho 관련 단백질 키나아제 또는 ROCK 억제제를 첨가하여 50밀리리터 원뿔형 튜브에 도금 배지를 준비합니다. 6웰 플레이트에서 세포를 수집하려면 3-4웰에서 배지를 흡인하고 웰당 2밀리리터의 고급 DMEM으로 한 번 세척합니다. 고급 DMEM을 흡인하고 세포 해리 용액 1밀리리터를 각 웰에 분배합니다. 플레이트를 5% 이산화탄소, 섭씨 37도 인큐베이터 내에서 5-7분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 준비하기 위해 5밀리리터 피펫을 사용하여 위아래로 4-5회 피펫팅하여 세포 덩어리를 해리합니다. 각 웰에 2밀리리터의 고급 DMEM을 추가합니다. 부드럽게 위아래로 4-5회 피펫팅하고 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 300G에서 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 흡인하지 않고 튜브에서 배지를 흡인합니다. 그리고 준비된 mTeSR1 배지 6밀리리터와 ROCK 억제제를 첨가한다. 위아래로 3-4회 피펫팅하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 50밀리리터 튜브 내부의 나머지 mTeSR1 및 ROCK 억제제 배지로 옮깁니다. 4-5회 격렬하게 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 도금하기 직전에 24웰 플레이트에서 ECM을 흡인합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 세포를 다시 재현탁하고 각 웰에 0.5밀리리터의 세포 현탁액을 분배합니다. 플레이트를 시계 방향으로 세 번, 시계 반대 방향으로 세 번, 앞뒤로 세 번, 좌우로 세 번 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다. 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후 사용한 배지를 흡인합니다. mTeSR1의 웰당 0.5밀리리터를 첨가하고 동일한 조건에서 24시간 동안 다시 배양합니다. 밀리리터당 100마이크로그램의 Activin A 원액 용액과 100μg/ml의 BMP4를 원뿔형 튜브의 Activin day 1 배지에 희석하여 Activin day one 완전 배지를 준비합니다. 섭씨 37도의 구슬 욕조에서 미디엄을 데우십시오. 24웰 플레이트에서 mTeSR1 배지를 흡인하고 웰당 0.5밀리리터의 Activin day 1 배지를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후에 세포를 확인하십시오. 밀리리터당 100마이크로그램의 Activin A 원뿔형 배관의 Activin 2일차 배지에 희석하여 Activin 2일차 완전 배지를 준비하고 튜브를 섭씨 37도의 비드 욕조에 넣습니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 24웰 분화 플레이트를 제거하고 사용한 배지를 제거합니다. 웰당 0.5밀리리터의 예열된 Activin day 2 배지를 분배하고 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터 내부에 다시 넣어 24시간 동안 합니다. 밀리리터당 100마이크로그램의 Activin A 원뿔형 배지의 Activin 3일차 배지에 희석하여 Activin 3일차 완전 배지를 준비하고 튜브를 섭씨 37도의 비드 수조에 넣습니다. 사용한 배지를 제거하고 웰당 0.5밀리리터의 Activin 3일차 배지를 분배합니다. 최종 내배엽을 중간 후장 스페로이드로 분화하는 것으로 시작하려면 50밀리리터 원뿔형 튜브에 FGF4가 포함된 중간 후장 유도 배지 25밀리리터를 넣고 섭씨 37도의 비드 욕조에 30분 동안 넣습니다. 완전한 중간 후장 유도 배지를 준비하려면 배지가 따뜻해진 후 7.5마이크로리터의 CHIR99021을 첨가합니다. 사용한 배지를 제거하고 웰당 0.5밀리리터의 중간 후장 유도 배지를 분배하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날 단층 내 세포의 응축이 발생한 후, 사용한 배지를 신선한 중간 후장 유도 배지로 교체하고 플레이트를 다시 놓아 24시간 동안 배양합니다. 배지를 교체하는 동안 떠다니는 스페로이드가 버려지지 않도록 기존 배지를 15밀리리터 튜브로 옮기고 300G에서 1분 동안 원심분리합니다. 스페로이드를 12.5밀리리터의 신선한 중간 후장 유도 배지에 재현탁하고, 웰당 0.5밀리리터를 동일한 24웰 플레이트에 첨가하고, 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 후장 유도 4일째에 배지를 15밀리리터 튜브에 수집하여 플레이트 웰에서 부유 스페로이드를 수확한 다음 300G에서 1분 동안 원심분리합니다. 최종 내배엽 유도의 효율성은 FOXA2 및 SOX17에 대한 면역형광 염색을 수행하여 평가되었습니다. 전방 HOX 인자 HOXD3의 mRNA의 발현은 Noggin으로 처리된 인간 장 오가노이드 또는 HIO에서 가장 높고, 상피 성장 인자 또는 EGF 처리된 HIO에서 적고, BMP 처리된 인간 결장 오가노이드 또는 HCO에서 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 반대로, HOXA13 및 HOXD13 mRNA 발현은 HIO에서 낮고 HCO에서 높은 것으로 나타났습니다. HCO 상피가 적절하게 패턴화되었는지 확인하기 위해 SATB2, CDX2 및 CDH1에 대해 면역형광 염색을 수행했습니다.