Name: 인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 소장 및 결장 오가노이드를 생성하고 유지하며 특성화하는 방법을. 재현성과 확장성을 높여 소화기 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>15mL 코닝 튜브</td><td>송골매</td><td>21008-918</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>30% 자당</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>PBS에서 제작되었습니다.</td></tr><tr><td>5% 일반 당나귀 세럼</td><td>잭슨 면역연구소</td><td>017-000-121</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>50 mL 코닝 튜브</td><td>송골매</td><td>21008-951</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>아큐타제</td><td>써모 사이언티픽</td><td>A1110501</td><td>세포 박리 용액; Accutase 5mL를 총 20개의 튜브로 구성된 10mL 튜브에 분취하고 -20 &deg에서 보관합니다. 최대 6개월 동안 C. 4 &deg에 놓습니다. C 사용 전 밤새 사용하십시오.</td></tr><tr><td>액티빈 A</td><td>세포 유도 시스템</td><td>GFH6-100x10</td><td>동결건조된 분말을 100 & micro로 재구성합니다. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 멸균 PBS의 g/mL. 분취량 38 & 마이크로; L의 액티빈 A를 미리 냉각된 미세 원심분리기 튜브에 넣고 -80 &deg에서 보관합니다. C(튜브는 수령일로부터 12개월 후에 만료됩니다).</td></tr><tr><td>액티빈 1일차 배지(RPMI 1640)</td><td>코 닝</td><td>MT10041CV</td><td>비필수 아미노산(NEAA, Corning 11140050)을 사용하고 4°C에서 보관합니다. 기본 1일차 배지: RPMI 1640 500mL 및 NEAA 500mL. Activin Day 1 배지를 준비할 때, 13 mL의 기본 Day 1 배지, 13 및 micro를 첨가하십시오. l 액티빈 A(100 & micro; g/mL) 및 2 & micro; BMP4의 l(100 & micro; g/mL)를 사용합니다. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>액티빈 2일 배지(RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)</td><td>하이클론</td><td>SH30070.03T</td><td>비필수 아미노산(Corning 11140050)을 사용하고 4°C에서 보관합니다. 기본 2일차 배지: RPMI 1640 500mL, NEAA 500mL 및 0.2% 혈청 1mL. Activin Day 2 배지를 준비할 때 12.5mL의 기본 Day 2 배지와 12.5 & micro; L의 액티빈 A(100 & micro; g/mL)를 사용합니다. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>액티빈 3일차 배지(RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)</td><td>하이클론</td><td>SH30070.03T</td><td>비필수 아미노산(Corning 11140050)을 사용하고 4°C에서 보관합니다. 기본 3일차 배지: RPMI 1640 500mL, NEAA 500mL, 2% 혈청 10mL. Activin Day 3 배지를 준비할 때 12.5mL의 기본 day 3 및 12.5 & micro를 첨가합니다. L의 액티빈 A(100 & micro; g/mL)를 사용합니다. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 염소</td><td>써모 사이언티픽</td><td>A11055</td><td>1:500 희석(2차 항체)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼</td><td>써모 사이언티픽</td><td>A21206</td><td>1:500 희석(2차 항체)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 당나귀 안티 마우스</td><td>써모 사이언티픽</td><td>A10036</td><td>1:500 희석(2차 항체)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 당나귀 안티 마우스</td><td>써모 사이언티픽</td><td>A31571</td><td>1:500 희석(2차 항체)</td></tr><tr><td>베이스 금형</td><td>어부</td><td>22-363-552</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>기본 장 배지(고급 DMEM)</td><td>깁코</td><td>12491015</td><td>&nbsp; 염기성 장 배지를 준비할 때 DMEM 500mL, N2 500mL(Gibco 17-502-048), B27(Gibco) 500mL, L-글루타민 500mL를 첨가하여 2mM L-글루타민(Corning A2916801), 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 5mL(Gibco 15-140-122) 및 7.5mL&nbsp; 15mM HEPES를 얻으려면 1M HEPES가 됩니다.&nbsp; 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>Biorad CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템</td><td>바이오라드</td><td>해당 사항 없음</td><td>다른 qRT-PCR 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>세포 회수 솔루션</td><td>코 닝</td><td>354253</td><td>ECM 성능 저하 솔루션</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>리프로셀</td><td>4000410</td><td>10mM에서 2.15mL의 DMSO를 첨가하여 재구성합니다. 50 & 마이크로를 준비합니다. L 분취량 및 -20 &deg;C.&nbsp; 분말을 4도 및 도에서 보관하십시오. C, 빛으로부터 보호됩니다.</td></tr><tr><td>CTRL HIO 패터닝 매체</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>기본 장 배지 및 100ng/mL EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마-알드리치</td><td>디9542</td><td>1:100 희석(2차 항체)</td></tr><tr><td>DE 단층</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>단층은 이전 단계에서 생성되었습니다(섹션 4.4).</td></tr><tr><td>분산</td><td>깁코</td><td>17105041</td><td>동결건조 분말을 Advanced DMEM(Gibco MT15090CV)에 1mg/mL 최종 농도로 재현탁합니다. Millipore 필터 멸균 튜브를 사용하여 진공 청소기로 청소하여 멸균용 용액을 여과합니다. 10mL 분취량(1mg/mL)을 만들고 -20 &deg에서 보관합니다. 최대 6개월 동안 C. 4 &deg에 놓습니다. C 사용 전 밤새 사용하십시오.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>써모 사이언티픽</td><td>236-EG-01M</td><td>100 ng/mL EGF를 준비할 때 500 & micro; 멸균 PBS에서 g/mL. 다음으로 멸균 PBS 2mL를 1mg EGF에 넣고 500 & micro; g/mL EGF 용액. 분취량 100 & 마이크로; 20개의 튜브에 L의 EGF.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 6cm 페트리 접시(뚜껑 뚜껑 포함)</td><td>어부</td><td>FB0875713A</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>피셔브랜드 셀 리프터</td><td>어부</td><td>08-100-240</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Fisherbrand 클래스 B 투명 유리 나사산 바이알(마개 부착 포함)</td><td>어부</td><td>03-338B</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫</td><td>어부</td><td>13-678-2D0</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>플루오로마운트 G 슬라이드 마운팅 매체</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Gibco 고급 DMEM</td><td>깁코</td><td>12-491-023</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>염소 항-E-카드헤린</td><td>R& D 시스템</td><td>AF648</td><td>1:400 희석(1차 항체)</td></tr><tr><td>염소 항 SOX17</td><td>R& D 시스템</td><td>AF1924</td><td>1:500 희석(1차 항체)</td></tr><tr><td>HCO 패터닝 매체</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>기본 장 배지, 100 ng/mL EGF 및 100 ng/mL BMP2. BMP2를 준비할 때 멸균 4mM HCl 0.1% BSA 1mL를 BMP2 바이알(100 & micro; g). 분취량 25 & 마이크로; 4개의 튜브에 있는 BMP4 용액의 L.&nbsp; 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z359629</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>인간만능줄기세포(hPSC)</td><td>만능줄기세포 시설</td><td>해당 사항 없음</td><td>마트리겔 코팅 24웰 플레이트(Thermo Scientific 73520-906)에 세포를 파종했습니다.</td></tr><tr><td>얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액(PFA)</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>pH는 7.4여야 합니다.</td></tr><tr><td>ImmEdge 소수성 배리어 펜</td><td>벡터 연구소</td><td>101098-065</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>유도만능줄기세포(iPSC)</td><td>만능줄기세포 시설(신시내티 어린이병원 의료 센터)</td><td>해당 사항 없음</td><td>다른 hESC 또는 iPSC 라인을 사용할 수 있지만 프로토콜은 각 세포주에 최적화되어야 합니다.</td></tr><tr><td>라이카 마이크로톰</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>LSM 880</td><td></td><td></td><td>공초점 현미경</td></tr><tr><td>Matrigel 기저막 매트릭스</td><td>코 닝</td><td>354234</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>코 닝</td><td>354277</td><td>4 x 6웰 접시에 충분한 희석 마트리겔을 만들기에 충분한 양에 해당하는 4 x 마트리겔 분취량을 준비합니다.</td></tr><tr><td>중간 후장 유도 배지(RPMI 1640)</td><td>코 닝</td><td>MT10041CV</td><td>비필수 아미노산(Corning 11140050), 2% FBS vol/vol(Hyclone SH30070.03T), 3 & micro; M CHIR99021 및 500ng/mL FGF4. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>중간 후장 스페로이드</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Steriflip 멸균 일회용 진공 필터 장치</td><td>밀리포어시그마</td><td>SCGP00525</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>마우스 안티 CDX2</td><td>바이오제넥스</td><td>MU392-UC</td><td>1:300 희석(1차 항체)</td></tr><tr><td>마우스 안티 FOXA2</td><td>아브노바/노부스</td><td>H00003170-M01</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>mTeSR1 완전 성장 배지</td><td>줄기세포 기술</td><td>85870</td><td>100mL의 mTeSR 보충제(85870)를 하나의 400mL mTeSR 배지(85870)에 첨가하고 오염을 피하면서 50mL 튜브에 분취합니다. 4&deg에 보관하십시오. C를 사용할 때까지 사용합니다.</td></tr><tr><td>머레이의 투명 솔루션(BABB라고도 함)</td><td>머레이의</td><td>해당 사항 없음</td><td>1:2 벤질 벤조에이트 및 벤질 알코올.</td></tr><tr><td>NOG HIO 패터닝 매체</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>기본 장 배지, 100 ng/mL EGF 및 100 ng/mL NOGGIN(Dispose 25 & micro; 250 & 마이크로의 NOGGIN g; l 0.1% BSA를 함유한 멸균 PBS).</td></tr><tr><td>뉴클레오스핀 RNA</td><td>타카라</td><td>740955.25</td><td>다른 RNA 분리 키트를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 24웰(Nunc)</td><td>써모 사이언티픽</td><td>73521-004</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 24웰 코팅 마트리겔</td><td>써모 사이언티픽</td><td>73521-004</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 6-웰 (Nunc)</td><td>써모 사이언티픽</td><td>73520-906</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 6웰 코팅&nbsp; 마트리겔.</td><td>써모 사이언티픽</td><td>73520-906</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>HIO, CTRL HIO 및 HCO를 위한 성장 배지</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>기본 장 배지 및 100 ng/mL EGF(최종 농도)</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 0.5% Triton X(PBS-T)</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>뇌관</td><td>통합 DNA 기술, Inc.(IDT)</td><td>해당 사항 없음</td><td>프라이머는 프로토콜의 표 2에 나열되어 있습니다.</td></tr><tr><td>토끼 안티 CDX2</td><td>셀 마크</td><td>EPR22764Y</td><td>1:100 희석(1차 항체)</td></tr><tr><td>토끼 안티 SATB2</td><td>셀 마크</td><td>281 회</td><td>1:100 희석(1차 항체)</td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP-4 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>314-BP-010</td><td>동결건조된 분말을 100 & micro로 재구성합니다. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 멸균 4mM HCl의 g/mL. 4.17mL HCl 용액을 45.83mL 분자수에 첨가하여 총 50mL의 1M HCl에 첨가합니다. 그런 다음 200 & micro를 추가합니다. L 1 M HCl 내의 분자 등급 물 49.8 mL, 총 50 mL의 4 mM HCl. 그런 다음 4mM HCl 50mL에 0.05g BSA를 첨가하고 여과하여 멸균 상태로 만듭니다. 멸균 4 mM HCl 0.1% BSA를 33 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하여 -20 &°C에서 보관합니다. 100 &micro를 추가합니다. l 멸균 4mM HCl 0.1% BSA를 BMP4 바이알(10 & micro; g) 100 & micro에서 BMP4 용액을 만드는 것; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-4 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>235-F4-01M</td><td>100 & micro에서 재구성; 0.1% 소 혈청 알부민을 함유한 멸균 PBS의 g/mL. PBS 50mL에 BSA 0.05g을 첨가하여 0.1% BSA를 만듭니다. 필터 0.22 & 마이크로; BSA를 멸균하기 위한 M BSA. 5개의 튜브에 0.1% BSA 10mL를 분취합니다. 멸균 0.1% BSA 10mL에 FGF-4 1mg을 첨가합니다. 분취량 250 & 마이크로; L을 미리 냉각된 40개의 미세 원심분리기 튜브에 넣고 -80°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>토크리스</td><td>1254</td><td>최종 농도는 10mM(10mmol/L)입니다. DMSO에 10mM로 재현탁하고 필터 멸균합니다. 각 바이알에 멸균 PBS 3mL를 추가합니다. 알리쿠트 100 & 마이크로; 30개의 튜브에 L의 ROCK 억제제를 넣고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 합성 키트</td><td>써모 사이언티픽</td><td>11-754-250</td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 현미경 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>티슈 텍 OCT 컴파운드</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>해당 사항 없음</td></tr></tbody></table>

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

중기/후장 유도 단계에서 스페로이드의 성공적인 생성은 성공적인 패터닝을 나타냅니다. 부유 스페로이드 및 단층에서 CDX2에 대한 IF 염색을 수행하여 패터닝이 올바른지 확인합니다. 최종 내배엽(DE) 단계에서의 염색은 DE 유도의 효과를 나타낼 수 있지만, 효율적인 DE 유도 없이는 스페로이드 생성이 불가능합니다. DE 유도의 효율성을 테스트하려면 FOXA2 및 SOX17에 대해 IF 염색 및/또는 RT-qPCR을 수행합니다.
패터닝 단계 후에 HOX 요인의 발현은 성공적인 패터닝의 가장 좋은 지표입니다. HOX 인자는 주로 장 및 결장 간엽에서 발현됩니다 8,9. 따라서 HOX factor 표현식은 중간엽의 패터닝을 반영합니다. 전방 HOX 인자 HOXD3의 mRNA 발현은 NOGGIN 처리 HIO에서 가장 높고, 상피 성장 인자(EGF) 처리 HIO에서 적...

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

다음 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포로부터 인간 장 및 결장 오가노이드의 세대를 설명합니다. 이 기술을 통해 사용자는 장 패턴화와 관련된 경로를 조사할 수 있습니다. 이 기술을 통해 사용자는 동종 인 지역별 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장 패턴의 확립 및 유지를 조절하는 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.[해설자] 세포외 매트릭스 또는 ECM 코팅된 24웰 플레이트를 생물안전 캐비닛 내부에 30분 동안 넣어 실온에 도달하는 것으로 시작합니다. mTeSR1 완전 배지 세포 박리 용액과 고급 DMEM을 섭씨 37도 비드 욕조 안에 넣고 30분 동안 예열합니다. 13밀리리터의 mTeSR1과 13마이크로리터의 10밀리몰 Y-27632 Rho 관련 단백질 키나아제 또는 ROCK 억제제를 첨가하여 50밀리리터 원뿔형 튜브에 도금 배지를 준비합니다. 6웰 플레이트에서 세포를 수집하려면 3-4웰에서 배지를 흡인하고 웰당 2밀리리터의 고급 DMEM으로 한 번 세척합니다. 고급 DMEM을 흡인하고 세포 해리 용액 1밀리리터를 각 웰에 분배합니다. 플레이트를 5% 이산화탄소, 섭씨 37도 인큐베이터 내에서 5-7분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 준비하기 위해 5밀리리터 피펫을 사용하여 위아래로 4-5회 피펫팅하여 세포 덩어리를 해리합니다. 각 웰에 2밀리리터의 고급 DMEM을 추가합니다. 부드럽게 위아래로 4-5회 피펫팅하고 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 300G에서 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 흡인하지 않고 튜브에서 배지를 흡인합니다. 그리고 준비된 mTeSR1 배지 6밀리리터와 ROCK 억제제를 첨가한다. 위아래로 3-4회 피펫팅하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 50밀리리터 튜브 내부의 나머지 mTeSR1 및 ROCK 억제제 배지로 옮깁니다. 4-5회 격렬하게 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 도금하기 직전에 24웰 플레이트에서 ECM을 흡인합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 세포를 다시 재현탁하고 각 웰에 0.5밀리리터의 세포 현탁액을 분배합니다. 플레이트를 시계 방향으로 세 번, 시계 반대 방향으로 세 번, 앞뒤로 세 번, 좌우로 세 번 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다. 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후 사용한 배지를 흡인합니다. mTeSR1의 웰당 0.5밀리리터를 첨가하고 동일한 조건에서 24시간 동안 다시 배양합니다. 밀리리터당 100마이크로그램의 Activin A 원액 용액과 100μg/ml의 BMP4를 원뿔형 튜브의 Activin day 1 배지에 희석하여 Activin day one 완전 배지를 준비합니다. 섭씨 37도의 구슬 욕조에서 미디엄을 데우십시오. 24웰 플레이트에서 mTeSR1 배지를 흡인하고 웰당 0.5밀리리터의 Activin day 1 배지를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후에 세포를 확인하십시오. 밀리리터당 100마이크로그램의 Activin A 원뿔형 배관의 Activin 2일차 배지에 희석하여 Activin 2일차 완전 배지를 준비하고 튜브를 섭씨 37도의 비드 욕조에 넣습니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 24웰 분화 플레이트를 제거하고 사용한 배지를 제거합니다. 웰당 0.5밀리리터의 예열된 Activin day 2 배지를 분배하고 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터 내부에 다시 넣어 24시간 동안 합니다. 밀리리터당 100마이크로그램의 Activin A 원뿔형 배지의 Activin 3일차 배지에 희석하여 Activin 3일차 완전 배지를 준비하고 튜브를 섭씨 37도의 비드 수조에 넣습니다. 사용한 배지를 제거하고 웰당 0.5밀리리터의 Activin 3일차 배지를 분배합니다. 최종 내배엽을 중간 후장 스페로이드로 분화하는 것으로 시작하려면 50밀리리터 원뿔형 튜브에 FGF4가 포함된 중간 후장 유도 배지 25밀리리터를 넣고 섭씨 37도의 비드 욕조에 30분 동안 넣습니다. 완전한 중간 후장 유도 배지를 준비하려면 배지가 따뜻해진 후 7.5마이크로리터의 CHIR99021을 첨가합니다. 사용한 배지를 제거하고 웰당 0.5밀리리터의 중간 후장 유도 배지를 분배하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날 단층 내 세포의 응축이 발생한 후, 사용한 배지를 신선한 중간 후장 유도 배지로 교체하고 플레이트를 다시 놓아 24시간 동안 배양합니다. 배지를 교체하는 동안 떠다니는 스페로이드가 버려지지 않도록 기존 배지를 15밀리리터 튜브로 옮기고 300G에서 1분 동안 원심분리합니다. 스페로이드를 12.5밀리리터의 신선한 중간 후장 유도 배지에 재현탁하고, 웰당 0.5밀리리터를 동일한 24웰 플레이트에 첨가하고, 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 후장 유도 4일째에 배지를 15밀리리터 튜브에 수집하여 플레이트 웰에서 부유 스페로이드를 수확한 다음 300G에서 1분 동안 원심분리합니다. 최종 내배엽 유도의 효율성은 FOXA2 및 SOX17에 대한 면역형광 염색을 수행하여 평가되었습니다. 전방 HOX 인자 HOXD3의 mRNA의 발현은 Noggin으로 처리된 인간 장 오가노이드 또는 HIO에서 가장 높고, 상피 성장 인자 또는 EGF 처리된 HIO에서 적고, BMP 처리된 인간 결장 오가노이드 또는 HCO에서 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 반대로, HOXA13 및 HOXD13 mRNA 발현은 HIO에서 낮고 HCO에서 높은 것으로 나타났습니다. HCO 상피가 적절하게 패턴화되었는지 확인하기 위해 SATB2, CDX2 및 CDH1에 대해 면역형광 염색을 수행했습니다.

generation-maintenance-characterization-human-pluripotent-stem-cell

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

오가노이드는 질병 모델링을 위한 유용한 도구가 되었습니다. 세포외 기질(ECM)은 오가노이드 생성 중 세포의 운명을 안내하며, 자연 조직과 유사한 시스템을 사용하면 모델 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 이 연구는 동물 유래 ECM과 무이종 하이드로겔에서 유도만능줄기세포 유래 인간 장 오가노이드의 생성을 비교합니다.

인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

인간 장 오가노이드는 천연 인간 장의 구조와 기능을 더 잘 재현할 수 있도록 신경을 분포시켜야 합니다. 여기에서는 장 신경계를 이러한 구조체에 통합하는 한 가지 방법을 제시합니다.

인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

여기에서는 표준 매트릭스 내장 오가노이드 배양에서 정점 아웃 장 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 활발하게 증식하는 세포에 EdU를 통합하고 EdU 양성 세포의 반자동 정량화를 간략하게 설명합니다.

정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 소장 및 결장 오가노이드를 생성하고 유지하며 특성화하는 방법을. 재현성과 확장성을 높여 소화기 연구에 활용할 수 있습니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

더 많은 동영상 탐색