Name: 근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 실시간 형광 측정을 통해 근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능을 분석하는 방법을. 원추형 현미경과 생세포 이미징 기술을 활용하여 칼슘 역학 및 시냅스 소포 방출을 시각화하고 신경 퇴행성 질환의 치료 가능성을 평가합니다.

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우리는 Jefferson Weinberg ALS Center의 현재 및 이전 회원들이 이러한 기술과 분석을 최적화하기위한 중요한 피드백과 제안을 인정하고자합니다. 이 연구는 NIH (RF1-AG057882-01 및 R21-NS0103118에서 D.T), NINDS (R56-NS092572 및 R01-NS109150에서 P.P), 근육 이영양증 협회 (D.T.), ALS 연구를위한 로버트 패커드 센터 (D.T.), 가족 스트롱 4 ALS 재단 및 파버 가족 재단 (B.K.J., K.K 및 P.P)의 기금으로 지원되었습니다.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

설명 된 두 가지 방법에 공통적 인 세 단계는 실험 성공과 정량화 가능한 결과에 매우 중요합니다. 첫째, 각 실험 라운드 전에 신선한 aCSF를 준비하는 것이 첨부 된 지침에 따라 필수적입니다. 그렇게하지 않으면 적절한 신경 세포 탈분극을 예방할 수 있습니다. 처리되지 않은 대조군 뉴런의 샘플은 적절한 세포 탈분극을 보장하고 해당 이미징 세션에서 얻은 긍정적 인 결과에 대한 벤치 마크를 제공하기 위해 실험 그룹의 자극 전에 지속적으로 테스트되어야합니다. 둘째, 특정 시냅스 영역에 대한 시간에 따른 형광을 성공적으로 추적하려면 모니터링을 위해 이미징 매개 변수 및 ROI 영역을 설정할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 기준선 기간 기록은 즉시 자극 기록 기간으로 전환되어야 한다. 스티릴 염료 방출의 단일 붕괴 역학을 포착하기 위해서는 충분히 빠른 프레임 속도 (2 이미지 / s)가 필요합니다. 마지막으로, 실험 분석에서 중요한 단계는 형광 측정을 먼저 이미징 배경으로 정규화한 다음 사전 자극된 기준선으로 정규화하는 것입니다. 다른 ...

실험실에서 근위축성 측삭경화증(ALS)을 모델링하는 것은 80% 이상의 사례1의 압도적으로 산발적인 특성으로 인해 질병 원인으로 알려진 방대한 수의 유전 돌연변이와 결합되어 독특하게 도전적으로 이루어집니다2. 그럼에도 불구하고, ALS의 모든 사례는 철저한 신경 변성 전에 시냅스 전 운동 뉴런과 시냅스 후 근육 세포 사이에 기능 장애 통신이 있다는 통일 된 특징을 공유합니다3,4. 임 상적으로, 환자들이 남아있는 상부 및 하부 운동 뉴런의 연결성을 상실함에 따라, 그들은 질병 전반에 걸쳐 뉴런 하이퍼 및 저흥분성의 특징을 가지고 있습니다.5,6,7,8,9, ALS 연구원으로서 우리가 이해하고자하는 이러한 시냅스에 대한 복잡한 기본 분자 변화를 반영합니다.
다중 트랜스제닉 모델은 SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 및 TDP4317,18,19를 포함하는 ALS 원인 유전자 돌연변이의 발현과 함께 신경근 접합부의 악화 및 해체가 발생한다는 것을 예시하였다. 시냅스 부톤, 척추 밀도 및 시냅스 전/후 조직의 평가를 포함한 형태학적 평가를 통해. 기계론적으로, 1930년대 콜, 호지킨, 헉슬리의 획기적인 논문 이후, 시험관내 세포 배양 또는 조직 슬라이스 제제20에서 전기생리학적 기술을 통해 시냅스 반응을 평가하는 것도 가능해졌다. 이러한 전략을 통해 ALS의 많은 모델은 시냅스 전달 결핍을 입증했습니다. 예를 들어, TDP43의 돌연변이 변이체는 향상된 발사 주파수를 야기하고 NSC-34 (척수 x 신경모세포종 하이브리드 세포주 34) 전동-뉴런-유사 세포21에서 작용 전위 역치를 감소시킨다. 이 동일한 변이체는 또한 마우스 모델에서 행동 운동 결핍이 발병하기 전에 신경근 접합부 (NMJ)에서 기능 장애 시냅스 전달을 일으킨다22. 이전에 FUS 발현 돌연변이체가 운동 결함 전에 FUS-ALS의 초파리 모델에서 NMJ에서 감소된 시냅스 전달을 초래한다는 것을 보여주었다11. C9orf72-확장 담체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포를 사용한 최근의 보고는 시냅스 소포의 쉽게 분리가능한 풀의 감소를 밝혀냈다23. 전체적으로, 이러한 연구와 다른 연구들은 ALS의 질병 관련 모델에서 시냅스 신호전달의 기초가 되는 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 이해를 구축하는 것의 중요성을 강조한다. 이것은 ALS의 병리학을 이해하고 환자를위한 잠재적 인 치료 목표를 개발하는 데 중추적 인 역할을 할 것입니다.
전류 및 전압 클램핑 셀의 방법은 컨덕턴스, 휴지 막 전위 및 개별 시냅스의 양자 함량과 같은 멤브레인 특성을 결정하는 데 매우 중요합니다20,24. 그러나 전기 생리학의 중요한 한계 중 하나는 기술적으로 도전적이며 한 번에 하나의 뉴런에서만 통찰력을 제공한다는 것입니다. 특정 형광 프로브와 결합 된 살아있는 세포 공초점 현미경 검사는 시공간 방식으로 뉴런의 시냅스 전달을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.25,26,27. 신경 흥분성의 직접적인 측정은 아니지만,이 형광 접근법은 시냅스 기능의 두 분자 상관 관계, 즉 시냅스 소포 방출과 시냅스 말단에서의 칼슘 과도 상태의 상대적 측정을 제공 할 수 있습니다.
작용 전위가 뉴런의 시냅스 전 말단 영역에 도달하면, 칼슘 과도 상태가 트리거되어 전기 신호에서 신경 전달 물질 방출 과정으로의 전환을 촉진합니다28. 이 영역에 국한된 전압 게이트 칼슘 채널은 칼슘 신호 전달을 엄격하게 조절하여 신경 전달 물질 방출의 동역학을 조절합니다29. 칼슘 과도 물질의 첫 번째보고 된 형광 기반 기록은 이중 파장 표시기 Fura-2 AM 또는 단일 파장 염료 Fluo-3 AM30,31,32를 사용하여 수행되었습니다. 이러한 염료는 당시에 큰 새로운 통찰력을 제공했지만, 세포 내 비특이적 구획화, 표지 된 세포로부터의 활성 또는 수동 염료 손실, 광표백 및 장기간에 걸쳐 이미징 된 경우 독성과 같은 몇 가지 한계로 고통 받고 있습니다33. 지난 수십 년 동안 유전적으로 인코딩 된 칼슘 지표는 다양한 형태의 신경 활동을 이미징하는 데 효과적이었습니다. 이 지표는 변형된 형광 단백질과 칼슘 킬레이터 단백질을 결합하여 Ca2+ 이온34의 결합 후 형광 강도를 빠르게 전환합니다. 이러한 새로운 지표의 적용은 광대하며, 시험관내 및 생체내 설정 모두에서 세포 내 칼슘 과도 상태를 훨씬 쉽게 시각화할 수 있습니다. GCaMP로 알려진 이러한 유전적으로 인코딩 된 기자의 한 가족은 현재 광범위하게 활용되고 있습니다. 이들 지표는 C 말단 칼모듈린 도메인을 함유하고, 이어서 녹색 형광 단백질(GFP)을 함유하고, N 말단 칼모듈린 결합 영역35,36에 의해 캡핑된다. 칼슘-도메인이 칼모듈린 결합 영역과의 상호작용을 촉발시켜, 전체 단백질 구조의 형태적 변화 및 GFP 모이어티35,36의 형광의 실질적인 증가를 초래한다. 수년에 걸쳐,이 기자 가족은 특정 동역학 (느리고, 중간, 빠름)을 가진 특정 칼슘 과도 상태에 대한 뚜렷한 판독을 가능하게하기 위해 몇 가지 진화를 거쳤으며, 각각은 약간 다른 특성을 가지고 있습니다37,38. 여기서, GcaMP6 리포터의 용도가 강조되었으며, 이는 생체내 및 시험관내 둘 다에서 뉴런에서 단일 작용 전위 및 수지상 칼슘 과도기를 검출하는 것으로 이전에 보여졌다37.
시냅스 전 영역의 칼슘 과도 상태는 시냅스 소포 융합 이벤트를 유발하여 시냅스 내로 신경 전달 물질 방출을 유발하고 시냅스 후 세포에서 신호 전달 이벤트를 시작합니다28,39. 시냅스 소포는 세포가 동종 정적으로 안정적인 세포막 표면적을 유지하고 융합 가능한 막 결합 소포의 쉽게 분리 가능한 풀을 유지하기 때문에 빠르게 방출되고 재활용됩니다40. 여기서 사용되는 스티릴 염료는 지질막에 대한 친화력을 가지며, 특히 주변 지질 환경의 순서에 따라 방출 특성을 변화시킨다41,42. 따라서, 그것은 시냅스 소포를 재활용하고 신경 자극 후 나중에 방출되는 이러한 소포의 후속 추적에 이상적인 도구입니다41,42. 생성되고 최적화 된 프로토콜은 Gaffield와 동료들에 의해 초기에 설명 된 개념의 적응이며, 이는 시간이 지남에 따라 스티릴 염료 표지 시냅스 베시클 누자를 지속적으로 시각화 할 수있게 해줍니다41.
여기에서, 두 개의 관련 형광-기반 방법론이 설명되고, 시냅스 전달에 관여하는 특정 세포 사건을 확실하게 보고한다. 프로토콜은 배양된 뉴런에서 탈분극 매개 시냅스 전 말단 칼슘 유입 및 시냅스 소포 외세포증의 역학을 조사하기 위해 정의되었다. 여기서, 방법 및 대표적인 결과는 일차 설치류 피질 또는 운동 뉴런을 시험관내 모델 시스템으로서 사용하는 것에 초점을 맞추고 있으며, 이들 세포 유형43,44을 이용한 발표된 연구가 있다. 그러나 이러한 방법은 분화 된 인간 i3 피질 유사 뉴런에도 적용 할 수 있습니다.45 우리 실험실에서 현재 진행중인 실험에서 두 프로토콜 모두에서 성공을 거두었습니다. 일반 프로토콜은 그림 1에 표시된 단계적 선형 형식으로 요약되어 있습니다. 간단히 말해서, 뉴라이트에서 칼슘 역학을 연구하기 위해, 성숙한 뉴런은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 37,46 하에 형광 리포터 GCaMP6m을 발현하기 위해 플라스미드 DNA로 형질감염된다. 형질감염된 세포는 낮은 수준의 기저 녹색 형광을 가지며, 이는 칼슘의 존재 하에서 증가한다. 관심 영역은 우리의 조작 전반에 걸쳐 형광 변화를 모니터링하기 위해 지정됩니다. 이를 통해 칼슘의 고도로 공간적, 시간적으로 국소화된 변동을 측정할 수 있습니다37,46. 시냅스 소포 융합 및 방출을 평가하기 위해, 성숙한 뉴런은 시냅스 전 세포에서 신경 전달 물질로 재활용, 변형 및 재장전됨에 따라 시냅스 소포막에 통합 된 스티릴 염료가 로딩됩니다41,42,43,47,48. 이 목적을 위해 사용되는 현재 염료는 신경돌기를 따라 시냅스 소포를 라벨링하고 Kraszewski와 동료49에 의해 스티릴 염료와 시냅토타민의 공동 염색에 의해 나타난 바와 같이 라이브 이미징 실험에서 이들 영역에 대한 프록시로 사용된다. 여기에는 유사한 염색이 또한 수행되었던 대표적인 이미지들이 포함된다(도 2A). 이전의 연구자들은 신경근 접합부와 해마 뉴런에서 시냅스 소포 역학을보고하기 위해 이러한 염료를 광범위하게 사용했습니다.48,49,50,51,52,53,54,55,56 . 염료가 로딩된 소포의 펑크 영역을 선택하고 소포 방출 후 형광 강도의 감소를 모니터링함으로써, 자극 후 기능적 시냅스 전달 능력 및 방출의 시간적 역학을 연구할 수 있다43. 두 방법 모두에 대해, 고농도의 염화칼륨을 함유하는 배지가 뉴런 활성을 모방하기 위해 세포를 탈분극시키기 위해 사용된다. 이미징 파라미터는 기준선 정규화에 걸친 서브초 간격을 캡처하고 자극 캡처 기간을 따르도록 지정됩니다. 각 시점에서의 형광 측정은 결정되고, 배경으로 정규화되고, 실험 기간에 걸쳐 정량화된다. 칼슘-매개 GCaMP6m 형광 증가 또는 효과적인 시냅스 베시클 엑소사이토시스 스티릴 염료 방출 형광 감소는 이러한 전략을 통해 검출될 수 있다. 이 두 프로토콜에 대한 자세한 방법론적 설정 및 매개 변수와 그 장점과 한계에 대한 논의는 아래에 설명되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg"> 그림 1: 전체 일반 프로토콜 프로세스의 시각적 렌더링. (1) 1차 설치류 뉴런을 시험관 내에서 분리하고 배양하여 선택된 성숙 시점으로 한다. (2) GCaMP DNA 또는 스티릴 염료를 시냅스 활성의 리포터로 도입한다. (3) 라이브 이미징이 장착 된 공초점 현미경 및 관련 소프트웨어를 사용하여 이미징 패러다임을 설정합니다. 초기 계획 기록 기간을 시작합니다. (4) 세포가 여전히 라이브 이미지 캡처를 겪고있는 동안, 높은 KCl 목욕 관류를 통해 뉴런을 자극하십시오. (5) 칼슘 과도 상태 또는 시냅스 소포 융합을 측정하기 위해 시간에 따른 형광 강도 측정을 평가합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>20x 공기 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미징용</td></tr><tr><td>40x 오일 이멀젼 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미징용</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504044</td><td>신경 성장 보충제</td></tr><tr><td>BD 주사기(바늘 없음), 50mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-689-8</td><td>중력 관류 어셈블리의 일부</td></tr><tr><td>생물안전성 세포 배양 후드</td><td>Baker</td><td>SterilGARD III SG403A</td><td>Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading</td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td>신경 세포 배양 및 유지 관리</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418</td><td>신경 세포 배양 준비용</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>223506</td><td>aCSF 용액의 구성 요소</td></tr><tr><td>세포 배양 CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-123</td><td>뉴런 배양 및 유지를 위한</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>뉴런 배양 준비용</td></tr><tr><td>Confocal microscope Nikon</td><td></td><td>Eclipse Ti +A1R core</td><td>형광 이미징용</td></tr><tr><td>CoolSNAP ES2&nbsp; CCD 카메라</td><td>광도 이미지</td><td></td><td>획득 용</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td>aCSF 용액의 구성 요소</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5025</td><td>신경 세포 배양 준비</td></tr><tr><td>용 여성, 시간 임신 Sprague Dawley 쥐</td><td>Charles river</td><td>400SASSD</td><td>배아 피질 및 척추 운동 뉴런 배양 준비</td></tr><tr><td>용 FITC 필터 큐브</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>Gcamp 칼슘 과도 현상</td></tr><tr><td>이미징 FM4-64 스티릴 염료</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td>시냅스 소포 방출 이미징 유리</td></tr><tr><td>바닥 페트리 접시 (두께 #1.5)</td><td>CellVis</td><td>D35-10-1.5-N</td><td>이미징 호환 배양 접시의 뉴런 성장용</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Grainger</td><td>52NK56</td><td>뉴런 배양 준비용</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6648</td><td>신경 배양 준비용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>CSF 용액의 구성 요소</td></tr><tr><td>High KCl 인공 뇌척수액(aCSF)</td><td></td><td></td><td>이미징용. 레시피를 참조하십시오 *</td></tr> <tr><td>말 혈청</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1138</td><td>뉴런 배양 및 유지 관리</td></tr><tr><td>Laminar flow dissection hood</td><td>NUAIRE</td><td>NU-301-630</td><td>신경 세포 배양 준비</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017015</td><td>신경 세포 배양 준비</td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11415064</td><td>For 신경 세포 배양 준비</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red</td><td>Thermo Scientific</td><td>21083027</td><td>신경 세포 배양 준비용</td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030149</td><td>신경 세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>11668019</td><td>신경 세포 배</td></tr>양 Low <tr><td>KCl 인공 뇌척수 유체(aCSF)</td><td></td><td></td><td>이미징용. 레시피를 참조하십시오</td></tr>*<tr><td>염화마그네슘</td><td>Millipore Sigma</td><td>208337</td><td>CSF 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>데이터 분석/정규화를 위한</td><td>Microsoft</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>Nalgene&nbsp; 필터 단위, 0.2 & 마이크로; m PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>565-0020</td><td>CSF 용액용 필터 유닛</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103049</td><td>신경 세포 배양 및 유지 관리용</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>이미지 캡처 및 분석을 위한</td><td>Nikon</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>Nunc 15 mL 원추형 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>신경 세포 배양 및 완충액 준비용 용액</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 코니컬 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>신경 세포 배양 및 완충 용액</td></tr><tr><td>준비용 Optiprep</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>신경 세포 배양 준비용</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4762</td><td>신경 세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td> 준비<td>용Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>신경 세포 배양의 박테리아 오염을 방지하기 위해</td></tr><tr><td>관류 시스템</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>관류 튜브</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-30526-14</td><td>교환용 중력 관류 어셈블리의 일부</td></tr><tr><td>pGP-CMV-Gcamp6m 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>40754</td><td>칼슘 과도 현상 이미징용</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7886</td><td>유리 바닥 페트리 접시 용 코팅제</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>aCSF 용액의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td>aCSF 용액의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>염화나트륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>aCSF 솔루션의 구성 요소</td></tr><tr><td>스테이지 탑 인큐베이터</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td>이미징 기간 동안 살아있는 뉴런의 배양용</td></tr><tr><td>TRITC Filter cube</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>이미징용 FM4-64</td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>Millipore Sigma</td><td>T6414</td><td>뉴런 배양</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td>뉴런 배양 준비용</td></tr><tr><td>진동 격리 테이블</td><td>New Port</td><td>VIP320X2430-135520</td><td>현미경용 테이블/스탠드</td></tr></tbody></table>

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

신경 세포 변성 전에, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 / 또는 전측두엽 치매 (FTLD) 환자의 운동 및인지 결핍의 원인은 뉴런과 운동 뉴런과 근육 사이의 의사 소통의 기능 장애입니다. 시냅스 전달의 기본 과정은 막 탈분극 의존성 시냅스 소포 융합과 신경 전달 물질의 시냅스 방출을 포함합니다. 이 과정은 시냅스 소포가 상주하는 시냅스 전 말단으로 국부적 인 칼슘 유입을 통해 발생합니다. 여기서, 상기 프로토콜은 배양된 뉴런에서 탈분극-매개 시냅스 소포 엑소사이토시스 및 시냅스 전 말단 칼슘 유입 역학을 안정적으로 보고하는 형광 기반 라이브 이미징 방법론을 기술한다.
시냅스 소포 막에 혼입되는 스티릴 염료를 사용하여, 시냅스 소포 방출이 해명된다. 한편, 칼슘 유입을 연구하기 위해 Gcamp6m은 유전적으로 인코딩 된 형광 리포터로 사용됩니다. 우리는 높은 염화칼륨 매개 탈분극을 사용하여 신경 활동을 모방합니다. 시냅스 소포 엑소사이토시스를 명확하게 정량하기 위해, 우리는 시간의 함수로서 정규화된 스티릴 염료 형광의 손실을 측정한다. 유사한 자극 조건 하에서, 칼슘 유입의 경우, Gcamp6m 형광이 증가한다. 이러한 형광 변화의 정규화 및 정량화는 스티릴 염료 프로토콜과 유사한 방식으로 수행된다. 이들 방법은 형광 태깅된 돌연변이체 단백질의 형질감염-기반 과발현으로 다중화될 수 있다. 이러한 프로토콜은 일차 설치류 피질 및 운동 뉴런을 활용하여 FUS-ALS 및 C9ORF72-ALS 모델에서 시냅스 기능 장애를 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은 뉴런 통신을 개선할 수 있는 화합물의 신속한 스크리닝을 쉽게 허용한다. 따라서 이러한 방법은 ALS 연구뿐만 아니라 신경 퇴행성 및 발달 신경 과학 연구의 모든 분야에 유용합니다.

상기 프로토콜의 성공적인 구현에 이어서, 전형적인 스티릴 염료 시냅스 베시클 방출 실험에 대한 대표적인 결과가 제시된다. 배양된 래트 일차 피질 뉴런은 섹션 6에 기재된 방법을 사용하여 염료를 로딩하였다. 염료 로딩의 특이성은 시냅스 소포 마커 시냅토피신과의 공동 표지에 의해 결정되었다. 스티릴 염료 양성 펑타의 대다수는 이 마커에 대해 공동-양성이다(도 2A). 스티릴 염료 이미징에 사용되는 설정이 광표백을 유발하는지 여부를 결정하기 위해, 전형적으로, 처리되지 않은 웰에는 염료가 로딩되고 형광 값이 일정하게 유지되도록 자극없이 연장 된 10 분 기간 동안 이미징됩니다.
추가적으로, 결과는 도 2A에서와 같이 시냅토피신 및 스티릴 염료의 공동표지를 사용하여 다시 나타내었다. 이들 형광단은 TRITC 스티릴 염료 이미징을 위해 섹션 6에 표시된 패러다임을 사용하여 공동 이미...

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

이러한 방법은 실험적 조작, 질병 원인 단백질 또는 RNA가 시냅스 과정에 영향을 줄 수 있는지, 치료 화합물이 기능을 회복 할 수 있는지 여부에 대한 신속한 평가를 가능하게합니다. 이러한 기술은 전기 생리학에 비해 비교적 짧은 시간 내에 뉴런 그룹으로부터 시냅스 기능의 신뢰할 수있는 판독을 제공합니다. 이 프로토콜은 뉴런 발달 또는 퇴행의 임의의 질환에 적용될 수 있다.이것은 일차 설치류 뉴런 배양 및 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 뉴런에 잘 작동합니다. 시작하려면 공초점 이미징 수집 소프트웨어를 사용하여 이미지 수집 설정을 최적화하십시오. 여기 전력 노출 시간, 검출기 게인 및 프레임 속도를 모든 샘플에서 일정하게 유지하십시오.시간 경과 이미징의 경우 512 x 512의 종횡비와 초당 두 이미지의 프레임 속도를 선택하여 염료 표백을 최소화하십시오. 그런 다음 Fitzy 및 Trixi가있는 stearoyl 염료가있는 GCaMP six M / GCaMP 세 가지에 대한 형광 여기, 이색성 및 방출 필터 조합을 선택하십시오. 타임랩스 이미징 중에 Z 드리프트를 방지하려면 공초점 이미징 수집 소프트웨어의 완벽한 초점 기능을 사용하십시오.그런 다음 이미지 수집 패널에서 시간 탭을 선택하십시오. 단계 1의 경우 간격을 500밀리초로 설정하고 지속 시간을 3~5분으로 설정합니다. 그리고 두 번째 단계의 경우 간격을 500 밀리 초로 설정하고 지속 시간, 5 분을 설정하십시오.그런 다음 인공 뇌척수액 또는 ACSF용 중력 관류 장치를 조립하기 위해 고 염화칼륨 ACSF 버퍼를 장치 상단의 50 밀리리터 주사기에 넣고 유량을 분당 한 밀리리터로 설정합니다. 그런 다음 뉴런이 들어있는 35 밀리리터 유리 접시를 공초점 이미징 단계에 넣고 접시 가장자리에 놓인 관류 튜브의 끝과 이미징 필드를 선택하십시오. 형질감염 후 48시간에, 섭씨 37도에서 10분 동안 저염화칼륨 ACSF 완충액에서 일차 피질 또는 운동 뉴런을 인큐베이션한다.그런 다음 흡인에 의해 버퍼를 제거하고 피펫을 사용하여 어둠 속에서 뉴런을 50 밀리몰 염화칼륨 및 10 마이크로 몰 스티릴 염료를 함유하는 ACSF로 채워진 유리 바닥 페트리 접시에 로딩한다. 5분 후, 로딩 용액을 제거하고 뉴런을 섭씨 37도에서 저염화칼륨 ACSF 버퍼에서 10분 동안 목욕시켜 비특이적 염료 로딩을 제거하였다. 그런 다음 접시를 거꾸로 된 공초점 현미경의 이미징 단계 위에 놓고 20 배 공기 목표 또는 40 배 오일 침지 목표 하에서 세포를 관찰하십시오.546 나노미터 레이저를 사용하여 강철 염료를 여기시키고 570 내지 620 나노미터 대역통과 필터를 사용하여 방출을 수집한다. 이미징 필드를 선택하고 완벽한 초점을 맞춘 후 밝은 필드, Trixi 및 형광 마커 채널로 단일 스틸 이미지를 촬영하여 신경 경계를 표시하십시오. 그런 다음 획득 소프트웨어에서 Run Now를 시작하고 염료 강도의 변화를 배제하기 위해 삼 ~ 다섯 분 동안 기본 녹음을 수행하십시오.두 번째 단계로 전환하는 바로 단계에서 관류 시스템의 온 버튼을 트리거하고 50 밀리몰 염화칼륨을 뉴런에 지속적으로 관류하여 염료 언로드를 용이하게합니다. 다섯 분 동안 녹음을 수행 한 다음 관류 시스템의 꺼짐 스위치를 트리거하십시오. 나중에 공초점 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 위해 실험을 저장합니다.GCaMP six M으로 형질감염 후 48시간, 15분 동안 저염화칼륨 ACSF로 일차 설치류 피질 뉴런을 인큐베이션한다. 그런 다음 접시를 이미징 플랫폼에 장착하고 Fitzy 필터와 20 배 또는 40 배 목표를 사용하여 GCaMP 여섯 M 형광을 시각화했습니다. 이미징 필드를 선택하고 완벽한 초점을 맞춘 후 밝은 필드, Fitzy 및 형광 마커 채널로 단일 스틸 이미지를 촬영하여 신경 경계를 표시하십시오.그런 다음 획득 소프트웨어에서 Run Now를 시작하고 삼 ~ 다섯 분 동안 기본 녹음을 수행하십시오. 그런 다음 이전에 입증 된 바와 같이 50 밀리몰 염화칼륨을 함유 한 ACSF를 뉴런에 관류하고 5 분 동안 기록하십시오. 이미지 수집이 중지되면 실험을 저장하고 공초점 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행하십시오.이미지 분석을 위해 공초점 소프트웨어에서 타임랩스 이미지를 열고 이미지를 클릭하여 이미지를 정렬한 다음 처리한 다음 현재 문서를 정렬한 다음 첫 번째 프레임에 정렬을 선택합니다. ROI 선택 도구를 사용하여 신경돌기를 따라 관심 영역을 선택하고 배경 형광 강도를 나타내는 ROI를 표시합니다. 다음으로, 시간 측정 패널에서 측정 기능을 시작하여 선택한 ROI에 대한 시간에 따른 원시 형광을 측정합니다.측정 후 원시 형광 강도를 스프레드 시트 소프트웨어로 내보냅니다. 배양된 래트 일차 피질 뉴런에 스티릴 염료가 로딩되어 여기에 도시되어 있다. 염료 로딩의 특이성은 시냅스 베시클 마커 시냅토피신과의 공동 표지에 의해 결정되었고, 대부분의 멸균 염료 양성 펑타는이 마커에 대해 공동 양성이다.전체 이미징 기간 동안 원시 강도 값을 분석한 결과, 시냅토피신과 강도는 일정하게 유지되는 반면 스티릴 염료 강도는 자극 후 감소한다는 것을 알 수 있습니다. 녹색 형광 단백질 형질감염된 대조군 뉴런의 경우, 성공적인 시냅스 소포 방출은 높은 염화칼륨 탈분극시 염료 형광의 현저한 손실을 초래했다. 이 대표적인 비디오는 자극 후 새로운 오른쪽 영역에서 스티릴 염료를 선택적으로 언로딩하는 뉴런을 보여준다.대조적으로, GA 50에 염료 펩티드 반복 작제물에 연결된 C9 ORF 72로 형질감염된 뉴런에서, 손상된 시냅스 투과는 높은 염화칼륨 탈분극 후에도 보유된 염료 형광으로 나타난다. GCaMP 식스 M 염화칼륨 탈분극 전후의 피질 뉴런의 대표적인 형광 이미지가 여기에 제시되어 있다. 증가된 형광 값 및 GCaMP six M으로 형질감염된 피질 뉴런은 염화칼륨 유도 탈분극 후 신경돌기로의 칼슘 진입을 나타낸다.기준선 기록 기간의 끝에서, 뉴런은 낮은 형광을 갖는 GCaMP 식스 M을 발현하였다. 극적인 형광 증가는 자극의 시작에서 관찰된다. 스티릴 염료 및 GCaMP에 대한 형광 기준선 기록이 안정적인지 확인하십시오.이미지 드리프트를 피하기 위해 항상 완벽한 초점을 사용하므로 포스트 이미지 데이터 처리가 어려워집니다. 뉴런의 추가 배양은 요리가 번식하는 동안 공기에 노출되기 때문에 권장되지 않습니다. 그러나, 단백질 또는 RNA의 면역 염색 또는 추출은 시냅스 변화의 잠재적 원인을 평가할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 단일 피질 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소를 평가하는 방법을 보여줍니다. 전기 자극은 시냅스에서 글루타메이트 방출을 촉진합니다. 방출된 글루타메이트는 시간이 지남에 따라 감소하는 센서 단백질의 형광을 변경하여 방출 및 제거 효율을 나타냅니다.

Analyzing the Glutamate Release and clearance at a single neuroron synapse(마우스 뇌 절편의 단일 뉴런 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소)

출처: Krishnamurthy, K. et al. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 유전적으로 암호화된 칼슘 바이오센서를 발현하는 ALS 돌연변이 뉴런의 시냅스 활동을 모니터링하기 위한 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다. 뉴런 시냅스 활동을 반영하는 세포 내 칼슘 수치의 실시간 변화를 측정하기 위해 이미징, 칼슘 역학 자극 및 형광 기록을 위해 뉴런을 준비하는 단계를 간략하게 설명합니다.

Fluorescence Imaging of Synaptic Calcium Dynamics in an In Vitro Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis(근위축성 측삭 경화증의 시험관 내 모델에서의 시냅스 칼슘 역학의 형광 이미징)

신경근 접합부(NMJ)는 때때로 시냅스 실패로 이어질 수 있는 다양한 조건에서 변경됩니다. 이 보고서는 이러한 구조적 변화를 정량화하기 위한 형광 현미경 기반 방법을 설명합니다.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

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효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

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우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

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근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

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