Name: 선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 선택적 리보솜 프로파일링을 통해 Saccharomyces cerevisiae에서 공동 번역 상호 작용을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 단백질 접힘 및 기능적 프로테옴 유지 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다.

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우리는 유익한 토론을 해준 모든 실험실 구성원들과 원고의 비판적 독서에 대한 무하마드 Makhzumy에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 ISF (이스라엘 과학 재단) 보조금 2106/20에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기서, 프로토콜은 코돈 분해능에 가까운 공동-번역 상호작용을 캡처하기 위한 선택적 리보솜 프로파일링 접근법을 상세히 설명한다. 리보솜이 붐비는 세포질로 출현하는 초기 사슬을 조정하기위한 허브로 상승함에 따라, 이것은 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병을 연구하는 데 필요한 다양한 공동 번역 상호 작용을 확인하고 특성화하는 중요한 방법입니다. 현재까지, SeRP는 생체내14,15,16에서 직접적인 방식으로 이러한 상호작용을 포착하고 특성화할 수 있는 유일한 방법이다.
첫 번째이자 가장 중요한 단계는 세포 수집과 용해입니다. 몇 초 안에 진행중인 번역을 플래시 동결 후 동결 상태에서 용해하여 캡처하는 것이 필수적입니다. 세포 수집은 리보솜 유출을 피하고 빠르게 발생할 수있는 스트레스 번역 반응을 ...

Se lective Ribosome Profiling (SeRP)은 현재까지 1,2,3,4,5,6 직접적인 방식으로 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하고 특성화하는 유일한 방법입니다. SeRP는 코돈 분해능 2,7에 가까운 리보솜을 번역하는 모든 인자의 상호작용에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 한다.
이 방법은 성장하는 세포의 플래시 동결과 활성 번역 보존에 의존합니다. 이어서, 세포 용해물은 RNase I로 처리되어 "리보솜 발자국"으로 불리는 리보솜-보호된 mRNA 단편을 제외한 세포 내의 모든 mRNA를 소화시킨다. 그런 다음 샘플을 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 모든 세포 리보솜 발자국의 분리에 직접 사용되며, 이는 세포에서 진행중인 모든 번역을 나타냅니다. 두 번째 부분은 관심 인자와 관련된 리보솜의 특정 서브세트의 친화도-정제를 위해 사용된다: 예를 들어: 변형 효소, 전좌 인자, 폴딩 샤페론, 및 복합체-어셈블리 상호작용. 친화도 정제된 리보솜 발자국은 집합적으로 인터랙텀(interactome)이라고 불린다. 이어서, 리보솜-보호된 mRNA를 추출하고 cDNA 라이브러리 생성에 사용하고, 이어서 딥 시퀀싱을 수행한다.
전체 트랜스라톰 및 인터랙토메 샘플의 비교 분석은 관심 인자와 관련된 모든 orfs의 동정뿐만 아니라 각 orf 상호작용 프로파일의 특성화를 허용한다. 이 프로파일은 정확한 결합 개시 및 종결 서열을 보고하며, 이로부터 해독된 코돈 및 신흥 폴리펩티드 쇄의 각각의 잔기를 추론할 수 있을 뿐만 아니라, 상호작용 동안 리보솜 속도 변이(7,8)에 대해서도 보고한다. 그림 1은 프로토콜을 회로도로 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg"> 그림 1: SeRP 프로토콜의 개요 이 프로토콜은 7-10 일 이내에 전체적으로 수행 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>3'-인산화된 28 nt RNA 제어 올리고뉴클레오티드</td><td>IDT</td><td>맞춤 주문</td><td>RNase 무료 HPLC 정제; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolute</td></tr> <tr><td>ethanol</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>Acid phenol&ndash; chloroform</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>항체: mouse monclonal anti-HA</td><td>Merck</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>박토 효모 추출물</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>베스타틴 염산염</td><td>로스</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>머크</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase II ssDNA 리가제 *</td> <td>진앙지</td><td>CL9025K</td><td>100 U/&mu; L</td></tr><tr><td>콜로이드 Coomassie 염색 용액</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리 및 멸균 여과수 *</td> <td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose 무수</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>DNA 로딩 염료*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0631</td><td>6&times;</td></tr><tr><td>DNase I, 재조합</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>RNAse free</td></tr><tr><td>dNTP 솔루션 세트*</td><td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA*</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR</td><td>24388.260.</td><td></td></tr><tr><td>글리신 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 mg / mL</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF Phusion 중합 효소 *</td> <td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>HK S. cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필&베타;-D-1-티오갈락토피라노시드</td><td>로스</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>로스</td><td>T832.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>로스</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴</td><td>로스</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>링커 L(rt)</td><td>IDT</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Roth</td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td>AM97606</td><td>5 M</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>NHS 활성 세파로스 4 고속 흐름 비드</td><td>GE Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 대체</td>품 <td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>프리캐스트 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% 및 12%</td></tr><tr><td>RNase I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS, 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>아세트산나트륨*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M, pH 5.5</td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Merck</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Roth</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase 억제제</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transciptase*</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold*</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제*</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 2*</td><td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>TBE 폴리아크릴아미드 겔*</td><td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; 요소 폴리아크릴아미드 겔*</td><td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; 요소 폴리아크릴아미드 겔*</td><td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; 요소 샘플 버퍼*</td><td>Novex</td><td>LC6876</td><td>2회;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9851</td><td>1 M, pH 7.0</td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>1 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure 10&times; TBE 버퍼*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - 라이브러리 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가스켓 및 스프링 클램프, 90 mm,</td> <td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>XX1009020</tr><tr><td>접지 조인트 플라스크 1 L,</td> <td>Millipore</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

최근 몇 년 동안, 리보솜은 우리의 mRNA를 해독 할뿐만 아니라 혼잡 한 세포 환경으로 폴리펩티드 사슬의 출현을 안내한다는 것이 분명 해졌다. 리보솜은 막 표적화 인자의 공간적 및 동역학적으로 조절된 결합, 효소 변형 및 접이식 샤페론을 위한 플랫폼을 제공한다. 심지어 고차 올리고머 복합체로의 조립뿐만 아니라 단백질-단백질 네트워크 형성 단계도 합성과 배위되는 것으로 최근에 발견되었다.
여기에서는 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하기 위해 개발 된 방법 인 선택적 리보솜 프로파일 링 에 대해 설명합니다. 우리는 공동 번역 상호 작용기와 함께 리보솜 - 초기 사슬 복합체를 캡처하는 데 필요한 다양한 친화성 정제 단계뿐만 아니라 mRNA 추출, 크기 배제, 역전사, 딥 시퀀싱 및 빅 데이터 분석 단계를 자세히 설명합니다 거의 코돈 분해능에서 공동 번역 상호 작용을 해독하는 데 필요합니다.

이 프로토콜의 흐름도(도 1)에 예시된 바와 같이, 세포를 로그 페이즈로 성장시킨 다음, 여과에 의해 신속하게 수집하고, 극저온 분쇄에 의해 용해시켰다. 그런 다음 용해물을 두 개로 나눴습니다: 하나는 총 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고 다른 하나는 선택된 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고, 우리는 태그된 단백질-리보솜-초기 사슬 복합체를 풀다운하기 위해 친화성 정제를 수행했다. 우리는 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 태그된 단백질 발현 및 풀다운의 성공을 웨스턴 블롯 분석에 의해 보장하였다. 우리는 작은 RNA 전기영동(2100 BioAnalyzer 시스템)에 의해 일반적으로 20-45nt 길이인 리보솜 보호 풋프린트의 분리를 검증하여 시스템 매뉴얼에 따라 5-10nt 크기 시프트 검출을 가능하게 했습니다(그림 3). 그런 다음 심층 시퀀싱...

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

공동 번역 상호 작용은 접이식 및 조립 경로를 목표로하는 초기 체인 수정에 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아 모델에서 이러한 상호작용의 생체내 직접 분석을 위한 방법을 설명한다. 선택적 리보솜 프로파일링은 생체 내에서 공동-번역 상호작용을 직접적인 방식으로 캡처하고 특성화하는 현재까지 유일한 방법이다.선택적 리보솜 프로파일링은 모든 인자에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 하고, 리보솜을 거의 코돈 분해능으로 번역하는 상호작용을 가능하게 합니다. 원하는 태그된 단백질을 함유하는 구축된 효모 세포를 수집함으로써 시작한다. 믹서 밀에서 극저온 분쇄를 사용하여 세포 용해를 30 헤르츠에서 두 분 동안 두 번 수행하십시오.섭씨 네 도에서 30, 000배 G에서 두 분 동안 원심분리하여 용해물을 제거하고, 상층액을 수집한다. 200 마이크로리터의 상층액을 총 RNA 분석을 위해 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 700 마이크로리터를 면역정제를 위해 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다. 이전에 분리된 총 RNA 샘플을 분당 30회 회전으로 회전 혼합 랙 상에서 섭씨 4도에서 25분 동안 RNase I의 10 유닛을 사용하여 소화한다.텍스트 원고에 설명 된대로 자당 쿠션 마스터 믹스를 준비하십시오. 이어서, 샘플을 400 마이크로리터의 수크로오스 쿠션 상에 로딩하고, 섭씨 4도에서 245, 000배 G 및 4도에서 90분 동안 원심분리한다. 진공 펌프로 상층액을 신속하게 제거하고 150 마이크로 리터의 용해 버퍼로 펠렛을 오버레이하십시오.파라핀 랩으로 샘플을 고정하고 분당 300 회전으로 섭씨 4도에서 한 시간 동안 흔들어 펠렛을 재현탁하십시오. 친화성 매트릭스를 용해 완충제 내에 재현탁시킴으로써 샘플 당 100 내지 400 마이크로리터의 친화성 결합 매트릭스를 1 밀리리터의 용해 완충액으로 세 번 세척한다. 그런 다음 섭씨 4도에서 회전하는 혼합 랙을 사용하여 분당 30 회전으로 5 분 동안 회전하십시오.원심분리에 의해 침전시킨다. 상부 액체를 버리고이 과정을 세 번 반복하십시오. 이전에 분리된 면역-정제 샘플에 친화성 결합 매트릭스를 첨가하고, RNase I.Rotate를 사용하여 단백질을 친화성 매트릭스에 결합시키기 위해 회전 혼합 랙으로 분당 30회 및 섭씨 4도에서 25분 동안 소화시킨다.텍스트 원고에 설명된 대로 세척 완충액 마스터 믹스를 준비한다. 친화성 결합 매트릭스를 약 1분 동안 한 밀리리터의 세척 완충액으로 세척하고, 혼합 랙에서 회전시킨다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30초 동안 3000배 G에서 원심분리하여 침전시키고 상부 액체를 버린다.세 번 반복하십시오. 한 밀리리터의 세척 버퍼에서 두 번 더 씻고, 매번 다섯 분 동안 믹스 랙에서 회전시킵니다. 원심분리에 의해 다시 침전시킨다.동일한 양의 2X 샘플 버퍼로 단백질 용출을 위해 50 마이크로 리터의 비드를 사용하십시오. 원심분리하여 비드를 펠릿화하고 상부 액체를 버린다. 700 마이크로 리터의 10 밀리몰 트리스로 희석하십시오.그런 다음 액체 질소에서 동결하십시오. 샘플을 액체 질소로부터 제거하고 영하 80도에서 저장하여 후속 RNA 추출에 사용한다. 친화성 매트릭스에 대한 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 태그가 지정되지 않은, 야생형 균주 상에서 모의 IP를 사용하여 각 단계의 분취량으로 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 염색에 의한 친화성 정제 단계의 성공을 평가한다.친화성 정제 후의 웨스턴 블롯 결과는 태그된 단백질 발현의 성공을 입증하였다. 리보솜-보호 발자국의 분리는 바이오분석기로부터의 결과를 사용하여 검증되었다. 심층 시퀀싱 및 빅 데이터 분석을 위한 cDNA 라이브러리를 생성하는 동안, 언더사이클링은 낮은 수율로 이어집니다.그러나, dNTPs가 여전히 존재하면, 반응이 진행되어, PCR 산물 자체를 프라이밍하기 때문에 키메라 서열로 더 긴 PCR 아티팩트를 생성한다. 생성된 라이브러리는 정확한 크기 분포 및 정량화를 위해 고감도 DNA 전기영동에 의해 추가로 검증되었다. 서열 라이브러리는 어댑터 및 바코드에 대해 트리밍되었고, 결과 판독은 코딩 서열, 인트론 및 인터제닉 서열의 상이한 그룹으로 분할되었다.Vma2p와 리보솜-관련 샤페론 Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p의 공동 번역 상호작용을 분석하는 리보솜 프로파일은 각 친화성 정제의 실험 계획과 함께 여기에 도시되어 있다. Ssb1, Pfk2p 및 Fas1p 상호 작용과 비교하여 총 반역의 열린 판독 프레임을 따라 리보솜 점유가있었습니다. 개방 판독 프레임을 따라 각각의 리보솜 위치에서 Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p의 평균 농축이 여기에 도시되어 있다.이 방법은 다양한 공동 번역 상호 작용의 확인 및 특성화를 가능하게하여 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병에 대한 연구를 가능하게합니다. 현재까지, 선택적 리보솜 프로파일링은 생체내에서 직접적인 방식으로 이러한 상호작용을 포착하고 특성화할 수 있는 유일한 방법이다.

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Biology

생물학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

리보솜을 번역하면 코돈 당 세 개의 뉴클레오티드를 펩티드로 해독합니다. 리보솜 프로파일링에 의해 포착된 mRNA를 따른 그들의 움직임은 특징적인 삼중항 주기성을 나타내는 발자국을 생성한다. 이 프로토콜은 RiboCode를 사용하여 리보솜 프로파일링 데이터에서 이 두드러진 기능을 해독하여 전체 전사체 수준에서 활발하게 번역된 열린 판독 프레임을 식별하는 방법을 설명합니다.

데 노보 리보솜 프로파일링 데이터를 사용하여 능동적으로 번역된 오픈 리딩 프레임 식별

학습하세요 선택적 리보솜 프로파일링을 통해 Saccharomyces cerevisiae에서 공동 번역 상호 작용을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 단백질 접힘 및 기능적 프로테옴 유지 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

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