Name: Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 고해상도 이미징을 위한 미세유체 칩 설계 및 제작 방법을. 이 기술은 36시간까지 연속 영양 공급과 세포 수준 관찰이 가능합니다.

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우리는 CIFF 이미징 시설, NCBS가 DST - 나노 기술 센터에서 지원하는 컨포칼 현미경을 사용해 주셔서 감사합니다. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK 및 Gautam Menon)가 지원하는 스피닝 디스크, HHMI-IECS 보조금 번호 55007425 (SPK)의 연구 자금에 감사드립니다. HB101, PS3239 및 wdIs51 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에서 제공했습니다. SPK는 Mike Nonet의 실험실에서 jsIs609 를 만들었습니다.

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S.M. 및 SPK는 미세유체 성장 및 이미징 장치에 대한 출원 중인 특허(특허 출원 번호 640/CHE/2011)의 저자입니다.

이 논문에서는 개발 과정에서 단일 동물의 지속적인 식량 공급과 고해상도 이미징으로 C. elegans 를 성장시키기위한 간단한 미세 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되었습니다. 이 제조 공정은 간단하며 비멸균 환경에서 수행할 수 있습니다. 먼지가 없는 환경은 제조 단계에서 매우 중요합니다. 먼지 입자가 있으면 두 접합 표면 사이에 부적절한 접촉이 발생하여 C. elegans 가 고정되어있는 동안 고압 적용 중에 장치의 접착 불량 및 누출이 발생합니다. 제작 된 모든 장치 중에서 장치의 95 %가 실험에 적합합니다. 제조 또는 사용 중 부적절한 접착으로 인해 소수의 장치가 고장납니다(5%). 접착 실패는 전 세계 여러 학술 기관에서 사용할 수 있는 먼지가 없는(> 1,000등급 클린룸) 내부에서 제조 공정을 수행함으로써 줄일 수 있습니다. 흐름 채널에서 박테리아 음식을 청소하고 장치를 재사용하려면 모든 실험 후에 알코올을 흘려 장치를 세척하십시오. 
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Caenorhabditis elegans는 세포 생물학, 노화, 발달 생물학 및 신경 생물학을 연구하는 강력한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 투명한 몸체, 짧은 수명주기, 쉬운 유지 관리, 정의 된 수의 세포, 여러 인간 유전자와의 상 동성 및 잘 연구 된 유전학과 같은 장점으로 인해 C. elegans는 기초 생물학 발견과 응용 연구 1,2 모두에서 인기있는 모델이되었습니다. 개별 동물에 대한 반복적 인 장기 관찰을 통해 세포의 생물학적 및 발달 과정을 이해하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 통상적으로, C. elegans는 한천 패드에 마취되고 현미경으로 이미지화된다. 동물의 건강에 대한 마취제의 부작용은 동일한 동물의 장기간 및 반복 간헐적 인 영상에 마취 된 동물의 사용을 제한합니다 3,4. 최근 미세 유체 기술의 발전과 건강 위험이 무시할 수있는 C. elegans의 마취없는 포획에 대한 적응은 단기간에 걸쳐 동일한 동물의 고해상도 이미징을 가능하게합니다.
미세 유체 칩은 C. elegans'5 고 처리량 스크리닝 6,7,8, 트래핑 및 분배9, 약물 스크리닝 10,11, 고해상도 이미징 12 및 동물의 고해상도 이미징12,13,14을 위해 설계되었습니다. 슬라이드 상의 고정화를 위한 초박형 마이크로유체 시트가 또한 개발되었다(15). C. elegans에 대한 장기 연구는 성장, 칼슘 역학, 행동에 대한 약물 효과16,17,18,19, 수명및 노화 20를 관찰하기 위해 액체 배양에서 자라는 동물의 저해상도 이미지를 사용하여 수행되었습니다. 고분해능 현미경을 사용한 장기 연구는 시냅스 발달21, 뉴런 재생22 및 미토콘드리아 추가23을 평가하기 위해 수행되었습니다. 세포 운명 및 분화의 장기 고해상도 이미징 및 추적은 다중 채널 장치24,25에서 수행되었습니다. 여러 세포 및 하위 세포 사건은 몇 시간의 시간 규모에 걸쳐 발생하며 생체 내 세포 역학을 이해하기 위해 프로세스의 모든 중간 단계를 특성화하기 위해 발달 중 다른 시점에서 동일한 개체를 포획해야 합니다. 기관 형성, 신경 발달 및 세포 이동과 같은 생물학적 과정을 이미지화하려면 동물이 여러 시점에서 동일한 방향으로 고정되어야 합니다. 우리는 이전에 터치 수용체 뉴런(TRN)23을 따라 미토콘드리아가 추가되는 위치를 결정하기 위해 36시간 이상 동안 C. elegans의 고해상도 이미징을 위한 프로토콜을 발표했습니다.
이 논문은 반복적인 고해상도 이미징을 위한 미세유체공학 기반 방법론을 확립하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 단일 흐름 채널이 있는 이 장치는 장치당 단일 동물의 반복 이미징에 가장 적합합니다. 처리량을 개선하고 한 번에 많은 동물을 이미지화하기 위해 여러 장치를 동일한 압력 라인에 연결할 수 있지만 각 장치에서 단일 동물을 제어하는 별도의 3방향 커넥터를 사용할 수 있습니다. 이 디자인은 배아 후 발달 과정, 세포 이동, 세포 소기관 수송, 유전자 발현 연구 등과 같은 고해상도 타임랩스 이미지를 요구하는 연구에 유용합니다. 이 기술은 많은 후기 단계의 동물의 병렬 성장 및 이미징이 필요한 수명 및 노화 연구와 같은 일부 응용 분야에서 제한 될 수 있습니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 엘라스토머는 생체 안정성26, 생체 적합성 27,28, 가스 투과성 29,30 및 조정 가능한 탄성 계수 31로 인해이 장치를 제조하는 데 사용되었습니다. 이 2 층 장치는 미세 유체 채널에서 지속적인 먹이 공급으로 동물의 성장과 질소 가스를 사용한 PDMS 막 압축을 통해 개별 C. elegans의 포획을 허용합니다. 이 장치는 연속적인 식품 공급 하에서 마이크로 채널에서 동일한 동물을 성장시키고 이미징하는 이점을 가진 이전에 공개 된 장치의 확장입니다3. 추가 격리막 네트워크와 2mm 너비의 포획 멤브레인은 발달 중인 동물을 효율적으로 고정할 수 있습니다. 이 장치는 감각 PVD 뉴런에서 신경 발달, 외음부 발달 및 수지상 수목 수목을 관찰하는 데 사용되었습니다. 동물은 장치에서 건강에 악영향을 미치지 않고 성장하며 발달 중에 동일한 동물에서 이미징 하위 세포 이벤트를 용이하게하기 위해 반복적으로 고정 될 수 있습니다.
전체 프로토콜은 다섯 부분으로 나뉩니다. 파트 1에서는 성장 및 이미징 칩의 장치 제작에 대해 설명합니다. 파트 2에서는 개별 C. elegans를 고정하고 분리하기 위해 PDMS 멤브레인 편향에 대한 압력 시스템을 설정하는 방법을 설명합니다. 3부에서는 장치 이미징을 위해 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 C. elegans를 동기화하는 방법을 설명합니다. 파트 4는 장치에 단일 동물을 로딩하고 며칠 동안 미세 유체 장치 내부에서 동물을 성장시키는 방법을 설명합니다. 5부에서는 여러 시점에서 개별 동물을 고정하고, 다양한 대물렌즈를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처하고, 피지를 사용하여 이미지를 분석하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>18G 바늘</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td><td>Gauge 18</td><td></td></tr><tr><td>3방향 마개</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-30600-02</td><td>루어 잠금 CCD 카메라가 있는 Masterflex 피팅</td></tr><tr><td></td><td>Andor Technology</td><td>EMCCD C9100-13no</td><td></td></tr><tr><td>회로 기판 필름</td><td>Fine Line Imaging, 콜로라도, 미국</td><td></td><td>디자인은 65,024dpi로 인쇄됩니다.</td></tr><tr><td>컨벡션 오븐</td><td>Meta-Lab Scientific Industries, 인도</td><td>MSI-5</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Blue stat 현미경 커버 유리</td><td></td><td>22mm x 10Gms</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>하이 미디어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harris 유니 코어 펀처 1mm</td><td>Qiagen</td><td>Z708801</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma-Aldrich, 방갈로르, 인도</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>&nbsp; IKA</td><td>RCT B S 22</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>26895</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 현미경</td><td>ZEISS</td><td>LSM 5 LIVE</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁</td><td>Tarsons</td><td></td><td>0.5-10 &micro; L 마이크로피펫 팁은 식품 공급에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 네거티브 포토레지스트-1</td><td>Microchem</td><td>SU8-2025</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>네거티브 포토레지스트-2</td><td>Microchem</td><td>SU8-2050</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>현지 공급업체</td><td>상업용 질소 가스</td><td>실린더 부피 7 입방 미터</td></tr><tr><td>PDMS(경화 용액)</td><td>다우코닝 코퍼레이션, 미시건, 미국</td><td>&nbsp; Sylgard 경화 용액</td><td>경화제</td></tr><tr><td>페트리 플레이트</td><td>Praveen Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 세척</td>제 <td>Harrick Plasma, NY, USA&</td><td>nbsp; PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>면도기 및 블레이드</td><td>리스터 수술 블레이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머 (베이스)</td> <td>다우 코닝 공사, 미시건, 미국</td><td>실가드 184 기본</td><td>엘라스토머 기본</td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>피셔 사이언티픽</td><td></td><td>내경 1.59 mm 및 외경 3.18 mm</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>대학 웨이퍼 (매사추세츠, 미국</td><td>) [100] 방향, 4 인치 직경</td><td>100mm 직경의 웨이퍼에서 작은 조각(2mm &times; 2mm)을 절단했습니다</td></tr>. Spin <tr><td>Coater</td><td>SPS-Europe BV, The Netherlands</td><td>SPIN 150</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk microscope</td><td>Perkin Elmer ultra-view VOX system</td><td>CSU-X1-A3 N</td><td>이 시스템에는 4개(405/488/561/640nm) 레이저가 장착되어 있으며 Volocity 소프트웨어 패키지로 제어되었습니다.</td></tr><tr><td>SU8 개발자</td><td>Microchem, MA, USA</td><td>SU8 개발자</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란</td><td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td><td>448931</td><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란 증기는 독성</td></tr><tr><td>UV 램프</td>입니다 <td>Oriel Instruments, Bangalore, India</td><td></td><td>200 Watt 및 collimated UV 광원</td></tr><tr><td>Volocity 소프트웨어</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td>Image 분석</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) 는 발달 및 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델 시스템임이 입증되었습니다. 이러한 생물학적 과정을 이해하려면 종종 동일한 동물의 장기적이고 반복적 인 이미징이 필요합니다. 한천 패드에서 수행되는 기존의 고정 방법과 관련된 긴 회복 시간은 동물 건강에 해로운 영향을 미치므로 장기간에 걸쳐 동일한 동물을 반복적으로 이미지화하는 것은 부적절합니다. 이 논문은 미세 유체 칩 설계, 제조 방법, 온칩 C. elegans 배양 프로토콜 및 개별 동물의 발달 과정을 연구하기위한 장기 이미징의 세 가지 예를 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산으로 제작되고 커버 유리에 접착 된이 칩은 질소 가스를 사용하여 편향되는 엘라스토머 멤브레인을 사용하여 유리 기판에 동물을 고정시킵니다. C. elegans 의 완전한 고정화는 마취 없는 방식으로 세포 및 하위 세포 이벤트의 강력한 타임 랩스 이미징을 가능하게 합니다. 단면이 큰 채널 형상을 통해 동물은 부분적으로 밀봉 된 두 개의 격리 막 내에서 자유롭게 움직일 수있어 지속적인 먹이 공급으로 채널에서 성장할 수 있습니다. 이 간단한 칩을 사용하여 동물이 채널 내부에서 성장함에 따라 PVD 감각 뉴런의 신경 과정 성장, 외음부 발달 및 수지상 수목 화와 같은 발달 현상의 이미징을 수행 할 수 있습니다. 장기 성장 및 이미징 칩은 단일 압력 라인, 외부 밸브 없음, 저렴한 유체 소모품으로 작동하며 C. elegans를 사용하는 다른 실험실에서 쉽게 적용할 수 있는 표준 웜 처리 프로토콜을 활용합니다.

장치 특성화: 성장 및 이미징 장치는 비가역적 플라즈마 결합을 사용하여 함께 결합된 두 개의 PDMS 층(그림 1)으로 구성됩니다. 길이가 10mm이고 높이가 40μm 또는 80μm 인 유동층 (패턴 1)을 통해 액체 배양에서 동물을 키울 수 있습니다 (그림 1A). 트래핑 층(패턴 2)은 고해상도 이미징을 위해 동물을 고정화하기 위한 2mm 너비의 멤브레인(그림 1B)을 갖는다. 트래핑 층을 위한 마스크는 또한 연속적인 이미징 시점들 사이의 유동 채널의 섹션 내에서 동물의 움직임을 제한하기 위한 한 쌍의 격리 멤브레인을 생성한다. 장치의 트래핑 멤브레인은 이전 이미징 장치3에서 채택되었습니다. 현재 장치(그림 1C, L</str...

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

이 기술의 가장 큰 장점은 동물이 장치 내부에서 자유롭게 자랄 수 있고 고해상도 이미징을 위해 갇힐 수 있다는 것입니다. 이 장치는 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 장치를 만드는 동안 청결은 장치 작동 중 누출을 방지하기 위해 먼지가없는 장치를 제작할 수있는 가장 중요한 요소입니다.워드 프로세싱 소프트웨어에서 직사각형 모양을 사용하여 흐름 레이어에 대한 패턴 1과 제어 레이어에 대한 패턴 2를 디자인하고 폴리 에스테르 기반 필름에 최소 피처 크기가 8 마이크로 미터 인 레이저 플로터를 사용하여 포토 마스크를 인쇄합니다. 실리콘 웨이퍼를 높이와 너비가 2.5cm 인 정사각형 조각으로 자릅니다. 20 % 수산화 칼륨으로 1 분 동안 세척하고 탈 이온수로 웨이퍼를 헹굽니다.하나의 웨이퍼를 흐름에 사용하고 다른 웨이퍼를 제어 레이어에 사용합니다. 조각을 14 P-S-I 압축 질소 가스로 건조시킨 다음 섭씨 120 도의 핫 플레이트에서 4 시간 동안 탈수시킵니다. 냉각 후 하나의 실리콘 조각을 가져 와서 스핀 코더의 척에 놓고 진공을 켜서 웨이퍼를 제자리에 고정시킵니다.실리콘 조각에 약 20 마이크로 리터의 헥사 메틸 디 실란을 넣고 스핀 코더를 사용하여 500 RPM에서 5 초 동안 코팅 한 다음 3000 RPM에서 30 초 동안 코팅합니다. 유동층에 특정한 약 40 마이크로미터의 균일한 포토레지스트 두께를 얻으려면, 500 RPM에서 5초 동안 스핀 코더를 사용하여 약 1.5 밀리리터의 네거티브 포토레지스트로 실리콘 웨이퍼를 코팅한 다음, 30초 동안 2000 RPM을 코팅한다. 실리콘 조각을 헥사메틸디실란 및 네거티브 포토레지스트 1개로 코팅을 반복하여 제2 웨이퍼에 대해 제어층에 특이적인 대략 40 마이크로미터의 균일한 포토레지스트 두께를 얻었다.대안적으로, 유동층의 두께를 약 80 마이크로미터로 증가시키기 위해 500 RPM에서 5초 동안 스핀 코더를 사용하여 5초 동안 500 RPM에서 스핀 코더를 사용하여 약 1.5 밀리리터의 네거티브 포토레지스트 2로 실리콘 웨이퍼를 코팅하고 30초 동안 2000 RPM을 코팅합니다. 이전에 포토레지스트로 코팅된 실리콘 조각을 모두 섭씨 65도의 핫 플레이트에서 1분 동안 구운 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 굽습니다. 냉각 후, 포토레지스트 코팅된 표면이 U-V 램프를 향하도록 U-V 조명기의 노출 스테이지에 부드럽게 구운 실리콘 조각을 놓습니다.패턴 1과 2가 있는 포토 마스크를 통해 200와트 램프를 사용하여 두 조각을 15초 동안 U-V에 별도로 노출시켜 각각 흐름 및 제어 레이어를 얻습니다. 코팅된 층이 위를 향하도록 앞서 설명한 대로 노출된 두 개의 실리콘 조각을 굽습니다. 조각을 냉각시킨 후, 실리콘 조각을 포토레지스트 현상액 용액에 20분 동안 담가서 패턴을 현상합니다.패턴이 보이면 순수한 이소프로필 알코올로 조각을 헹구고 질소 가스를 사용하여 부드럽게 불어냅니다. 실리콘 조각을 코팅된 표면이 위를 향하도록 데시케이터에 보관하십시오. 유리 슬라이드에 50마이크로리터의 순수 T-C-P-F-O-S를 부어 조각을 실란 증기에 노출시킵니다.슬라이드를 데시케이터 안에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 엘라스토머 베이스와 경화제를 혼합하여 플라스틱 컵에 P-D-M-S를 만들고 3분 동안 계속 저어줍니다. 혼합된 P-D-M-S 혼합물을 데시케이터에서 30분 동안 탈기시켜 모든 기포를 제거하였다.제어 층 실리콘 웨이퍼를 페트리 접시에 놓고 실리콘 조각에 5mm 두께의 P-D-M-S 믹스 층을 붓습니다. P-D-M-S 주입 과정 후, P-D-M-S 믹스의 탈기를 반복한다. 스피너 트럭을 향하는 유동층이 있는 실리콘 웨이퍼를 200 내지 500 밀리토르의 진공 압력을 가하여 놓는다.실리콘 웨이퍼에 약 1 밀리리터의 P-D-M-S를 붓습니다. 스핀 코터를 사용하여 인코딩하여 약 80 마이크로 미터 두께의 층을 얻습니다. 스핀 코팅된 P-D-M-S로 두 개의 실리콘 웨이퍼를 굽고 P-D-M-S 층을 열풍 대류 오븐에서 섭씨 50도에서 6시간 동안 붓습니다.조각을 식힌 후 날카로운 칼날을 사용하여 제어층 주위의 실리콘 조각으로부터 5mm 두께의 P-D-M-S 층을 절단하고 실리콘 기판에서 벗겨냅니다. P-D-M-S 블록의 저장소에 있는 Harris 펀처를 사용하여 약 1mm 직경의 구멍 2개를 펀칭하여 고정 채널과 격리 채널 입구를 P-D-M-S 멤브레인 편향을 위한 가스 라인에 연결합니다. 스핀 코팅된 P-D-M-S 층이 있는 실리콘 조각을 P-D-M-S 코팅 표면이 위를 향하도록 플라스틱 트레이에 놓는 패턴 1에 놓습니다.패턴 2가 있는 펀칭된 P-D-M-S 블록을 몰딩된 면이 위를 향하도록 트레이에 놓습니다. 플라스틱 트레이를 플라즈마 클리너 안에 보관하고 저진공을 적용하여 두 개의 P-D-M-S 표면을 18W 공기 플라즈마에 2분 동안 노출시킵니다. 두 개의 플라즈마 처리된 블록을 꺼내고 패턴 1과 2의 플라즈마 처리된 표면을 함께 눌러 블록을 부드럽게 묶습니다.접합된 패턴을 섭씨 50도에서 뜨거운 공기 대류 오븐에서 2시간 동안 굽습니다. 접합 장치를 오븐에서 꺼낸 후 패턴 1과 패턴 2가 있는 실리콘 웨이퍼에서 잘라내고 Harris 펀처를 사용하여 유동층의 입구 및 출구 저장소에 구멍을 뚫습니다. 플라스틱 트레이에 플로우 레이어가 위를 향하도록 접합된 P-D-M-S 블록을 놓고 동일한 트레이에 깨끗한 커버 유리를 유지합니다.커버 유리의 블록을 18와트 공기 플라즈마에 2분 동안 노출시킵니다. 보라색 챔버를 보기 위해 진공 압력을 조정합니다. 플라즈마 노출 P-D-M-S 블록을 커버 유리에 놓고 접합 구조를 섭씨 50도의 오븐에서 2시간 동안 굽습니다.향후 실험을 위해 장치를 깨끗한 챔버에 보관하십시오. 장치를 가져 와서 실체 현미경에 놓고 튜브를 부착하십시오. 마이크로 플렉스 튜브를 압축 질소 가스 라인과 다른 쪽 끝의 3 방향 커넥터에 연결합니다.3방향 커넥터 중 튜브 1과 2를 각각 절연 멤브레인의 트랩에 연결합니다. 두 개의 마이크로 플렉스 튜브를 3 방향 스톱 콕의 두 출구 포트에 연결합니다. 두 튜브의 다른 쪽 끝을 8mm 길이의 18 게이지 바늘에 연결하십시오.입구 포트를 통해 마이크로 피펫을 사용하여 유동층을 M-9 버퍼로 채 웁니다. 바늘에 연결된 끝을 통해 두 튜브를 탈 이온수로 채 웁니다. 두 개의 바늘을 절연 및 트래핑 멤브레인을 연결하는 펀칭 구멍에 삽입합니다.14 PSI에서 질소 가스 조절기를 열고 튜브 1에서 3 방향 밸브를 돌려 제어 층, 즉 트랩 및 격리 멤브레인의 미세 유체 채널을 통해 물을 장치로 밀어 넣습니다. 채널이 물로 채워지고 프라이밍되면 3방향 스톱콕을 사용하여 압력을 해제합니다. 흐름 채널을 통해 추가 미디어를 흐르게 하여 거품을 제거합니다.그림은 P-S-3-2-3-9, 미세유체 칩 내부에서 성장하는 동물의 이미지를 보여주고 형광 이미지를 캡처하기 위해 8-10시간마다 고정화됩니다. 발현 패턴의 변이는 동일한 유전자가 상이한 발달 단계에서 상이한 세포에서 발현되는 시간적 유전자 조절의 예를 나타낸다. caenorhabditis elegans의 개별 W-D-I-S-5-1 유전자형의 이미징은 L-2, 후기 L-2, L-3 및 L-4 발달 단계에서 각각 1 차, 2 차 3 차 및 4 차 과정을 포함하는 각 PVD 뉴런에서 메 노라와 같은 분지 된 수지상 구조를 보여줍니다.본 그림은 P-V-D 발달 및 장치 재배 동물과 N-G-M 플레이트에서 자란 동물을 비교합니다. 웜 발달의 여러 단계에서 SP 및 Q-P의 수는 나이가 들면서 증가했습니다. Caenorhabditis elegans는 고해상도 영상에 필요한 충분한 마비를 유발하기 위해 3 밀리몰 levamisole의 방울로 치료되었습니다.S-P 값은 N-G-M 플레이트에서 성장한 유사한 병기 동물로부터 측정하고 한천 슬라이드에서 3 밀리몰 레바 미솔을 사용하여 이미징했을 때 크게 다르지 않았습니다. 또한, 꼬리에 존재하는 두 개의 P-V-C 세포체와 외음부 근처에 존재하는 두 번째 세포체 사이의 거리는 장치에서 자란 동물과 N-G-M 플레이트에서 자란 동물 모두에서 떨어져 이동함에 따라 증가합니다. 상기 그림은 미세유체 장치 내부에서 성장하는 동물로부터의 접촉 수용체 뉴런의 고해상도 이미지를 나타낸다.몽타주는 미토콘드리아와 뉴런 과정을 강조하는 연속적인 시점에서 전체 P-L-M-R 뉴런 과정을 나타냅니다. 그래프는 시간당 10.4 마이크로 미터의 기울기로 증가하는 것으로 관찰 된 총 신경 과정 길이를 나타냅니다. 미세 제작 장치는 고압 질소 가스가 있는 상태에서 편향된 얇은 P-D-M-S 멤브레인을 사용하여 고해상도 이미징을 위해 C-엘레간을 고정하고 제자리에 고정합니다.이 절차는 장기간에 걸쳐 간헐적 인 관찰이 필요한 C- 엘레 간에서 세포 및 세포 내 과정에 대한 종단 연구를 가능하게 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

일련의 동원 정지 메서드를 라이브 꼬마 선 충 의 대상된 조사 수 있도록 설립 되었습니다 최근 개발한 초박형입니다 미세를 사용 하 여 개인 물 유지와 칩. 이 새로운 칩에 동원 정지 관측 이미징에 대 한 적절 한 이기도 합니다. 자세한 치료 및 칩의 응용 프로그램 예제는 설명 했다.

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

배우세요 Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 고해상도 이미징을 위한 미세유체 칩 설계 및 제작 방법을. 이 기술은 36시간까지 연속 영양 공급과 세포 수준 관찰이 가능합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

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