Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

이 기술의 가장 큰 장점은 동물이 장치 내부에서 자유롭게 자랄 수 있고 고해상도 이미징을 위해 갇힐 수 있다는 것입니다. 이 장치는 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 장치를 만드는 동안 청결은 장치 작동 중 누출을 방지하기 위해 먼지가없는 장치를 제작할 수있는 가장 중요한 요소입니다.

워드 프로세싱 소프트웨어에서 직사각형 모양을 사용하여 흐름 레이어에 대한 패턴 1과 제어 레이어에 대한 패턴 2를 디자인하고 폴리 에스테르 기반 필름에 최소 피처 크기가 8 마이크로 미터 인 레이저 플로터를 사용하여 포토 마스크를 인쇄합니다. 실리콘 웨이퍼를 높이와 너비가 2.5cm 인 정사각형 조각으로 자릅니다. 20 % 수산화 칼륨으로 1 분 동안 세척하고 탈 이온수로 웨이퍼를 헹굽니다.

하나의 웨이퍼를 흐름에 사용하고 다른 웨이퍼를 제어 레이어에 사용합니다. 조각을 14 P-S-I 압축 질소 가스로 건조시킨 다음 섭씨 120 도의 핫 플레이트에서 4 시간 동안 탈수시킵니다. 냉각 후 하나의 실리콘 조각을 가져 와서 스핀 코더의 척에 놓고 진공을 켜서 웨이퍼를 제자리에 고정시킵니다.

실리콘 조각에 약 20 마이크로 리터의 헥사 메틸 디 실란을 넣고 스핀 코더를 사용하여 500 RPM에서 5 초 동안 코팅 한 다음 3000 RPM에서 30 초 동안 코팅합니다. 유동층에 특정한 약 40 마이크로미터의 균일한 포토레지스트 두께를 얻으려면, 500 RPM에서 5초 동안 스핀 코더를 사용하여 약 1.5 밀리리터의 네거티브 포토레지스트로 실리콘 웨이퍼를 코팅한 다음, 30초 동안 2000 RPM을 코팅한다. 실리콘 조각을 헥사메틸디실란 및 네거티브 포토레지스트 1개로 코팅을 반복하여 제2 웨이퍼에 대해 제어층에 특이적인 대략 40 마이크로미터의 균일한 포토레지스트 두께를 얻었다.

대안적으로, 유동층의 두께를 약 80 마이크로미터로 증가시키기 위해 500 RPM에서 5초 동안 스핀 코더를 사용하여 5초 동안 500 RPM에서 스핀 코더를 사용하여 약 1.5 밀리리터의 네거티브 포토레지스트 2로 실리콘 웨이퍼를 코팅하고 30초 동안 2000 RPM을 코팅합니다. 이전에 포토레지스트로 코팅된 실리콘 조각을 모두 섭씨 65도의 핫 플레이트에서 1분 동안 구운 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 굽습니다. 냉각 후, 포토레지스트 코팅된 표면이 U-V 램프를 향하도록 U-V 조명기의 노출 스테이지에 부드럽게 구운 실리콘 조각을 놓습니다.

패턴 1과 2가 있는 포토 마스크를 통해 200와트 램프를 사용하여 두 조각을 15초 동안 U-V에 별도로 노출시켜 각각 흐름 및 제어 레이어를 얻습니다. 코팅된 층이 위를 향하도록 앞서 설명한 대로 노출된 두 개의 실리콘 조각을 굽습니다. 조각을 냉각시킨 후, 실리콘 조각을 포토레지스트 현상액 용액에 20분 동안 담가서 패턴을 현상합니다.

패턴이 보이면 순수한 이소프로필 알코올로 조각을 헹구고 질소 가스를 사용하여 부드럽게 불어냅니다. 실리콘 조각을 코팅된 표면이 위를 향하도록 데시케이터에 보관하십시오. 유리 슬라이드에 50마이크로리터의 순수 T-C-P-F-O-S를 부어 조각을 실란 증기에 노출시킵니다.

슬라이드를 데시케이터 안에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 엘라스토머 베이스와 경화제를 혼합하여 플라스틱 컵에 P-D-M-S를 만들고 3분 동안 계속 저어줍니다. 혼합된 P-D-M-S 혼합물을 데시케이터에서 30분 동안 탈기시켜 모든 기포를 제거하였다.

제어 층 실리콘 웨이퍼를 페트리 접시에 놓고 실리콘 조각에 5mm 두께의 P-D-M-S 믹스 층을 붓습니다. P-D-M-S 주입 과정 후, P-D-M-S 믹스의 탈기를 반복한다. 스피너 트럭을 향하는 유동층이 있는 실리콘 웨이퍼를 200 내지 500 밀리토르의 진공 압력을 가하여 놓는다.

실리콘 웨이퍼에 약 1 밀리리터의 P-D-M-S를 붓습니다. 스핀 코터를 사용하여 인코딩하여 약 80 마이크로 미터 두께의 층을 얻습니다. 스핀 코팅된 P-D-M-S로 두 개의 실리콘 웨이퍼를 굽고 P-D-M-S 층을 열풍 대류 오븐에서 섭씨 50도에서 6시간 동안 붓습니다.

조각을 식힌 후 날카로운 칼날을 사용하여 제어층 주위의 실리콘 조각으로부터 5mm 두께의 P-D-M-S 층을 절단하고 실리콘 기판에서 벗겨냅니다. P-D-M-S 블록의 저장소에 있는 Harris 펀처를 사용하여 약 1mm 직경의 구멍 2개를 펀칭하여 고정 채널과 격리 채널 입구를 P-D-M-S 멤브레인 편향을 위한 가스 라인에 연결합니다. 스핀 코팅된 P-D-M-S 층이 있는 실리콘 조각을 P-D-M-S 코팅 표면이 위를 향하도록 플라스틱 트레이에 놓는 패턴 1에 놓습니다.

패턴 2가 있는 펀칭된 P-D-M-S 블록을 몰딩된 면이 위를 향하도록 트레이에 놓습니다. 플라스틱 트레이를 플라즈마 클리너 안에 보관하고 저진공을 적용하여 두 개의 P-D-M-S 표면을 18W 공기 플라즈마에 2분 동안 노출시킵니다. 두 개의 플라즈마 처리된 블록을 꺼내고 패턴 1과 2의 플라즈마 처리된 표면을 함께 눌러 블록을 부드럽게 묶습니다.

접합된 패턴을 섭씨 50도에서 뜨거운 공기 대류 오븐에서 2시간 동안 굽습니다. 접합 장치를 오븐에서 꺼낸 후 패턴 1과 패턴 2가 있는 실리콘 웨이퍼에서 잘라내고 Harris 펀처를 사용하여 유동층의 입구 및 출구 저장소에 구멍을 뚫습니다. 플라스틱 트레이에 플로우 레이어가 위를 향하도록 접합된 P-D-M-S 블록을 놓고 동일한 트레이에 깨끗한 커버 유리를 유지합니다.

커버 유리의 블록을 18와트 공기 플라즈마에 2분 동안 노출시킵니다. 보라색 챔버를 보기 위해 진공 압력을 조정합니다. 플라즈마 노출 P-D-M-S 블록을 커버 유리에 놓고 접합 구조를 섭씨 50도의 오븐에서 2시간 동안 굽습니다.

향후 실험을 위해 장치를 깨끗한 챔버에 보관하십시오. 장치를 가져 와서 실체 현미경에 놓고 튜브를 부착하십시오. 마이크로 플렉스 튜브를 압축 질소 가스 라인과 다른 쪽 끝의 3 방향 커넥터에 연결합니다.

3방향 커넥터 중 튜브 1과 2를 각각 절연 멤브레인의 트랩에 연결합니다. 두 개의 마이크로 플렉스 튜브를 3 방향 스톱 콕의 두 출구 포트에 연결합니다. 두 튜브의 다른 쪽 끝을 8mm 길이의 18 게이지 바늘에 연결하십시오.

입구 포트를 통해 마이크로 피펫을 사용하여 유동층을 M-9 버퍼로 채 웁니다. 바늘에 연결된 끝을 통해 두 튜브를 탈 이온수로 채 웁니다. 두 개의 바늘을 절연 및 트래핑 멤브레인을 연결하는 펀칭 구멍에 삽입합니다.

14 PSI에서 질소 가스 조절기를 열고 튜브 1에서 3 방향 밸브를 돌려 제어 층, 즉 트랩 및 격리 멤브레인의 미세 유체 채널을 통해 물을 장치로 밀어 넣습니다. 채널이 물로 채워지고 프라이밍되면 3방향 스톱콕을 사용하여 압력을 해제합니다. 흐름 채널을 통해 추가 미디어를 흐르게 하여 거품을 제거합니다.

그림은 P-S-3-2-3-9, 미세유체 칩 내부에서 성장하는 동물의 이미지를 보여주고 형광 이미지를 캡처하기 위해 8-10시간마다 고정화됩니다. 발현 패턴의 변이는 동일한 유전자가 상이한 발달 단계에서 상이한 세포에서 발현되는 시간적 유전자 조절의 예를 나타낸다. caenorhabditis elegans의 개별 W-D-I-S-5-1 유전자형의 이미징은 L-2, 후기 L-2, L-3 및 L-4 발달 단계에서 각각 1 차, 2 차 3 차 및 4 차 과정을 포함하는 각 PVD 뉴런에서 메 노라와 같은 분지 된 수지상 구조를 보여줍니다.

본 그림은 P-V-D 발달 및 장치 재배 동물과 N-G-M 플레이트에서 자란 동물을 비교합니다. 웜 발달의 여러 단계에서 SP 및 Q-P의 수는 나이가 들면서 증가했습니다. Caenorhabditis elegans는 고해상도 영상에 필요한 충분한 마비를 유발하기 위해 3 밀리몰 levamisole의 방울로 치료되었습니다.

S-P 값은 N-G-M 플레이트에서 성장한 유사한 병기 동물로부터 측정하고 한천 슬라이드에서 3 밀리몰 레바 미솔을 사용하여 이미징했을 때 크게 다르지 않았습니다. 또한, 꼬리에 존재하는 두 개의 P-V-C 세포체와 외음부 근처에 존재하는 두 번째 세포체 사이의 거리는 장치에서 자란 동물과 N-G-M 플레이트에서 자란 동물 모두에서 떨어져 이동함에 따라 증가합니다. 상기 그림은 미세유체 장치 내부에서 성장하는 동물로부터의 접촉 수용체 뉴런의 고해상도 이미지를 나타낸다.

몽타주는 미토콘드리아와 뉴런 과정을 강조하는 연속적인 시점에서 전체 P-L-M-R 뉴런 과정을 나타냅니다. 그래프는 시간당 10.4 마이크로 미터의 기울기로 증가하는 것으로 관찰 된 총 신경 과정 길이를 나타냅니다. 미세 제작 장치는 고압 질소 가스가 있는 상태에서 편향된 얇은 P-D-M-S 멤브레인을 사용하여 고해상도 이미징을 위해 C-엘레간을 고정하고 제자리에 고정합니다.

이 절차는 장기간에 걸쳐 간헐적 인 관찰이 필요한 C- 엘레 간에서 세포 및 세포 내 과정에 대한 종단 연구를 가능하게 할 수 있습니다.