Name: 기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 C. elegans의 기계적 자극에 대한 신경 반응을 측정하는 마이크로유체 칩 기법을 사용하여 고해상도 이미징으로 기계생물학 연구를 진행하는 방법을 알아보세요.

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우리 산드라 북 아 일 Manosalvas-Kjono, 푸 림 Ladpli 감사, 장치 설계 및 돌연변이 동물의 세대에서 파라 Memon, Divya Gopisetty, 및 베로니카 산체스에 대 한 지원. 이 연구는 지원 했다 NIH 교부 금 R01EB006745 (BLP)에, (에 MBG) R01NS092099, K99NS089942 (MK)를, (ALN)에 F31NS100318 및 받은 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 유럽 연구 회의 (ERC)에서 프로그램 ( 부여 계약 번호 715243 MK).

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서는 미세 칩에 갇혀 거 위 피부에 정확한 기계적 자극을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. 그것은 생물학 질문에 응답 하기 위한 물리적 자극의 통합을 촉진 하기 위한 것입니다 그리고 생물학 실험실에서 mechanobiology 연구를 합리화 하는 것을 목표로. 이 메서드는 C. 선 충에 mechanosensory 신경의 기능을 평가 하기 위해 이전 분석을 확장 합니다. 이전 양적 및 반 정량적 기법 힘1,34 및 동작35, 측정 하지만 신경 활동의 고해상도 이미지와 통합 하기 어려웠다. 우리는 따라서이 칩의 사용은 현재 응용 프로그램을 확장 하 고 부드러운 터치에 필요한 신경의 자극에 대 한 성능을 최적화 믿습니다. 우리는 거의 최대한 신경 응답에 도달 하는 충분히 강한 자극에 도달 5 µ m, 액추에이터의 편향 최적화. 약간의 변화, 우리는이 디자인 몸 ...

터치의 감각 동물을 그들의 환경에 대 한 중요 한 정보를 제공합니다. 적용 된 힘에 따라 터치 인식으로 무해 한, 즐거운, 또는 고통 스러운. 터치 하는 동안 조직 변형 전문된 mechanoreceptor 세포는 피부에 포함 된 가장 일반적으로 이온 채널, 수용 체 단백질을 표현 하 여 감지 됩니다. 터치와 고통 중에 이온 채널 활성화를 연결 하는 힘 인식 단계는 완전히 이해 되지 않는다. 심지어 어떻게 피부 조직을 기계적 변형 및 몸의 긴장에 있는 변화를 탐지 여부 필터 또는1,2,3스트레스에 대 한 알려져 있다. 이해에이 간격, 부분적으로, 세포 수준에서 응답을 관찰 하는 동안 정확한 기계적 stimulations 살아있는 동물의 피부 표면에 적용할 적당 한 도구의 부족에서 발생 합니다. 원자 힘 현미경 검사 법 사용 되었습니다 광범위 하 게 적용 하 고 격리 된 셀4,5 에 힘을 측정 하 고 또한 생활에 있는 Piezo1 수용 체를 활성화 하는 반면 세포6을 비슷한 실험 특히 살아있는 동물을 사용 하 여 C. 선 충, 악명 때문에 피사체의 본질적인 이동성 도전 되었습니다. 이 문제는 전통적으로 무력화 한 천 패드1,7,,89에 개별 동물을 동물 또는 외과-급 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 피할. 이 접근은 생산성, 되었지만 접착 및 기계적 규격에 소프트 한 표면에 의해 동원 정지에 필요한 기술에 관련 된 제한 사항에는. 마이크로 전략 gluing에 연결 하는 합병증 중 일부를 피할 수 있는 무료 대안 이다.
선 충 류 선 충 C. 완전히 매핑된 신 경계를, 동물의 크기 때문에 적합 한 마이크로 기술 유전자 모델 생물 이다. 마이크로-기반 장치 그렇지 않으면 매우 모바일 동물 고해상도 이미징 및 관련 modulatory 신경 자극의 전달을 수행 하는 동안 제 지 될 수 있는 이점 제공 합니다. 미세의 도움으로 기술, 동물 생활 해10,11, 전체 수명12,13 이상 행동 활동의 모니터링 및 고해상도 없이 움직일 수 있습니다. 신경 활동14,15,,1617의 이미지입니다. 또한, 통증의 감각 그들의 생리1,8, 기계4,,1819, 특징 수에 필요한 많은 mechanoreceptor 신경 세포 및 분자 레벨20,,2122.
C. 선 충 6 TRNs, 동물의 앞쪽 (ALML/R 및 AVM) 중 3 개는 자극과 중 3 개는 동물의 후부 (PLML/R와 PVM) 자극을 사용 하 여 그것의 몸 벽에 부드러운 기계적 자극을 감지 합니다. 생 화 확 적인 신호에는 적용 된 힘을 시험에 필요한 이온 채널 분자는 그것의 TRNs8에 광범위 하 게 연구 되었습니다. 이 문서에서는 고정된 C. 선 충 의 피부에 정확한 기계적인 힘을 적용 하는 연구원을 가능 하 게 한 미세 플랫폼23 제공 광학 이미징에 의해 그것의 내부 조직 변형 밖으로 읽는 동안 거 위. 잘 정의 된 기계적 자극을 제시 하는 것 외에도 칼슘 과도 subcellular 해상도 mechanoreceptor 뉴런에 기록 된 고 형태학 및 해 부 기능 연관 될 수 있습니다. 하나의 동물을 보유 하 고 (그림 1 및 그림 2) 6 공 압 작동 채널 옆의 피부를 선물 하는 중앙 트래핑 채널 장치에 의하여 이루어져 있다. 6 채널 각 벌레의 6 TRNs의 기계적 자극을 제공 하는 트래핑 채널에 따라 배치 됩니다. 이러한 채널 트래핑 상공에서 외부 공기 압력 소스 (그림 1)에 의해 구동 될 수 있다 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 우리는 압력에 대해 편향 보정 하 고이 문서에 측정을 제공. 각 액추에이터 개별적으로 해결 하 고 선택의 mechanoreceptor 자극 하는 데 사용 될 수 있습니다. 압 전 구동 압력 펌프를 사용 하 여 압력을 전달 하지만 어떤 다른 장치를 사용할 수 있습니다. 우리 TRNs에서 vivo에서 활성화 하 고 운영 기기 성인 C. 선 충에 기계적 자극을 제공, 장치에 성인 동물을 로드, 칼슘 이미징 수행 입증 하 압력 프로토콜을 사용할 수 있음을 보여합니다 실험, 그리고 결과 분석입니다. 장치 제조 두 가지 주요 단계로 구성 됩니다: 1) 수-8;에서 금형을 만들기 위해 사진 평판 그리고 2) PDMS 장치를 만들기 위해 성형. 간결성, 명확성을 위해 독자 이전 게시 된 기사와 프로토콜24,25 금형 및 장치를 생산 하는 방법에 대 한 지침은 이라고 합니다.

<table><tbody><tr><td>크롬 마스크</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', AutoCAD(Autodesk, Inc.)로 설계</td></tr><tr><td>크롬 마스크</td><td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td> <td>5 '', AutoCAD에서 설계 (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>크롬 마스크</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5 "', AutoCAD에서 설계 (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>4 "실리콘 웨이퍼 (B-test)</td> <td>스탠포드 나노 가공 시설</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>노출 타이머</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>조명 컨트롤러</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acetone Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethylsilane (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>주의: TCMS는 독성이 있으며 물에 반응합니다</td></tr>. <tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 키트</td><td>Dow 코닝</td><td></td><td>PDMS 프리폴리머</td></tr><tr><td>생검 펀치, 1mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 금속 튜브(0.635mm OD, 0.4318mm ID, 12.7mm 길이);게이지 크기 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 주사기 필터, 0.22 &mu; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>모든 용액을 걸러내려면 작은 입자가 칩 폴리에틸렌 튜브를 막을 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID</td><td>Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>주사기,</td><td>웜 포획 및 방출 주사기를 위한</td>1 ml <td>BD Scientific</td><td>309628</td></tr><tr>, <td>중력 기반 흐름을 위한</td><td>20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, 연동 </td> 0&ndash로 갖춰진 칩 Microfluidic 교류 관제사<td>에서 해결책 그리고 벌레를 빨기 위하여</td><td>Gilson</td><td></td>를 양수하십시오</tr><tr><td>; 800kPa 압력 채널</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td>압력 전달</td></tr><tr><td>방수 투명 폴리우레탄 튜빙, 4mm ID 및 6mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>집 공기에서 압력 펌프로 연결</td></tr><tr><td>방수 투명 폴리우레탄 튜빙, 2.6mm ID 및 4mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td>은 <td>압력 펌프를 작은 튜브에 연결</td></tr><tr><td>공기</td><td>용 Push-to-Connect 튜브 피팅McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>메트릭 - 임페리얼 컨버터</td></tr><tr><td>6 mm &times; 1/4&Prime용 직선 커넥터; 튜브 OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B 현미경 시스템</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO 오일 대물</td>렌즈 <td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT 디지털 CMOS 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X 광 엔진</td><td>Lumencor</td><td></td><td>청록색 및 녹색/노란색 광원 포함</td></tr><tr><td>여기 빔 스플리터</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini 이미지 분할 광학 장치</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>은 녹색과 적색 방출을 분할하고 카메라 칩의 다른 영역에 투사</td></tr>합니다 <tr><td>이미지 스플리터의</td><td>방출 빔 스플리터</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td></tr><tr><td>방출 필터 GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>이미지 스플리터에서</td></tr><tr><td>방출 필터 mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>이미지 스플리터에서</td></tr></tbody></table>

기계적 자극 및 높은 해상도 c. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Mechanobiology의 한 중앙 목표 단백질 및 세포에 기계적 스트레스의 상호 효과 이해 하는 것입니다. 그 중요성에도 불구 하 고 세포질 기능에 기계적 스트레스의 영향이 아직도 제대로 이해 된다. 몇 가지 도구를 사용 하면 조직과 세포의 동시 변형, 생체, 세포 활동의 이미지와 달리 매우 모바일 모형 유기 체, 선 충 류 등 운동 성의 효율적 제한 때문에이 기술 격차 존재 하는 부분에서 꼬마 선 충. C. 선 충 의 작은 크기에 게 그들 훌륭한 일치 하는 마이크로-기반 연구 장치, 그리고 동원 정지에 대 한 솔루션 제시 된 미세 장치를 사용 하 여. 이 장치 고해상도 이미징에 대 한 허용, 동물 완전히입니다 (PDMS) 및 기계적 힘 또는 electrophysiological 녹음의 배달에 대 한 물리적 액세스를 제한 하는 유리에 쌌 다. 최근, 우리 고해상도 형광 현미경과 호환 되는 트래핑 디자인 공 압 액츄에이터를 통합 하는 장치를 만들었습니다. 작동 채널 벌레 트랩 채널에서 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 이 다이어 프이 램은 외부 소스에서 압력을 적용 하 여 벌레의 측으로 편향. 장치는 개별 mechanosensitive 신경을 대상 수 있습니다. 이러한 뉴런의 활성화에 몇 군데 유전자 인코딩 칼슘 지표와 고해상도. 이 문서는 그들의 터치 수용 체 신경 (TRNs)에 있는 칼슘-민감한 작동 표시등 (GCaMP6s)를 표현 하는 C. 선 충 종자를 사용 하 여 일반적인 메서드를 제공 합니다. 메서드를 조사로 TRNs도 칼슘 센서에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 기계적으로 민감한 세포 또는 센서에 확장 될 수 있다.

수-8 리소 그래피와 칩 본딩 리소 그래피 프로토콜 및 PDMS 성형 표준 절차를 따릅니다. 자세한 내용은 다른23,,2425,26찾을 수 있습니다. PDMS는 경화 후 문제 없이 웨이퍼를 벗기다 한다. 수-8 기능 PDMS 필 링 하는 동안 벗어 버리고, 경우 SU-8 접착 레이어 또는 silanization는 충분 하지 않았다. 경우 유리 coverslips 및 PDMS 칩의 플라즈마-활성화 약한 결합 트래핑 채널 또는 성능이 저하 되 고 자극의 부재에서 발생 하는 공 압 액추에이터 누설 될 수 있습니다 충분 하지 않습니다. 유체 누설은 분명, 칩 사용 되지 않습니다.
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Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

이 기술의 전반적인 목표는 압력 액추에이터가 있는 미세유체 칩 설정을 사용하여 선충과 그 뉴런이 외부 기계적 자극에 어떻게 반응하는지 측정하는 것입니다. 이 방법은 세포, 조직 및 동물이 기계적 자극에 어떻게 반응하는지와 같은 기계생물학 및 감각 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 비침습적 방식으로 기생충의 이동성을 충분히 줄여 기계적 자극을 위해 기생충의 표피에 계속 접근하면서 고해상도 이미징을 가능하게 한다는 것입니다.이 방법은 또한 발달에 대한 기계적 단서의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 외 장기 exponse 또는 C.Elegans와 유사한 크기의 다른 동물과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. GCaMP 및 RFP의 동시 여기를 위한 현미경 시스템을 설정합니다.한 가지 옵션은 청록색과 노란색 빛만 투과하는 눈에 띄지 않는 광원입니다. 보려면 10배 대물렌즈 및 고배율 대물렌즈를 사용합니다. 또한 디지털 카메라를 통해 이미지를 컴퓨터로 보냅니다.다음으로, 형광 큐브와 필요한 경우 여기 필터를 포함합니다. 큐브에 청록색과 노란색 빛을 반사하고 녹색과 빨간색 빛을 투과하는 이색성 거울을 추가합니다. 570 나노미터에서 컷오프가 있는 long-pass dichroic mirror가 있는 빔 스플리터를 설정합니다.또한 50나노미터 너비의 525나노미터에서 녹색광을 위한 대역 통과 방출 필터와 60나노미터 너비의 632나노미터에서 적색광을 위한 대역 통과 방출 필터를 제공합니다. 두 빔을 모두 카메라의 시야에 투사합니다. 녹색 부분은 화면의 위쪽 절반에 투영되고 빨간색 부분은 아래쪽에 투영되는지 확인합니다.항상 한 달 미만의 미세유체 칩을 사용하십시오. 설정을 위해 먼저 중력 흐름 저장소에 여과된 M9를 로드합니다. 저장소를 칩에서 약 60cm 위에 놓고 칩 배출구에 연결합니다. 다음으로, 다른 배출구를 두 개의 입력이 있는 폐기물 용기에 연결하고 폐기물 용기에 대한 두 번째 입력을 연동 펌프에 연결합니다.폴리에틸렌 튜브로 모든 연결을 만드십시오. 다음으로, 양쪽 끝에 금속 튜브 커넥터가 있는 50mm 튜브 길이의 인터커넥트를 조립합니다. 6개의 작동 핑거 각각과 웜 주입구에 압입 및 상호 연결합니다.이제 광학 장치 아래에 칩을 배치합니다. PDMS는 반복적인 조작으로 빠르게 마모되므로 칩에 연결된 상호 연결 상태로 두십시오. PDMS 액추에이터와 칩을

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

연구원들은 벌레가 감지하고 반응하는 전기장을 적용하여 예쁜꼬마선충에서 주문형 움직임을 유발할 수 있습니다. 이 비디오는 전기 전술 거동을 소개하고 미세 유체 장치에서 수행되는 샘플 프로토콜을 보여줍니다.

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체...

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

일련의 동원 정지 메서드를 라이브 꼬마 선 충 의 대상된 조사 수 있도록 설립 되었습니다 최근 개발한 초박형입니다 미세를 사용 하 여 개인 물 유지와 칩. 이 새로운 칩에 동원 정지 관측 이미징에 대 한 적절 한 이기도 합니다. 자세한 치료 및 칩의 응용 프로그램 예제는 설명 했다.

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

배우세요 C. elegans의 기계적 자극에 대한 신경 반응을 측정하는 마이크로유체 칩 기법을 사용하여 고해상도 이미징으로 기계생물학 연구를 진행하는 방법을 알아보세요.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

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