기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

이 기술의 전반적인 목표는 압력 액추에이터가 있는 미세유체 칩 설정을 사용하여 선충과 그 뉴런이 외부 기계적 자극에 어떻게 반응하는지 측정하는 것입니다. 이 방법은 세포, 조직 및 동물이 기계적 자극에 어떻게 반응하는지와 같은 기계생물학 및 감각 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 비침습적 방식으로 기생충의 이동성을 충분히 줄여 기계적 자극을 위해 기생충의 표피에 계속 접근하면서 고해상도 이미징을 가능하게

이 방법은 또한 발달에 대한 기계적 단서의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 외 장기 exponse 또는 C.Elegans와 유사한 크기의 다른 동물과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. GCaMP 및 RFP의 동시 여기를 위한 현미경 시스템을 설정합니다.

한 가지 옵션은 청록색과 노란색 빛만 투과하는 눈에 띄지 않는 광원입니다. 보려면 10배 대물렌즈 및 고배율 대물렌즈를 사용합니다. 또한 디지털 카메라를 통해 이미지를 컴퓨터로 보냅니다.

다음으로, 형광 큐브와 필요한 경우 여기 필터를 포함합니다. 큐브에 청록색과 노란색 빛을 반사하고 녹색과 빨간색 빛을 투과하는 이색성 거울을 추가합니다. 570 나노미터에서 컷오프가 있는 long-pass dichroic mirror가 있는 빔 스플리터를 설정합니다.

또한 50나노미터 너비의 525나노미터에서 녹색광을 위한 대역 통과 방출 필터와 60나노미터 너비의 632나노미터에서 적색광을 위한 대역 통과 방출 필터를 제공합니다. 두 빔을 모두 카메라의 시야에 투사합니다. 녹색 부분은 화면의 위쪽 절반에 투영되고 빨간색 부분은 아래쪽에 투영되는지 확인합니다.

항상 한 달 미만의 미세유체 칩을 사용하십시오. 설정을 위해 먼저 중력 흐름 저장소에 여과된 M9를 로드합니다. 저장소를 칩에서 약 60cm 위에 놓고 칩 배출구에 연결합니다. 다음으로, 다른 배출구를 두 개의 입력이 있는 폐기물 용기에 연결하고 폐기물 용기에 대한 두 번째 입력을 연동 펌프에 연결합니다.

폴리에틸렌 튜브로 모든 연결을 만드십시오. 다음으로, 양쪽 끝에 금속 튜브 커넥터가 있는 50mm 튜브 길이의 인터커넥트를 조립합니다. 6개의 작동 핑거 각각과 웜 주입구에 압입 및 상호 연결합니다.

이제 광학 장치 아래에 칩을 배치합니다. PDMS는 반복적인 조작으로 빠르게 마모되므로 칩에 연결된 상호 연결 상태로 두십시오. PDMS 액추에이터와 칩을 공기 저장소에 연결하는 튜브가 다이어프램의 양호한 색 작동을 보장하기 위해 적절하게 밀봉되는 것이 중요합니다.

동물을 적재하기 전에 미세유체 칩의 압력 손실을 확인하십시오. 원하는 압력에서 여러 번의 작동 주기를 수행하여 다이어프램의 편향을 측정합니다. 그런 다음 정량적 값을 이론적 예측과 비교합니다.

측정값이 예상과 다르면 튜빙 또는 튜빙 커넥터에 누출이 있는지 확인하십시오. PDMS는 또한 기본 폴리머와 경화제의 대체 비율로 인해 다른 탄성을 가질 수 있으며, 또는 PD 질량이 오래되어 과도하게 가교될 수 있습니다. Porta-de-la-Riva와 회사가 2012년 Jove 간행물에서 설명한 대로 연령 동기화-to-young-adult 또는 adult-day-one C.elegans를 준비했습니다.

이제 2-5 명의 젊은 성인 또는 하루 된 자웅 동체를 선택하십시오. 올바른 크기의 동물을 선택하는 것이 중요합니다. 작은 동물은 채널에 갇히지 않으며 지나치게 큰 동물은 제거하기 어렵고 장치를 막을 수 있습니다.

여과된 M9 한 방울에 고른 벌레를 당깁니다. 그런 다음 주사기 본체 자체로 당기지 않고 1밀리리터 주사기를 사용하여 튜브 길이로 끌어당깁니다. 다음으로, 튜브를 칩의 웜 입구에 있는 인터커넥트에 연결합니다. 그런 다음 저장소의 밸브를 열고 펌프를 시작하여 중력 흐름을 활성화합니다.

이제 4배 배율로 트래핑 채널을 관찰하고 동물을 장치 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 동물을 대기실에 넣은 후 플런저를 사용하여 동물들 중 하나를 포획 채널 앞으로 부드럽게 흐르게 하여 머리가 채널의 테이퍼 모양으로 들어가도록 합니다. 웜이 코에서 몸 끝 근처까지 채널의 전체 단면을 채우지 않으면 웜을 제거하십시오.

많은 경우, 너무 작은 웜은 갇히지 않고 칩을 바로 통과합니다. 포획 채널에 걸린 동물을 제거해야 하는 경우 웜이 채널에서 사라질 때까지 주사기의 플런저를 누른 다음 새 웜을 로드하기만 하면 됩니다. 웜이 제대로 로드되면 형광 모드로 전환하고 배율을 높입니다.

채도를 방지하려면 형광 강도에 따라 여기 강도를 조정해야 합니다. 관심 뉴런의 신경돌기가 액추에이터 중 하나의 다이어프램을 가로질러 있는지 확인합니다. 그 액추에이터는 또한 뉴런의 세포체 앞쪽에 있어야 합니다.

그렇지 않은 경우 플런저를 당기거나 밀어 동물의 위치를 조정하십시오. 그래도 문제가 해결되지 않으면 웜을 제거하고 새 웜을 로드하십시오. 또한 뉴런 주변에 자가형광이 발생하면 웜을 교체하십시오.

웜이 적절하게 로드되면 관심 뉴런의 세포체에 초점을 맞춘 다음 칩이 앞쪽에 있는 액추에이터를 확인하고 관련 인터커넥트를 사용하여 이 액추에이터를 프로그래밍 가능한 압력 펌프에 연결합니다. 실험에서 액추에이터와 뉴런 사이의 거리를 측정해야 하는 경우, 채널 벽이 이미지의 위쪽 및 아래쪽 가장자리와 평행하도록 하여 두 가지를 모두 시야에 맞춥니다. 다음으로, 프로그래밍 가능한 압력 펌프를 사용하여 압력 프로토콜을 정의합니다.

항상 기준선을 정의하기 위해 0킬로파스칼에서 최소 50개의 이미지를 촬영하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 자극 파형과 압력을 프로그래밍합니다. 이제 이미징 및 압력 프로토콜을 실행합니다.

기록하는 동안 관심 뉴런은 10제곱 픽셀 영역에서 가장 밝은 점이어야 합니다. 두 개의 순차적 이미지에서 10픽셀 이상 이동할 수 없으며 시야에 있어야 합니다. 기록하는 동안 압력과 액추에이터가 변경될 때 형광 강도의 변화를 관찰할 수 있습니다.

이것은 뉴런의 성공적인 자극을 나타냅니다. 자극 사이에는 0킬로파스칼의 일정한 압력에서 10초를 포함합니다. 전체 기록 동안 최소 10픽셀로 떨어져 있는 한 시야에서 여러 뉴런의 신호를 동시에 기록할 수 있습니다.

추가 연구를 위해 웜을 유지하려면 칩의 출구를 중력 흐름과 폐기물 용기 쪽으로 분리하십시오. 그런 다음 전체 웜이 트래핑 채널을 통해 흐름 채널로 밀려날 때까지 플런저를 부드럽게 누르고 동물이 칩 외부의 물방울에 나타날 때까지 플런저를 계속 누릅니다. 이제 튜브가 있는 주사기를 분리하고 액적의 웜을 한천 플레이트에 흡인합니다.

채널에서 웜을 제거하고 희생하려면 전체 웜이 트래핑 채널을 통해 흐름 채널로 밀려날 때까지 플런저를 누릅니다. 그런 다음 웜이 칩에서 흘러나와 폐기물 용기로 들어갑니다. 미세유체 칩을 설정한 후 다이어프램의 처짐을 테스트했습니다.

측정된 값은 450킬로파스칼의 압력에서 1미크론을 초과하지 않는 약간의 변화로 재현 가능했습니다. 칩의 입구에 웜을 삽입한 후, 포획 채널 내부에 있는 단일 동물의 피부를 6개의 액추에이터에 제공했습니다. 이 설계에서는 PLM 뉴런이 일반적으로 완전히 고정될 수 없으므로 측면 및 수직으로 자유롭게 이동할 수 있습니다.

PLM 뉴런의 성공적인 활성화는 가능하지만, 꼬리의 움직임으로 인해 뉴런의 칼슘 과도 현상을 기록하는 것은 어렵습니다. 일단 제자리에 놓이면 6개의 TRN 각각에 기계적 자극을 전달하기 위해 배치된 6개의 액추에이터 중 하나를 사용하여 동물을 자극했습니다. 세 가지 다른 2초 자극 중 하나가 제시되었습니다.

275킬로파스칼 유지, 275킬로파스칼로의 램프 또는 275킬로파스칼 스텝과 중첩된 75킬로파스칼 10헤르츠 사인으로 구성된 버즈.압력이 없는 10초의 간격이 자극을 분리했습니다. 압력 램프와 압력 단계는 자극이 400킬로파스칼 이상의 압력에 도달한 경우에만 TRN을 활성화한 반면, 버즈 자극은 모든 TRN을 강력하게 활성화했습니다.

이 기술은 일단 숙달되면 웜당 5분 이내에 수행할 수 있습니다. 칩과 커버슬립 사이 또는 칩과 인터커넥터 사이의 밀봉이 불량하면 장치가 누출되어 고장날 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 통각 수용기의 기계적 반응을 특성화하기 위해 전압 이미징 또는 다른 뉴런에 기계적 자극의 표적 전달과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

또한 이 절차에 따라 동물을 회수할 수 있기 때문에 이 기술을 사용하여 기계적 자극에 대한 반응에 결함이 있는 돌연변이를 선별할 수 있습니다. 압축 가스 및 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 위험을 피하기 위해 필요한 경우 개인 보호복을 착용하고 배기 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취하십시오.