Name: 유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 유세포분석을 이용해 마우스 조직에서 BFU-e와 CFU-e 적혈구 전구체를 고순도로 분리하는 방법을. 이 기술은 적혈구 질환 연구에 활용됩니다.

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모든 실험은 동물 프로토콜 A-1586에 따라 수행되었으며 매사추세츠 대학 찬 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 202200017.
참고: 여기에는 두 가지 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다: 첫째, 유세포 분석 분석(섹션 1), 유세포 분석 분류를 위한 프로토콜 조정(섹션 2). 아래 프로토콜은 10개 채널이 있는 유세포분석기/분류기를 사용합니다. 예제 설정은 단계 1.14.5에서 참조된 표 1에 제공됩니다. 이 프로토콜을 9개의 채널로만 실행할 수도 있습니다. 표 2의 범례를 참조하십시오.
1. 유세포 분석
<ol><li>성체(>6주령) Balb/C 또는 C57BL6 마우스를 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 적절한 방법(예: CO2 흡입 후 자궁 경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다. 유세포 분석을 위해서는 단일 마우스의 골수 (BM)로 충분합니다. 정렬의 경우, 마우스의 수는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 각 집단에 대한 세포 수율은 다음과 같습니다 (단계 2.3.3).</li>
	<li>조직 수확 :<ol><li>얼음에 3mL의 냉(4°C) 염색 완충액("SB5": 인산염 완충 식염수(PBS), 0.2% 소 혈청 알부민(BSA), 0.08% 포도당, 5mM EDTA)이 포함된 5mL 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브를 준비합니다. 이것을 사용하여 수확 된 조직을 배치하십시오.</li>
		<li>각 마우스에서 해부 된 각 조직에 대해 별도의 튜브를 준비하십시오. 여러 마우스의 조직을 풀링하지 마십시오.</li>
		<li>대퇴골과 양쪽 경골을 모두 수확하십시오. SB5로 튜브에 넣기 전에 뼈에서 모든 근육을 제거하십시오.</li>
		<li>복부 왼쪽의 절개를 통해 비장을 해부하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>골수 세포 추출:<ol><li>갓 해부된 대퇴골과 경골을 차가운 염색 완충액(SB5)에 직접 넣고 골수(BM)를 추출할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 양동이의 얼음 위에 깨끗한 멸균 모르타르를 놓습니다. 튜브에서 SB5와 함께 뼈를 박격포로 옮깁니다.</li>
		<li>해부 가위로 각 뼈 끝의 약 1mm를 잘라내어 뼈의 구멍이 보이도록합니다.</li>
		<li>26G 바늘과 SB3로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 뼈에서 씻어내어 절구에 모으십시오. 뼈가 무색으로 보일 때까지 매번 신선한 완충액을 사용하여 3-5 회 반복하십시오.</li>
		<li>플러시된 골수를 100μm 메쉬 필터를 통해 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다.</li>
		<li>절구와 유봉을 사용하여 5-10mL의 SB5에서 플러시 된 뼈를 분쇄하십시오. 분쇄된 뼈 및 완충액의 혼합물을 100 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고 단계 1.3.4에서 수집된 세포와 함께 풀링한다.</li>
	</ol></li>
	<li>비장 세포 추출:<ol><li>얼음 위에 놓인 빈 50mL 원심분리 튜브에 100μm 메쉬 필터를 설치합니다. 메쉬 필터에 단일 비장을 놓습니다.</li>
		<li>0.5-1mL의 SB5를 비장에 추가하여 건조되지 않도록 합니다.</li>
		<li>3mL 또는 5mL 주사기 플런저의 고무면을 사용하여 비장을 메쉬에 으깨십시오. 한 번에 5mL씩 SB5를 더 추가하고 모든 세포가 튜브에 수집될 때까지 계속 으깨십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>이 시점부터 골수와 비장 세포는 같은 방식으로 치료됩니다.</li>
	<li>세포를 900 x g, 4 °C에서 10분 동안 스핀다운합니다. 진공 흡인 설정을 사용하여 상청액을 흡인합니다.</li>
	<li>단일 세포 현탁액을 만들려면 세포를 2mL의 SB5에 재현탁하고 큰 오리피스 팁이 있는 P1000을 사용하여 50회 위아래로 피펫합니다( 재료 표 참조). 여기에는 깨지기 쉬운 세포의 손상을 방지하는 데 도움이 되는 넓은 팁 구멍이 있습니다.</li>
	<li>세포를 세려면 위아래로 20회 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포를 SB5에서 1:100의 비율로 희석합니다. 희석된 세포 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합하고 혈구계 및/또는 세포 카운터를 사용합니다.</li>
	<li>세포를 900 x g, 4 °C에서 10분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 흡인하고 SB5에서 33 x 106 라이브 셀/mL로 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>표 3의 각 항체를 동일한 부피로 혼합하여 Lin-FITC 칵테일을 제조한다.</li>
	<li>단색 컨트롤 및 "형광 빼기 1"(FMO) 컨트롤을 위해 셀을 준비합니다. 단계 1.11-1.12를 단계 1.14(유세포 분석용 샘플) 및/또는 단계 2.1(유세포 분석 분류)에서 샘플 세포의 준비 및 염색과 병행하여 수행합니다.<ol><li>50 μL (1.6 x 106 세포)의 세포 현탁액을 얼음 위의 FACS 튜브로 옮겨 염색되지 않은 세포 대조군을 위해 세포를 준비합니다. 세포 현탁액 50 μL (1.6 x 106 세포)를 얼음 위의 FACS 튜브로 옮겨 각 단색 대조군 (11 튜브)에 대한 세포를 준비합니다.</li>
		<li>300μL(10 x 106 세포)의 세포 현탁액을 얼음 위의 별도의 FACS 튜브로 옮겨 다음 색상(키트, CD41, CD150, CD49f[4개의 튜브])에 대한 FMO 대조군을 준비합니다.</li>
		<li>세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인한다.</li>
	</ol></li>
	<li>FMO 및 단색 대조군의 항체 염색<ol><li>FACS 튜브에서 FMO를 33 x 106 cells/mL(총 부피 300μL)로 염색합니다. 각 대조군에 대해 FMO의 이름을 딴 항체를 제외한 모든 항체를 추가합니다. 예를 들어, 키트 FMO의 경우 키트 항체를 생략합니다. 각 항체에 대해, 표 2와 같이 희석 및 최종 농도를 사용한다.</li>
		<li>FACS 튜브에서 20 x 106 cells/mL(총 부피 50μL)에서 단색 대조군을 염색합니다. 각각의 대조군에 대해, 표 2에 열거된 농도의 단일 항체를 첨가한다.</li>
		<li>각 컨트롤 튜브를 3,000rpm(분당 회전수)에서 2-3초 동안 소용돌이한 다음 4°C에서 배양하여 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들립니다. 내용물이 캡에 닿지 않도록 튜브의 길이와 평행한 회전축으로 수평에서 약 10°에서 60° 각도 사이로 튜브를 흔듭니다.</li>
		<li>세포를 SB5로 세척: SB5로 세포 현탁액의 부피를 4 mL로 구성한다. 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고, 상청액을 흡인한다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 재현탁:<ol><li>얼룩이 없는 모든 단색 컨트롤(DAPI 컨트롤 제외)을 300μL의 SB5에 다시 현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다.</li>
		<li>SB5에서 1:10,000에서 DAPI 스톡(100% 에탄올 중 1mg/mL)을 희석하여 DAPI/SB5 용액을 만듭니다.</li>
		<li>FMO를 1.8mL의 DAPI/SB5에 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다.</li>
		<li>300μL의 DAPI/SB5에 DAPI 단색 컨트롤을 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 4mL FACS 튜브로 필터링합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 준비: 세포가 유세포 분석을 위해 준비되는 경우 1.14단계로 이동합니다. 정렬을 위해 셀을 준비하는 경우 2.1단계로 건너뜁니다.</li>
	<li>FACS 튜브에서 총 부피 300μL(10 x 10 6 세포)의 33 x 106 cell/mL에서 유세포 분석 샘플을 염색합니다.<ol><li>항체 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플 수로 마스터 믹스의 부피를 결정하고 샘플당 300 μL를 사용합니다. 표시된 희석액에서 표 2 에 나열된 모든 항체를 SB5로 희석하여 마스터 믹스를 만든다. 마스터 믹스의 토끼 IgG는 Fc 블록 역할을합니다.</li>
		<li>각 튜브를 3,000rpm에서 2-3초 동안 소용돌이한 다음 4°C에서 배양하여 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들어줍니다.</li>
		<li>세포를 SB5로 세척: SB5로 세포 현탁액의 부피를 4 mL로 구성한다. 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고, 상청액을 흡인한다.</li>
		<li>유세포 분석을 위해 샘플을 1.12.5.2단계에서 준비한 대로 DAPI/SB5 1.8mL에 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 FACS 튜브로 여과합니다.</li>
		<li>표 2의 항체 접합체 및 생존율 염료 DAPI를 수용하기 위해 10개의 채널을 갖는 세포분석기 상에서 샘플을 분석한다. 채널 설정의 예는 표 1에 나와 있습니다. 9 개의 채널 만 사용할 수도 있습니다. 표 2 범례를 참조하십시오.</li>
		<li>유세포 분석 데이터를 분석하는 동안 2.4 단계에 설명 된대로 단색 제어 및 FMO 제어를 사용하여 표준 스펙트럼 보상 접근법을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 유세포 분석 분류를 위한 프로토콜 조정
<ol><li>린의 제조<ol><li>10마리의 마우스에서 동일한 조직(BM 또는 비장)에서 추출한 모든 세포를 50mL 튜브에 모읍니다. 큰 오리피스 팁이 있는 P1000을 사용하여 피펫팅하여 풀링된 각 샘플을 재현탁합니다.</li>
		<li>세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인한다.</li>
		<li>농축되지 않은 세포를 사용하여 섹션 1에 설명된 대로 단색 및 FMO 컨트롤을 준비합니다.</li>
		<li>Lin- 세포의 자기 비드 농축을 사용하여 분류하기 위한 Lin- 세포 농축:</li>
		<li>세포를 SB5로 1 x 108 cells/mL로 재현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 정상 래트 혈청 및 표 4 에 열거된 비오티닐화 항체를 첨가하고, 4°C에서 1시간 동안 흔들면서 인큐베이션한다.</li>
		<li>세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 차가운 SB5 15mL에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
		<li>세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 차가운 SB5에 세포를 1 x 108 cells/mL로 재현탁하고 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>자성 나노 비드를 3,000rpm에서 5-10 초 동안 소용돌이시킵니다. 세포 10mL당 자성 나노비드 1mL를 섭취합니다.</li>
		<li>5mL FACS 튜브에서 나노비드를 세척합니다. 부피를 SB5로 4mL로 구성하고, 900 x g, 4°C에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인한다.</li>
		<li>나노비드를 500μL의 SB5에 재현탁하고 단계 2.1.7에서 제조된 세포와 혼합합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 흔들면서 배양합니다.</li>
		<li>세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. SB5를 사용하여 세포를 1 x 108 cells/mL로 재현탁합니다.</li>
		<li>튜브를 4°C의 자석에 5분 동안 놓습니다.</li>
		<li>상청액을 새 15mL 튜브에 조심스럽게 붓습니다.</li>
		<li>단계 2.1.13의 상청액이 들어 있는 튜브를 4°C의 자석 위에 5분 동안 놓습니다. 상청액을 새 15mL 튜브에 조심스럽게 붓습니다.</li>
		<li>단계 2.1.14의 상청액으로부터 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀시키고, 상청액을 흡인한다.</li>
		<li>Lin-농축된 세포를 1mL의 SB5에 재현탁시킵니다.</li>
		<li>세포의 10 μL를 SB5에서 1:100으로 희석합니다. 희석된 세포 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합하고 혈구계 및/또는 세포 카운터를 사용합니다.</li>
		<li>2.1.17단계의 세포 수에 기초하여, Lin-농축된 세포를 33 x 106 cells/mL에서 재현탁시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>농축 된 세포의 염색 :<ol><li>표 2에 나열된 모든 항체를 추가하여 FACS 튜브에서 33 x 106 cells/mL로 농축된 세포 샘플을 염색합니다. 각 튜브를 3,000rpm에서 2-3초 동안 소용돌이한 다음 4°C에서 배양하여 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들어줍니다.</li>
		<li>SB5로 세포 세척: SB5로 FACS 튜브의 부피를 4mL로 구성합니다. 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>유세포 분석을 위해 샘플을 4단계 6단계에서 준비한 대로 DAPI/SB5-1.12.5.2에 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 4mL FACS 튜브로 여과합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 정렬:<ol><li>CFU-e 셀은 고압에서 쉽게 손상되므로 CFU-e 수율을 최대화하기 위해 큰 노즐과 저압으로 샘플을 분류하십시오. 이 연구에 사용된 유세포분석기의 경우 14psi 및 100μm 노즐 또는 12μm 노즐이 있는 130psi를 사용합니다. 아래 2.4단계에 설명된 대로 분류 게이트를 설정합니다.</li>
		<li>수집 버퍼 준비: PBS에 20% 소 태아 혈청을 추가합니다.</li>
		<li>정렬된 모집단의 순도를 확인하려면 1.12.5.2단계에 설명된 대로 DAPI가 포함된 버퍼에서 정렬된 각 모집단의 작은 부분 표본을 다시 실행합니다. 참고: 전형적으로, 총 10마리의 마우스(대략 1 x 109 세포)로부터의 BM은 대략 70%의 생존율을 갖는 P1-hi, P1-low 및 P2 집단 각각에 대해 적어도 50,000-100,000개의 세포를 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>그림 3에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 분류 게이트를 분석하거나 설정합니다.<ol><li>전방 산란(FSC) 매개변수를 사용하여 크기에 따라 파편을 제거합니다. FSC 높이 대 FSC 영역 히스토그램을 사용하여 세포 응집체를 제외하고 단일 세포를 선택합니다. 측면 산란(SSC) 높이 대 SSC 영역 히스토그램으로 반복합니다.</li>
		<li>생존 가능한 세포가 불투과성인 DNA 염료 DAPI에 양성인 세포를 게이팅하여 죽은 세포를 배제합니다.</li>
		<li>Lin-Ter119-Kit+ 세포를 선택하고 이들 중에서 CD55를 발현하는 아집단을 선택합니다.</li>
		<li>Lin-Ter119-Kit+CD55+ 세포를 CD49f 및 CD105의 발현에 따라 두 개의 주요 집단인 P6 및 P7로 세분화합니다.</li>
		<li>CD150 및 CD41의 발현에 따라 P6을 P3 (호염기구 또는 비만 세포 전구 세포), P4 (거대 핵 세포 전구 세포) 및 P5 (EBMP 및 적혈구 편향 MPP)로 더 세분화합니다.</li>
		<li>CD150 및 CD71의 발현에 기초하여, P7을 P2 (BFU-e), 초기 CFU-e (P1-low) 및 후기 CFU-e (P1-hi)로 더 세분화한다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development%3A+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li>
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</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

BFU-e 및 CFU-e 전구 세포를 고순도의 신선한 조직에서 직접 전향 적으로 분리 할 수있는 능력은 이전에 연구자를 피했습니다. scRNAseq 및 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 검증된 당사의 새로운 접근법은 이제 이를 수행할 수 있는 도구를 제공합니다.
분류 프로토콜과 분석 프로토콜을 모두 성공적으로 실행하기 위한 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫째, 저밀도 셀의 손실을 방지하기 위해 셀을 900 x g 로 회전시켜야 합니다. CFU-e 단계의 많은 세포는 손실될 수 있는 크고 저밀도 세포입니다. 둘째, 위아래로 피펫팅할 때 큰 오리피스 팁을 사용하여 세포 응집체를 파괴하고 깨지기 쉬운 P1 및 P2 세포의 손실을 방지해야 합니다. 이 단계는 많은 CFU-e 전구 세포가 적혈구 모세포 섬 대 식세포 (EBI)와 관련이 있고 성공적으로 해리되지 않으...

적혈구 생성은 초기 적혈구 생성과 적혈구 말단 분화의 두 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다(그림 1)1,2,3. 초기 적혈구 생성에서 조혈 줄기 세포는 적혈구 계통에 전념하고 초기 적혈구 전구 세포를 생성하며, 이는 반고체 배지에서 집락 형성 잠재력을 기반으로 1970 년대에 처음 확인되었습니다 4,5,6,7,8,9 . 대체로 적혈구 전구 세포는 두 가지 범주로 나뉩니다 : 각각 "파열 형성 단위 적혈구"또는 BFU-e 4,5,6으로 명명 된 "파열"(더 작은 적혈구 세포 클러스터의 큰 집합체)을 일으키는 초기 전구 세포; 그리고 그들의 자손은 각각 "콜로니 형성 단위 적혈구" 또는 CFU-e 7,8,9로 명명된 하나의 작은 적혈구 세포 클러스터 또는 콜로니를 형성합니다. BFU-e 및 CFU-e는 아직 말단 적혈구 유전자를 발현하지 않으며 형태 학적으로 인식 할 수 없습니다. 다수의 자가 갱신 또는 확장 세포 분열 후, CFU-e는 글로빈과 같은 적혈구 유전자가 유도되는 전사 전환을 거쳐 적혈구 말단 분화(ETD)1,10로 전환됩니다. ETD 동안, 적혈구 세포는 적혈구로 성숙하는 망상 적혈구를 형성하기 전에 3-5 개의 성숙한 세포 분열을 거칩니다.
말단 분화 중 적혈구 세포는 원래 형태에 따라 전 적혈구 모세포, 호 염기성, 다색 성 및 직교 색성으로 분류되었습니다. 유세포분석법의 출현으로 세포 크기(순방향 산란, FSC로 측정)와 두 개의 세포 표면 마커인 CD71 및 Ter11911,12,13을 기반으로 전향적 분류 및 분리가 가능해졌습니다(그림 1). 이것과 유사한 유세포분석접근법(14)은 ETD의 분자 및 세포 측면의 조사에 혁명을 일으켜, 생체내 및 시험관내 10,15,16,17,18,19,20의 발달 단계 특이적 분석을 가능하게 한다. CD71/Ter119 접근법은 이제 적혈구 전구체 분석에 일상적으로 사용됩니다.
최근까지 마우스 조직에서 CFU-e 및 BFU-e의 직접적이고 고순도 전향적 분리를 위한 유사하고 접근 가능한 유세포측정 접근 방식은 연구자를 피했습니다. 대신에, 연구자들은 종종 동일한 유세포측정 서브세트21 내에서 공동-정제되는 비-적혈구 세포의 존재 하에서, 이들 전구세포의 일부만을 단리하는 유동 세포측정 전략을 사용하였다. 결과적으로, BFU-e 및 CFU-e의 조사는 초기 골수 전구 세포로부터 BFU-e 및 CFU-e를 유도하고 증폭하는 시험관 내 분화 시스템으로 제한되었다. 이어서, 이들 적혈구 전구세포-농축 배양물(22,23)에서 CFU-e와 BFU-e를 구별하는 유세포측정 전략을 적용하는 것이 가능하다. 대안적인 접근법은 태아 CFU-e 및 BFU-e를 사용하는데, 이는 임신 중기10,24,25에서 마우스 태아 간의 Ter119- 음성 분획에서 고도로 풍부합니다. 그러나 이러한 접근법 중 어느 것도 생체 내 생리적 상태에서 성인 BFU-e 및 CFU-e를 조사 할 수 없습니다. 도전의 규모는 콜로니 형성 분석에 기초하여, 이들 세포가 각각 단지 0.025% 및 0.3%의 빈도로 성인 골수에 존재한다는 것을 상기할 때 이해될 수있다6.
여기에 설명된 프로토콜은 새로 수확한 Kit+ 마우스 골수 세포의 단일 세포 전사체 분석을 기반으로 하는 새로운 유세포 분석 접근 방식입니다(키트는 골수의 모든 초기 전구 집단에서 발현됨)1. 우리의 접근법에는 Pronk et al.21,26에 의해 이미 사용되었던 일부 세포 표면 마커가 포함되어 있습니다. 단일 세포 전사체는 적혈구 및 기타 초기 조혈 전구 세포를 식별하는 세포 표면 마커의 조합을 결정하는 데 사용되었습니다 (그림 2). 특히, 계통 음성(Lin-) Kit+ 세포의 CD55+ 분획은 5개의 집단으로 세분될 수 있으며, 그 중 3개는 적혈구 궤적의 연속 세그먼트를 생성합니다(그림 2). 이들 집단 각각의 전사체 정체성은 정렬한 다음, scRNAseq 및 정렬된 단일 세포 전사체를 원래의 전사체 맵에 다시 투영하여 확인하였다(5개 집단 각각의 유전자 발현 및 전체 골수 데이터 세트는 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 에서 탐색할 수 있음)1 . 각 집단의 세포 운명 잠재력은 전통적인 콜로니 형성 분석(그림 2)과 새로운 고처리량 단일 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 확인되었습니다. 이러한 분석은 새로운 유세포 분석 접근법이 신선한 성인 골수 및 비장의 모든 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 고순도 분리를 초래한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 집단 1(P1)은 CFU-e만 포함하고 다른 조혈 전구 세포는 포함하지 않으며, 집단 2(P2)는 골수의 모든 BFU-e 전구 세포와 소수의 CFU-e를 포함하지만 다른 선조1는 포함하지않는다. 아래의 상세한 프로토콜은 식염수 또는 적혈구 생성 자극 호르몬 인 에리스로포이에틴 (Epo)을 주사 한 마우스에서의 예제 실험으로 더 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 대형 오리피스 팁</td><td>USA sceintific</td><td>1011-9000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 안티 마우스 CD55 (DAF) 항체</td><td>BioLegend</td><td>131806</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 안티 마우스 CD117 (c-kit) 항체</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>557395</td><td>M1/70 (클론)</td></tr><tr><td>Biotin-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td>1D3 (클론)</td></tr><tr><td>Biotin-CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB553045</td><td>RM4-5 (클론)</td></tr><tr><td>Biotin-CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB553029</td><td>53-6.7 (클론)</td></tr><tr><td>Biotin-F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>BM8 (클론)</td></tr><tr><td>Biotin-Ly-6G and Ly-6C</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>RB6-8C5 (클론)</td></tr><tr><td>Biotin-TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>TER-119 (클론)</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 421 안티 휴먼/마우스 CD49f 항체</td><td>BioLegend</td><td>313624</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD41 항체</td><td>BioLegend</td><td>133921</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 650 안티 마우스 CD150 (SLAM) 항체</td><td>BioLegend</td><td>115931</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 쥐 안티 마우스 TER-119/에리스로이드 Cells</td><td>BD Biosciences</td><td>563827</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Rabbit IgG, whole molecule</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Digital DIVA 하드웨어 및 LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse F4/80 항체</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 CD11b</td><td>BD 생명 과학</td><td>557396</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 CD19</td><td>BD 생명 과학</td><td>553785</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 CD4</td><td>BD 생명 과학</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 CD8a</td><td>BD 생명 과학</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 Ly-6G 및 LY-6C</td><td>BD 생명 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>553127 FlowJo 소프트웨어&nbsp;</td><td>FlowJo</td><td>버전 10</td><td>플로우 사이토미터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>LSR II 디지털 멀티파라미터 플로우 사이토미터 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>플로우 사이토미터&nbsp;</td></tr><tr><td>NewlineNY 스테인레스 스틸 핸드 메이셔 & 그릇, 모르타르 및 유봉 세트</td><td>아마존</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 쥐 혈청</td><td>줄기 세포 기술</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 CD105 항체</td><td>BioLegend</td><td>120408</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 안티 마우스 CD71 항체</td><td>BioLegend</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수, 10x 솔루션</td><td>Fisher scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 나노비즈</td><td>BioLegend</td><td>480016</td><td>마그네틱 비즈</td></tr></tbody></table>

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

초기 적혈구 전구 세포는 원래 시험관 내에서 콜로니 형성 잠재력에 의해 정의되었으며 BFU-e 및 CFU-e로 알려진 파열 형성 및 집락 형성 "단위"로 분류되었습니다. 최근까지, 새로 분리된 성인 마우스 골수로부터 순수한 BFU-e 및 CFU-e 전구세포를 직접 전향적이고 완전히 분리하는 방법은 이용 가능하지 않았다. 이러한 격차를 해소하기 위해 마우스 골수의 단일 세포 RNA-seq (scRNAseq) 데이터 세트를 분석하여 세포 표면 마커를 암호화하는 유전자의 발현을 분석했습니다. 이 분석은 세포 운명 분석과 결합되어 마우스 골수 또는 비장에서 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 완전하고 순수한 하위 집합을 식별하고 분리할 수 있는 새로운 유세포 분석 접근법을 개발할 수 있었습니다. 이 접근법은 또한 호염기구/비만 세포 및 거핵구 전위에 대해 풍부한 하위세트를 포함하는 다른 전구 하위세트를 식별한다. 이 방법은 신선한 골수 또는 비장 세포를 Kit 및 CD55로 향하는 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 이 두 마커를 모두 발현하는 전구 세포는 5 개의 주요 집단으로 세분됩니다. 집단 1(P1 또는 CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high)은 모든 CFU-e 전구 세포를 포함하며, 각각 초기 및 후기 CFU-e에 해당하는 P1-low(CD71med CD150 high) 및 P1-hi(CD71 high CD150low)로 더 세분화될 수 있다. 인구 2 (P2 또는 BFU-e, 키트 + CD55 + CD49f med / 낮은 CD105 med / 높은 CD71 낮은 CD150높음)는 모든 BFU-e 전구 세포를 포함합니다. 집단 P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f 중간/높은 CD105 중간/낮은 CD150낮은 CD41낮음)은 호염기구/비만 세포 전구체에 대해 풍부합니다. 인구 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f 중간 / 높은 CD105중간 / 낮은 CD150높은 CD41 +)는 거대 핵 세포 전구 세포에 대해 풍부합니다. 및 인구 5(P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-)에는 적혈구, 호염기구/비만 세포 및 거대핵구 전위(EBMP) 및 적혈구/거핵세포/호염기구 편향 다중 전위 전구체(MPP)가 있는 전구체가 포함됩니다. 이 새로운 접근 방식은 적혈구 및 기타 조혈 전구 세포를 분석할 때 더 높은 정밀도를 허용하고 유세포 측정적으로 정의된 각 집단에 대한 전사체 정보를 참조할 수도 있습니다.

이 프로토콜은 새로 수확한 골수 및 비장 세포에서 BFU-es 및 CFU-es를 식별하기 위한 유세포 분석 접근 방식을 설명합니다. 생쥐에서 신선한 BM과 비장을 채취하고 즉시 조직을 얼음 위에 놓는 것으로 시작합니다. 모든 절차는 세포 생존력을 보존하기 위해 추위에서 수행됩니다. 세포는 분화된 혈통의 마커를 발현하는 모든 세포의 배제를 허용하는 "계통" 항체 칵테일로 표지된다 (유동 세포측정 분석의 경우 FITC-린 칵테일, 표 3; 또는 계통 음성 세포의 경우 자기 비드 농축, 표 4). 세포는 또한 혈통 음성 세포 분획 내에서 다수의 초기 전구 집단을 구별할 수 있게 하는 마커에 대한 항체로 표지됩니다. 라벨링 후에는 유세포 분석 분류 또는 분석이 수행됩니다. 유세포분석 분류에 대한 접근 방식은 유세포분석 분석과 유사하지만 많은 수의 세포를 분류하는 시간과 비용을 줄이기 위해 Lin- 세포 분획에 대한 자기 비드 농축이 선행됩니다. 전구 세포를...

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

이 프로토콜을 사용하면 골수 및 비장과 같이 새로 수확한 마우스 조직에서 직접 BFU-E 및 CFU-E 적혈구 전구세포를 식별하고 분리할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 이전 흐름 프로토콜에서는 불가능했던 적혈구 전구 세포의 순수한 개체군을 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 많은 다운스트림 실험에서 전구 분리를 허용함으로써 적혈구 질환 마우스 모델을 연구하는 능력을 크게 향상시킵니다.시작하려면 새로 해부 된 대퇴골과 경골을 차가운 염색 완충액 또는 SB-5에 직접 넣고 골수를 추출 할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 양동이의 얼음 위에 깨끗한 멸균 모르타르를 놓고 뼈를 박격포로 옮깁니다. 해부 가위를 사용하여 각 뼈의 약 1mm 끝을 잘라냅니다.SB-5가 들어있는 26 게이지 바늘이 장착 된 3 밀리리터 주사기를 사용하여 골수를 뼈에서 씻어 내고 절구에 모으고 뼈가 무색으로 보일 때까지 매번 신선한 완충액을 사용하여 3-5 회 반복합니다. 플러시 된 골수를 100 마이크로 미터 메쉬를 통해 여과하고 얼음 위에 놓인 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 세포를 수집합니다. 다음으로, 박격포와 유봉을 사용하여 5-10 밀리리터의 SB-5로 플러시 된 뼈를 분쇄하십시오.분쇄된 뼈의 혼합물을 여과하고 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 완충액을 여과하여 이전에 수집된 세포와 풀링합니다. 얼음 위에 놓인 빈 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 100 마이크로 미터 메쉬 필터를 설치하십시오. 메쉬 필터에 단일 비장을 놓고 0.5-1 밀리리터의 SB-5를 비장에 추가하여 건조되지 않도록합니다.3 또는 5 밀리리터 주사기 플런저의 고무면을 사용하여 비장을 메쉬를 통해 으깨십시오. 한 번에 5 밀리리터의 SB-5를 더 추가하고 모든 세포가 튜브에 수집 될 때까지 계속 으깨십시오. 큰 오리피스 팁을 사용하여 2 밀리리터의 SB-5로 수집된 세포를 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.FMO의 이름을 딴 항체를 제외한 모든 항체를 FACS 튜브의 세포 현탁액에 첨가하여 형광 마이너스 1 또는 FMO 대조군을 염색합니다. 단색 대조군을 염색하려면 FACS 튜브의 세포 현탁액에 단일 항체를 추가합니다. 각 컨트롤 튜브를 3000RPM에서 2-3초 동안 소용돌이시킨 다음 섭씨 4도에서 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들면서 배양합니다.배양 후 세포를 SB-5로 세척하고 SB-5로 세포 현탁액의 부피를 4 밀리리터로

identification-isolation-burst-forming-unit-colony-forming-unit

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

이 프로토콜은 환자의 골수 및 말초혈 단핵세포에서 유래한 인간 조혈 줄기세포 및 전구세포의 분화를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 검사법은 적혈구 및 골수계통 확립을 지원하는 반고체 배양지를 사용하며, 전임상 약물 특성화를 위한 재현 가능한 집락 분류를 위한 표준화된 지표를 통합합니다.

환자 유래 골수 및 말초혈 단핵세포에 적용된 군집형성 단위 분석법

이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

배우세요 유세포분석을 이용해 마우스 조직에서 BFU-e와 CFU-e 적혈구 전구체를 고순도로 분리하는 방법을. 이 기술은 적혈구 질환 연구에 활용됩니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

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