Name: 식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 배우세요 마우스 골수에서 골수성 전구체 세포를 MACS 및 FACS 기술로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 6가지 전구체 아형을 정확히 식별하여 혈액학 및 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜 (바깥 HSG)를, Immunologists의 미국 협회에서 면역학 화목에서 경력 및 학술 상 수상 (HSG)을 보드의 총재 재생 의학 연구소에서 삼목 시 나이 의료 센터에 자금을 사용 하 여 개발 되었다 (하의) 혈액학의 미국 사회. FACS 정렬 지원에 감사 삼목 시 나이 의료 센터에서 Flow Cytometry 코어 하 고.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 되었다.
1. 절연 마우스 골 수 및 단일 세포 현 탁 액의 준비
<ol><li>기관 지침에 따라 마우스를 안락사</li>
	<li>그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓고 70% 에탄올 (EtOH) 스프레이 합니다. 작은 (3-5 m m) 절 개를 발목 수준 사용에서 각 뒷 다리 사지에 날카로운, 뾰족한가 위, 그리고 다리에서 그것을 제거 하 고 근육과 뼈를 노출 하는 몸 쪽으로 피부를 당겨 확인 합니다.</li>
	<li>뼈의 방향 다음가 위로 트리밍에 의해 뼈에서 근육 (허벅지 근육, 근육, 등등)를 제거 합니다. 수 뼈를 손상 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>엉덩이 관절에서 화관을 탈 구 및 결합 조직 및 뼈를 잘라 하지 않도록 주의 되 고, 다리를 분리 하는 근육을 버려야.</li>
	<li>tibias에서 발목을 망가뜨리고 여 발을 제거, 뼈 살 균 PBS 또는 미디어, 튜브에 놓고 조직 문화 실에 얼음에 그들을 전송 합니다. 참고: 일부 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 총 골 수 세포에서 세포 파생) 한 동안 얼음에 뼈를 두고 있지만 조상 격리의 downregulation를 피하기 위해 가능한 한 빨리 진행 하는 것이 중요 하다 중요 한 표면 마커 (특히 CD115)입니다.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 휴지와 함께 그들을 문 지르고 하 여 모든 나머지 부드러운 조직 뼈에서 제거 합니다. 참고: 프로토콜 멸 균 샘플 FACS 정렬 후 세포 배양 또는 vivo에서 분석 실험에 필요한 경우 biosafety 내각에서 수행 되어야 합니다. 살 균 세포는 필요 하지 않습니다, 경우 실험실 벤치에 전체 프로세스를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>짧게 70%에 뼈를 담 궈 EtOH 그들, 그리고 그들을 씻어 살 균 PBS에서 소독.</li>
	<li>화관 tibias fibulas에서 무릎까지 절단 하 여 고는 fibulas 삭제 합니다.</li>
	<li>날카로운가 위는 뼈의 끝을 잘라.</li>
	<li>수확 찬 메 마른 PBS 가진 골 같이 뼈 흰색 나타날 때까지:<ol>
<li>집게와 각 뼈를 한쪽 끝에 뼈 샤프트에 찬 메 마른 PBS를 포함 10 mL 주사기에 연결 26 G 바늘을 삽입.</li>
		<li>50 mL 원심 분리기 튜브 위에 뼈 고 수확 골 수 뼈를 통해 서 2-5 mL PBS를 플러시.</li>
		<li>마우스 (2 화관과 2 tibias) 당 모든 4 뼈에서 골 수를 수확.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드럽게 아래로 세포 현 탁 액을 형성 하 골 세분화를 1ml 피 펫과 플라스틱.</li>
	<li>뼈 조각을 제거 하 고 따라서 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 집계 셀 30 μ m 나일론 메시의 조각을 통해 골 정지를 필터링 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 280 x g에서 단일 셀 서 스 펜 션 5 분, 그리고 resuspend (PBS 0.5 %FBS + 2 mM EDTA), 살 균 얼룩 버퍼에 셀 펠 릿에 대 한 사용 하는 마우스 (예를 들어, 셀 화관 2 마우스의 tibias에서 풀링된 10 mL) 당 버퍼 얼룩 5 mL.</li>
	<li>10 μ 샘플의 aliquot, 10 μ와 믹스 Trypan 파랑 및 한 hemocytometer에 결과 Trypan 블루 레이블 샘플의 부하 10 μ. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 참고: 경우 셀은 너무 신뢰할 수 있는 계산에 대 한 집중, Trypan 파랑을 추가 하기 전에 샘플을 희석.</li>
</ol>2. 조상 농축 자기 활성화 셀 (맥)을 정렬 하 여
<ol><li>전체 단일 세포 현 탁 액을 원심 (또는으로 많은 셀 원하는 수익률을 얻을 하는 데 필요한) 280 x g 4 ° C와 resuspend 40에서 셀 펠 릿에 5 분에서 107 셀 당 버퍼 (PBS 0.5 %FBS + 2 mM EDTA) 얼룩 μ. 참고: 그것은 또한 맥 계보 고갈 키트 제조 업체에서 버퍼를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 얼룩 버퍼 대신.</li>
	<li>혈통 고갈 계보 고갈 키트와 함께 제공 된 지침에 따라 수행 합니다. 다음 지침은 테이블의 자료에서 본 키트입니다. 다른 키트를 사용 하는 경우 제조업체의 지시에 따라 고 2.3 단계로 진행.<ol>
<li>107 셀 당 10 μ biotin 항 체 칵테일을 추가 하 고 pipetting으로 혼합 하 고, 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
		<li>30 μ 추가 107 셀 당 버퍼 버퍼/맥 얼룩이 지 고 혼합.</li>
		<li>107 셀 당 20 μ 안티 비오 microbeads를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 추가로 15 분 동안 품 어 그들은 완전히 분산 되도록 참고: 소용돌이 있는 셀에 추가 하기 전에 microbeads</li>
		<li>280 x g 5 분, 그리고 resuspend 500 μ 얼룩 버퍼/맥에서 셀 펠 릿 108 셀에 대 한 버퍼에서 세포를 원심, 얼룩 버퍼/맥 버퍼 107 셀 당 1 mL를 추가 합니다. 10 이상8 셀에 대 한 버퍼/맥 버퍼를 적절 하 게 얼룩의 볼륨을 확장할.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 자동된 자석 분리기를 준비 합니다.</li>
		<li>구분 기호로 레이블이 지정 된 셀을 포함 하는 튜브 놓고 부정적인 선택 프로그램을 선택 합니다.</li>
		<li>조상 농축 혈통 네거티브 (Lin-) 세포를 포함 하는 부정적인 분수를 수집 합니다. 혈통-긍정적인 자석으로 표시 된 셀을 포함 하는 긍정적인 분수를 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge 린- 에서 5 분, 280 x g 세포 및 마우스 (예를 들어, 골 2 마우스에서 풀링되는 경우 4 mL) 당 버퍼/맥 버퍼를 얼룩 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 참고: 펠 릿 지금 해야 합니다 대신 빨간색 흰색는 적혈구 고갈 되어 있기 때문에.</li>
	<li>10 μ 린- 세포의 aliquot, 10 μ와 믹스 Trypan 파랑 및 한 hemocytometer에 결과 Trypan 블루 레이블 샘플의 부하 10 μ. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 참고: 경우 셀은 너무 신뢰할 수 있는 계산에 대 한 집중, Trypan 파랑을 추가 하기 전에 샘플을 희석.</li>
</ol>3. 골수성 조상 식별 및 격리 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)
<ol><li>라벨 9 microcentrifuge (1.5 또는 2 mL) 튜브: 1) 흠 없는 세포, 2-8) FcγR (CD16/32)에 대하여 fluorophore 활용 된 항 체와 스테인드 단일 셀 c-키트, Sca 1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C 및 CD115 전압 선택 및 색상 보정, 및 9에 대 한) 조상 식별 및 정렬에 대 한 모든 7 항 체와 스테인드를 샘플 셀.</li>
	<li>샘플 튜브 (9 관)를 각각 제어 튜브 (튜브 1-8), 100000 셀 및 모든 나머지 셀 (또는 원하는 경우 적은)를 배포 합니다. 참고: 샘플 볼륨 1.5-2 mL 보다 큰 경우에, 그것은 필요할 수 있습니다를 샘플 셀 15 mL 튜브로 배포, 그들 원심 및 펠 릿 (아래 단계 3.3)에 게, resuspend 다음 전송 셀 이후 착 단계에 대 한 microcentrifuge 관에.</li>
	<li>5 분, 1500 x g에서 세포를 원심 및 제어 튜브 알 약 100 μ에 resuspend (예를 들어, 200 μ 1 x 107 셀) 셀 5 x 106 당 버퍼를 얼룩 얼룩 버퍼 (PBS 0.5 %FBS + 2 mM EDTA) 및 100 μ에 샘플 튜브 펠 릿.</li>
	<li>FcγR 단일 얼룩 튜브 및 샘플 튜브를 2 μ g/mL 안티-CD16/CD32-APC-Cy7를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하, 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 소용돌이 참고: 일반적인 Fc 중재 항 체 바인딩 인해 경쟁을 방지 하기 위해 다른 항 체를 추가 하기 전에 FcγR (CD16/32) 항 체로 샘플 셀 얼룩 중요 하다. 시 약을 차단 하는 FcγR와 셀 품 어 하지 마십시오.</li>
	<li>해당 단일 얼룩 튜브 (1 항 체 각)와 샘플 튜브 (모든 6 항 체)를 다른 항 체를 추가: 10 μ g/mL c-키트-태평양 파랑, 2 μ g/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μ g/mL CD34-FITC, 10 μ g/mL Flt3 APC, 2 μ g/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5, 및 4 μ g/mL CD115 PE. 소용돌이, 부드럽게와 4 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
	<li>900 μ 얼룩 버퍼 제어 튜브 및 샘플 튜브를 107 셀 당 1 mL 얼룩 버퍼 추가 합니다. 1500 x g 5 분에 세포를 원심 및 버퍼 얼룩에 셀 펠 릿 resuspend: 제어 튜브 당 200 μ 및 샘플 튜브 25 x 106 셀 당 500 μ. 5 mL FACS 튜브에 resuspended 셀을 전송. 참고: 샘플 볼륨 1.5-2 mL 보다 큰 경우, 그것 해야 원심 분리에 대 한 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 교류 cytometer (분석기 또는 정렬)을 준비 합니다.</li>
	<li>제어 셀 전압 및 색상 보정을 설정 하려면 흐름 cytometer 스테인드 흠 없는 및 단일를 실행 합니다.</li>
	<li>샘플 셀을 실행 하 고 아래 설명 및 그림 2에 요약 된 조상 하위 집합 게이트 원하는 경우 수행 FACS 관련 조상 하위 집합을 정렬. 참고: 그것은 일반적으로 약 200000 셀 각 조상 게이트에서 적어도 1000 이벤트를 수집할 필요가 있다.<ol>
<li>모든 셀, FSC-A (x 축) 및 SSC-A (y 축), 표시의 점 줄거리를 만들고 파편과 죽은 세포를 제외 하려면 게이트 = > "라이브" 셀.</li>
		<li>"라이브" 셀, FSC-H (x 축) 및 FSC-W (y 축), 표시의 점 줄거리를 만들고 남자 제외 게이트 = > (FSC) 라이브/내의 게이트.</li>
		<li>라이브/내의의 도트 줄거리를 SSC-H (x 축) 및 SSC-W (y 축), 표시 (FSC) 셀 만들고 남자 제외 게이트 = > (FSC) 라이브/내의 / 내의 (SSC) 게이트.</li>
		<li>라이브/내의 (FSC)의 점 플롯 만들기 / 내의 (SSC) 세포, Sca-1 (x 축) 및 c-키트 (y 축), 표시와 게이트 c-키트+ Sca-1- 셀 선택 = > LKS- 셀.</li>
		<li>LKS- 셀, CD34 표시 점 플롯 만들기 (x 축)와 FcγR (y 축), 그리고 게이트 CD34 선택+ FcγRlo 셀 = > "CMPs", 및 CD34+ FcγR안녕하세요 셀 = > "GMPs". 참고: "CMPs"와 "GMPs"로 정확 하 게 가능한 게이트 중요 하다. 정확한 게이팅에 대 한 모조 색상 밀도 음모 또는 등고선 플롯을 사용 하 여 도움이 됩니다.</li>
		<li>"CMPs" CD115 표시의 점 플롯 만들기 (x 축) 및 Flt3 (y)와 게이트 선택: Flt3+ CD115lo 셀 = > CMP Flt3+ CD115lo 셀, Flt3- CD115lo 셀 = > 셀, CMP Flt3- Flt3+ CD115안녕하세요 셀 = > MDPs.
</li>
		<li>"GMPs" Ly6C 표시의 점 플롯 만들기 (x 축) FcγR (y)와 게이트 Ly6C를 선택-셀 = > "GMP-Ly6C- 세포", 그리고 Ly6C+ 셀 = > "GMP-Ly6C+ 세포".</li>
		<li>CD115 표시 ","GMP-Ly6C- 세포의 점 플롯 만들기 (x 축) 및 Flt3 (y)와 게이트 선택: Flt3- CD115lo 셀 = > GMPs.
</li>
		<li>CD115 표시 ","GMP-Ly6C+ 세포의 점 플롯 만들기 (x 축) 및 Flt3 (y)와 게이트 선택: Flt3- CD115lo 셀 = > GPs, Flt3- CD115안녕하세요 셀 = > 원 + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

와 이즈 맨 마우스 골수성 조상 식별1 전략 게이팅 immunologists에 대 한 황금 표준 hematologists 거의 20 년 동안 왔지만 그것은 명백한 "CMP"와 "GMP" 게이츠는 매우 이질적인 더 정확한 지금 제어 전략 필요 합니다. 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 특정 골수성 창시자의 더 정확한 정량화 및 myelopoiesis 통로 조사에 대 한 C57BL/6J 쥐에 oligopotent 및 계보 커밋된 하위 집합의 식별을 허용 골수성 차별화의 특정 단계에서 운영 하는 분자 메커니즘. 조상 하위 집합 정렬할 수 있습니다, 경우, 분자 분석, 차별화 등 의 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가
프로토콜 영 (6-8 주 이전)을 사용 하 여 개발 되었다 C57BL/6J 쥐 남성 및 여성 쥐에 적합. 우리가 하지 이전 마우스에 조상 하위 집합 특징 있다. 우리가 예상 하지 않...

Monocytes, 호 중구, 및 모 수석 세포 (DCs)는 주로 골 수에서 조 혈 창시자에서 myelopoiesis 라는 프로세스에 의해 발생 하는 골수성 세포. 일반적인 골수성 창시자 (CMPs) 골수성 세포로 없으며, 적혈구, 하지만 하지 림프 세포 생산 가능성이 있다. CMPs에서 파생 됩니다, granulocyte monocyte 창시자 (GMPs) granulocytes 그리고 monocytes, 생산 하지만 잃은 megakaryocyte 잠재적인 적혈구. Monocytes 그리고 클래식 plasmacytoid Dc (cDCs/Pdc) monocyte DC 창시자 (MDPs), CMPs. 서서히 제한 혈통 잠재력의 궁극적으로 혈통 커밋된 결과 의해 생산으로 알려진 일반적인 창시자에서 발생을 또한 생각 됩니다 창시자: granulocyte 창시자, monocyte 창시자, 및 수지상 세포 창시자 (그림 1).
와 이즈 맨과 동료 보고 CMPs 린- c-키트+ Sca-1- CD34 (LKS-)에서 발견 되는+ FcγRlo 의 분수 마우스 골 수, GMPs LKS- CD34에 포함 하는 동안+ FcγR 안녕하세요 분수1. 그러나, 이러한 "CMP"와 "GMP" 분수는 매우 이질적인. 예를 들어, "GMP" 분수 또한 포함 되어 혈통 커밋된 granulocyte 창시자 monocyte 창시자1,2. MDPs 했다 별도로 보고 CX3CR1+ Flt3+ CD115+ CD34 및 FcγR3,4익스프레스 창시자. MDPs는 cDC/pDC 생산 일반적인 DC 창시자 (Cdp), c-Kit (CD117)의 저수준을 표현 하기 위해 보고 하 고 LKS- 분수5에 포함 되지 않습니다.
그것은 이전 monocytes (CMP-GMP-민주당-monocyte) 단일 경로 통해 발생 간주 되었다. 제작한 GMPs (monocyte 창시자, MPs 라는)이 모델, monocyte 커밋된 창시자와 일치2 및 MDPs (라는 일반적인 monocyte 창시자, cMoPs)6 공유 표면 마커 식에 근거 하 여 동일한 셀 표시 . 그러나, 우리가 최근에 monocytes는 생산 하지 독립적으로 GMPs와 MDPs, 시연 하 고 단일 셀 RNA 시퀀싱7MPs와 cMoPs 사이 구별을 수 있었다.
우리는 최근에 다른 oligopotent 및 골수성 조상 계보 커밋된 하위 집합을 포함 하는 C57BL/6J 마우스 골 수의 6 subfractions 식별 하는 이즈 맨 "CMP" 및 "GMP" 제어 전략 수정. 처음 보고는 oligopotent GMPs granulocyte 창시자 (GPs) 및 monocyte 창시자 (MPs 및 cMoPs, 우리는 현재 별도 수)의 절연을 허용 Ly6C 및 CD115에 대 한 얼룩 "GMP" 분수2 (LKS에서 - CD34+ FcγR안녕하세요 게이트; 그림 1)입니다. 우리는 그 후 MDPs는 주로 "CMP" 분수 있는 시연 (LKS- CD34+ FcγRlo 게이트), 또한 Flt3 포함+ CD115lo 와 Flt3- 하위 집합7 (그림 1 ). CMP Flt3+ CD115lo 분수 입양 전송 시 GMPs와 MDPs를 생성합니다. CMP-Flt3- 하위 집합 CMP Flt3+ CD115lo 셀 사이의 GMPs 중간체 처럼 창시자를 포함 합니다. MDPs, 달리 CMP Flt3+ CD115lo 와 CMP Flt3- 분수 또한가지고 megakaryocyte 및 잠재적인 적혈구.
단, 그 그것은 현재 불분명 여부 "CMP" 분수 정말 oligopotent (예: 개별 셀 CMP Flt3+ CD115lo 분수 내 neutrophil, 소유 하는 창시자를 포함 하는 것이 중요 하다 monocyte, DC, megakaryocyte, 및 잠재적인 적혈구), 또는 양자 택일로, 더 제한 된 혈통 잠재력 창시자의 혼합물을 구성. 분석 실험 (스 문화)를 형성 하는 식민지 공개 셀 granulocyte (호 중구), 적혈구, monocyte와 megakaryocyte 잠재적인 (GEMM 세포) "CMP"에서 CMP Flt3+ CD115lo 분수 CMP Flt3- 1 ,7, 하지만 DC 잠재력의 평가 허용 하지 않습니다. 대조적으로, 분석 실험을 형성 하는 식민지 "GMP" 분수1,2, oligopotent GMPs (neutrophil와 잠재적인 monocyte 창시자)의 존재를 증명 하 고이 최근 단일 셀에 의해 지원 됩니다. transcriptomic 분석8. 그러나 그것은 현재 알 수 없습니다,, 또한 다른 granulocytes (호 산 구는, basophils 그리고 돛대 세포)을 생산 하는이 oligopotent GMPs 여부.
우리 지금 보여주는 이러한 연구에 따라 어떻게 7 표면 마커 (c 키트, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C 및 CD115) 사용할 수 있습니다 식별 하 고 이러한 6 하위 집합 oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자의 분리. 여기에 설명 된 프로토콜 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화)에 대 한 적용 될 수 있다 vivo에서 입양 전송 실험 쥐, 및 분자 분석 (대량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱, 부 럽, 등).
프로토콜 구성 3 단계: 골의 단일 세포 현 탁 액의 준비 1) 세포, 조 혈 창시자 (자석 활성화 된 세포 분류), 및 3) 식별, 격리의 흐름에 의해 조상 하위 집합 원하는 경우 2) 농축 cytometry (또는 사용 하는 분석기는 다소 적절 한). 첫 번째 단계는 화관에서 골 수 세포의 분리 및 안락사 마우스의 tibias 이며 다른 앞에서 설명한 프로토콜9와 비슷합니다. 다음으로, 샘플 줄기와 조상 세포 적혈구, 호 중구, monocytes, lymphocytes, 등 의 세포 표면 표식에 대 한 항 체의 칵테일을 사용 하 여 차별화 된 세포를 고갈에 대 한 농축입니다. 이것은 필수, 하지만 조상 하위 집합의 검색을 최적화 하 고 cytometry에 필요한 시간과 조상 식별에 필요한 항 체의 양을 줄이기 위해 강력 하 게 권장 하지. Magnetic-Activated 셀 정렬 (맥) 마우스 계보 셀 고갈 키트를 사용 하 여 아래 계보 고갈 프로토콜에 설명 합니다 (CD5, CD45R에 대하여 biotinylated 항 체를 포함 된 (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, 그리고 Ter-119, 안티 비오 틴 플러스 microbeads)와 자동된 자석 분리기. 마지막 단계는 id (및 필요한 경우 정렬) cytometry에 의해 조상 하위 집합의. 항 체 패널 아래에 설명 된 4 레이저 분석기 (다소) 교류 cytometer에서 사용 하도록 설계 되었습니다 ( 표 1참조) (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> 그림 1: Neutrophil, monocyte와 DC 창시자와 차별화 경로. 와 이즈 맨 게이츠 "CMPs" (파란색)와 "GMPs" (녹색)1 중첩에 대 한 myelopoiesis7 의 최근 수정된 모델은 나와 있습니다. 이 그림은 Yáñez 외. 20177에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>마우스: 야생형 C57BL/6J (CD45.2)</td><td>The Jackson Laboratories</td><td>Cat#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#553733</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&gamma; R; 클론 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#101327</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 Ly6A/E (Sca-1; 클론 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#108114</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD117 (c-Kit; 클론 2B8) 퍼시픽 블루</td><td>BioLegend</td><td>Cat#105820</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 Ly6C (클론 HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Cat#128012</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD115 (클론 AFS98) PE</td><td>BioLegend</td><td>Cat#135506</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD135 (Flt3; 클론 A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright 절대 계수 비드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>"고갈" 프로그램 사용</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 레이저, 15가지 색상</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 레이저, 13가지 색상</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>.fcs 파일의 추가 분석</td></tr></tbody></table>

식별 및 oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

골수성 창시자 호 중구, monocytes 및 모 수석 세포 (DCs)에서 확인 하 고 혈액 및 면역 분석에 대 한 생쥐의 골 수에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 골수성 조상 인구의 세포 및 분자 속성의 연구 leukemic 변환, 기본 메커니즘을 밝힐 수 또는 면역 시스템 병원 체 노출에 응답 하는 방법을 보여 줍니다. 이전 많은 분야에서 상당한 진보를 사용 하는 골수성 조상 식별에 대 한 설명된 흐름 cytometry 전략 하지만 그들을 식별 하는 분수는 아주 이질적인. 가장 일반적으로 사용 되는 제어 전략 정의 골 분수 원하는 인구에 대 한 풍성 하 게 하지만 또한 "오염" 창시자의 많은 수를 포함 합니다. 우리의 최근 학문이이 많이 해결 선물이 여기 프로토콜 oligopotent의 6 부분 모집단의 격리를 허용 하 고 혈통 커밋된 골수성 창시자 2에서 설명한 골 분수. 3 단계는 프로토콜에 설명 합니다: 1) 절연 골 수의 세포, 2) 농축 조 혈 창시자 자기 활성화 셀 정렬 (맥에 의해 혈통 소모), 및 3) 식별 골수성 조상 cytometry (를 포함 하 여 하위 집합에 대 한 형광 활성화 된 세포 분류, FACS, 원하는 경우). 이 이렇게 조상 정량화 및 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램의 다양 한 절연을 허용 하 고 경로 및 neutrophil, monocyte, 및 DC 차별화의 메커니즘에 새로운 통찰력을 나왔고 이미 있다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 화관과 한 C57BL/6J 마우스 (6-8 주 오래 된, 남성 또는 여성)의 tibias (2 다리)에서 ~ 100 백만 세포 (적혈구, 또는 ~ 50 백만 nucleated 세포를 포함 하 여)를 얻을 수 있습니다. 1-2 백만 린- 셀 린+ 세포의 맥 고갈 마우스 당 격리할 수 있습니다.
6 골수성 조상 하위 집합의 각 셀- Lin의 ~ 1-4%를 구성합니다. 리니지 고갈 차별화 된 세포를 없애고 효율적 이며 c-키트+ 창시자 (그림 3A) 뿐만 아니라 c-키트- 세포의 큰 비율을 포함 창시자, 하지만 린- 분수에 대 한 풍부. 시 조 후 FAC...

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

이 방법은 호중구, 단핵구, 수지상 세포를 포함한 골수성 세포의 생산과 기능을 연구하는 혈액학자와 면역학자에게 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 전략보다 골수성 전구 부분 집합을 더 정확하게 식별할 수 있다는 것입니다. MACS(magnetic-activated cell sorting)를 통해 전구 세포의 골수 세포를 농축하려면 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 7개의 골수 세포에 10배당 40마이크로리터의 MACS 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.분화된 계통 양성 세포를 고갈시키려면 7개의 세포에 1 곱하기 10당 10마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 첨가하고 피펫팅으로 혼합하여 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 혼합을 통해 7개의 세포에 1 곱하기 10당 30 마이크로리터의 염색 완충액을 첨가한 다음 7개의 세포에 1 곱하기 10 당 20 마이크로리터의 항비오틴 마이크로비드를 첨가합니다. 섭씨 4도에서 15분 후, 7개 세포에 10 곱하기 10당 1밀리리터의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 8개 세포에 1배 10까지 500마이크로리터의 새로운 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.다음으로, 제조업체의 지침에 따라 자동 자기 분리기를 설정하고 레이블이 지정된 셀의 튜브를 분리기에 넣습니다. 전구 농축 계통 음성 세포를 포함하는 음성 분획을 수집하기 위해 음성 선택 프로그램을 시작합니다. 원심분리를 통해 계통 음성 세포를 펠렛화하고 이제 흰색이 된 펠릿을 계수를 위해 마우스당 2ml의 염색 완충액에 재현탁합니다.FACS로 골수성 전구 세포를 분리하기 위해, 전압 선택 및 색상 보상을 위해 8개의 대조군 마이크로 원심분리 튜브 각각에 5 계통 음성 세포에 10을 한 번 추가하고, 전구 세포 식별 및 분류를 위해 관심 있는 7개의 표면 마커 항체 모두로 염색하기 위해 나머지 세포 샘플을 9번째 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고 대조군 펠릿을 100마이크로리터의 FACS 염색 완충액에 재현탁시키고 실험 샘플 펠릿을 6개의 세포에 5배 10회당 100마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 항-CD16/CD32 항체를 Fc 감마 수용체 단일 염색 튜브와 샘플 튜브에 추가합니다.부드럽게 소용돌이치고 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 끝나면 다른 항체를 적절한 해당 단일 염색 튜브와 샘플 튜브에 추가하고 부드럽게 와류를 일으킨 후 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 끝나면 대조 튜브에 900마이크로리터의 염색 완충액을 추가하고 원심분리를 위해 7개의 세포에 10을 곱할 때마다 1ml의 염색 완충액을 시료 튜브에 추가합니다.대조군 펠릿을 튜브당 200마이크로리터의 신선한 염색 완충액에 재현탁하고 실험용 펠릿을 2.5배 10회당 500마이크로리터로 7개의 세포에 재현탁시키고 라벨링된 세포를 해당 5밀리리터 FACS 튜브로 개별 이동시킵니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 유세포 분석기를 설정하고 염색되지 않은 단일 염색 된 컨트롤을 사용하여 전압 및 색상 보정을 설정합니다. 골수성 전구 세포를 식별하고 분리하려면 실험 세포 샘플을 세포분석기에 로드하고 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 플롯을 생성하여 파편과 죽은 세포를 제외하도록 게이팅합니다.살아있는 세포와 게이트의 전방 산점도 너비 대 전방 산점도 플롯을 만들어 이중선을 제외합니다. 전방 산점도 singlet 및 gate의 측면 산란 높이 대 측면 산란 너비 플롯을 사용하여 이 과정을 반복하여 이중선을 제외합니다. Sca-1 대 c-Kit 플롯 및 게이트를 생성하여 c-Kit 양성 Sca-1 음성 전구를 선택합니다.그런 다음 CD-34 versus FC gamma receptor plot과 gate를 생성하여 혼합된 공통골수성 전구세포와 혼합된 과립구 단핵구 전구세포 집단을 선택합니다. 혼합된 공통골수성 전구세포와 혼합된 과립구 단핵구 전구세포 집단을 가능한 한 정확하게 게이트하는 것이 중요합니다. 보다 정확한 게이팅을 위해 의사 색상 밀도 플롯 또는 등고선 플롯을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다.혼합된 공통골수성 전구세포(common myeloid progenitor gate)의 세포를 사용하여 CD115 대 Flt3 플롯 및 게이트를 생성하여 공통골수성 전구세포인 Flt3 양성 CD115 저세포, 공통골수성 전구세포인 Flt3 음성 CD115 저세포, Flt3 양성 CD115 고단핵구 수지상 세포전구세포를 선택합니다. 혼합 과립구 단핵구 전구 게이트의 세포를 사용하여 Ly6C 대 FC 감마 수용체 플롯 및 게이트를 생성하여 Ly6C 음성 세포와 Ly6C 양성 세포를 선택합니다. 그런 다음 각 게이트 혼합 과립구 단핵구 전구 세포 subpopulation에 대한 CD115 대 Flt3 플롯을 생성하고 Ly6C 음성 Flt3 음성 CD115 저과립구 단핵구 전구세포, Ly6C 양성 Flt3 음성 CD115 저과립구 전구세포, Ly6C 양성 Flt3 음성 CD115 고단핵구 전구세포를 게이트합니다.최대 계통 고갈은 분화된 세포를 고갈시키고 c-Kit 양성 전구 세포를 농축하는 데 효율적입니다. 계통 음성 분획에는 여전히 일부 c-Kit 음성 세포가 포함되어 있지만 이러한 세포는 후속 유세포 분석 게이팅 단계에서 제거됩니다. FACS 분류 후 전구 수율은 사용된 분류기 설정에 따라 달라질 수 있지만, 각 분획에 대해 95% 이상의 사후 분류 순도로 각 마우스에서 분획당 1-4배 10에서 4번째 세포를 얻을 수 있어야 합니다.좋은 염색은 개체군의 깨끗한 분리에 중요합니다. 최적의 분리를 보장하기 위해 항체를 적정하거나 다른 형광단을 선택해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전구 세포를 식별하고, 샘플 간의 골수 조성 차이를 평가하고, 분자 분석을 위해 전구 세포를 분리하거나, 골수성 세포를 생성하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

여기에서는 인간 골수(hBM)에서 중배엽 전구 세포(MPC)를 분리하기 위한 최적화되고 재현성이 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. MPC는 유세포 분석과 nestin 발현을 특징으로 했습니다. 그들은 혈관 형성 잠재력을 유지하면서 기하급수적으로 증가하는 MSC와 같은 세포 배양을 일으킬 수 있는 능력을 보여주었습니다.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

배우세요 마우스 골수에서 골수성 전구체 세포를 MACS 및 FACS 기술로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 6가지 전구체 아형을 정확히 식별하여 혈액학 및 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

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