식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

이 방법은 호중구, 단핵구, 수지상 세포를 포함한 골수성 세포의 생산과 기능을 연구하는 혈액학자와 면역학자에게 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 전략보다 골수성 전구 부분 집합을 더 정확하게 식별할 수 있다는 것입니다. MACS(magnetic-activated cell sorting)를 통해 전구 세포의 골수 세포를 농축하려면 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 7개의 골수 세포에 10배당 40마이크로리터의 MACS 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

분화된 계통 양성 세포를 고갈시키려면 7개의 세포에 1 곱하기 10당 10마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 첨가하고 피펫팅으로 혼합하여 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 혼합을 통해 7개의 세포에 1 곱하기 10당 30 마이크로리터의 염색 완충액을 첨가한 다음 7개의 세포에 1 곱하기 10 당 20 마이크로리터의 항비오틴 마이크로비드를 첨가합니다. 섭씨 4도에서 15분 후, 7개 세포에 10 곱하기 10당 1밀리리터의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 8개 세포에 1배 10까지 500마이크로리터의 새로운 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

다음으로, 제조업체의 지침에 따라 자동 자기 분리기를 설정하고 레이블이 지정된 셀의 튜브를 분리기에 넣습니다. 전구 농축 계통 음성 세포를 포함하는 음성 분획을 수집하기 위해 음성 선택 프로그램을 시작합니다. 원심분리를 통해 계통 음성 세포를 펠렛화하고 이제 흰색이 된 펠릿을 계수를 위해 마우스당 2ml의 염색 완충액에 재현탁합니다.

FACS로 골수성 전구 세포를 분리하기 위해, 전압 선택 및 색상 보상을 위해 8개의 대조군 마이크로 원심분리 튜브 각각에 5 계통 음성 세포에 10을 한 번 추가하고, 전구 세포 식별 및 분류를 위해 관심 있는 7개의 표면 마커 항체 모두로 염색하기 위해 나머지 세포 샘플을 9번째 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고 대조군 펠릿을 100마이크로리터의 FACS 염색 완충액에 재현탁시키고 실험 샘플 펠릿을 6개의 세포에 5배 10회당 100마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 항-CD16/CD32 항체를 Fc 감마 수용체 단일 염색 튜브와 샘플 튜브에 추가합니다.

부드럽게 소용돌이치고 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 끝나면 다른 항체를 적절한 해당 단일 염색 튜브와 샘플 튜브에 추가하고 부드럽게 와류를 일으킨 후 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 끝나면 대조 튜브에 900마이크로리터의 염색 완충액을 추가하고 원심분리를 위해 7개의 세포에 10을 곱할 때마다 1ml의 염색 완충액을 시료 튜브에 추가합니다.

대조군 펠릿을 튜브당 200마이크로리터의 신선한 염색 완충액에 재현탁하고 실험용 펠릿을 2.5배 10회당 500마이크로리터로 7개의 세포에 재현탁시키고 라벨링된 세포를 해당 5밀리리터 FACS 튜브로 개별 이동시킵니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 유세포 분석기를 설정하고 염색되지 않은 단일 염색 된 컨트롤을 사용하여 전압 및 색상 보정을 설정합니다. 골수성 전구 세포를 식별하고 분리하려면 실험 세포 샘플을 세포분석기에 로드하고 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 플롯을 생성하여 파편과 죽은 세포를 제외하도록 게이팅합니다.

살아있는 세포와 게이트의 전방 산점도 너비 대 전방 산점도 플롯을 만들어 이중선을 제외합니다. 전방 산점도 singlet 및 gate의 측면 산란 높이 대 측면 산란 너비 플롯을 사용하여 이 과정을 반복하여 이중선을 제외합니다. Sca-1 대 c-Kit 플롯 및 게이트를 생성하여 c-Kit 양성 Sca-1 음성 전구를 선택합니다.

그런 다음 CD-34 versus FC gamma receptor plot과 gate를 생성하여 혼합된 공통골수성 전구세포와 혼합된 과립구 단핵구 전구세포 집단을 선택합니다. 혼합된 공통골수성 전구세포와 혼합된 과립구 단핵구 전구세포 집단을 가능한 한 정확하게 게이트하는 것이 중요합니다. 보다 정확한 게이팅을 위해 의사 색상 밀도 플롯 또는 등고선 플롯을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

혼합된 공통골수성 전구세포(common myeloid progenitor gate)의 세포를 사용하여 CD115 대 Flt3 플롯 및 게이트를 생성하여 공통골수성 전구세포인 Flt3 양성 CD115 저세포, 공통골수성 전구세포인 Flt3 음성 CD115 저세포, Flt3 양성 CD115 고단핵구 수지상 세포전구세포를 선택합니다. 혼합 과립구 단핵구 전구 게이트의 세포를 사용하여 Ly6C 대 FC 감마 수용체 플롯 및 게이트를 생성하여 Ly6C 음성 세포와 Ly6C 양성 세포를 선택합니다. 그런 다음 각 게이트 혼합 과립구 단핵구 전구 세포 subpopulation에 대한 CD115 대 Flt3 플롯을 생성하고 Ly6C 음성 Flt3 음성 CD115 저과립구 단핵구 전구세포, Ly6C 양성 Flt3 음성 CD115 저과립구 전구세포, Ly6C 양성 Flt3 음성 CD115 고단핵구 전구

최대 계통 고갈은 분화된 세포를 고갈시키고 c-Kit 양성 전구 세포를 농축하는 데 효율적입니다. 계통 음성 분획에는 여전히 일부 c-Kit 음성 세포가 포함되어 있지만 이러한 세포는 후속 유세포 분석 게이팅 단계에서 제거됩니다. FACS 분류 후 전구 수율은 사용된 분류기 설정에 따라 달라질 수 있지만, 각 분획에 대해 95% 이상의 사후 분류 순도로 각 마우스에서 분획당 1-4배 10에서 4번째 세포를 얻을 수 있어야 합니다.

좋은 염색은 개체군의 깨끗한 분리에 중요합니다. 최적의 분리를 보장하기 위해 항체를 적정하거나 다른 형광단을 선택해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전구 세포를 식별하고, 샘플 간의 골수 조성 차이를 평가하고, 분자 분석을 위해 전구 세포를 분리하거나, 골수성 세포를 생성하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.