칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 펩타이드의 항진균 활성 정량화

펩타이드는 새로운 항진균 분자로 연구되고 있습니다. 이 프로토콜은 인간 진균 병원체 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 효능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 제공하는 동시에 한천에서 생성해야 하는 다른 방법에 비해 실험 시간과 플라스틱 폐기물을 줄입니다.

칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 활성을 테스트하는 것 외에도, 이 프로토콜은 다른 효모 형성 세포에 대한 활성을 테스트하고 소분자 항진균제의 활성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 원하는 칸디다 알비칸스 균주를 배양 튜브에서 액체 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 또는 YPD 배지 10밀리리터에 접종하는 것으로 시작합니다. 회전식 셰이커에서 섭씨 30도 및 230rpm에서 밤새 배양 물을 재배하십시오. C.albicans의 하룻밤 배양을 계대배양하고 600 나노미터 파장에서 대략 1.0 내지 1.2의 광학 밀도로 성장시킨다.

각 펩타이드를 멸균수에 가용화하고 원하는 최고 농도의 2배로 희석한 다음, 원하는 펩타이드 스톡 용액 40마이크로리터를 둥근 바닥의 96웰 플레이트에 있는 각 행의 첫 번째 웰에 추가합니다. 다음으로, 20 마이크로 리터의 멸균 초순수를 펩타이드가 들어있는 행의 2-12 열에 추가합니다. 플레이트를 가로질러 컬럼 10까지 펩타이드 스톡 용액을 연속적으로 희석하려면 컬럼 1에서 컬럼 2로 20마이크로리터를 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

컬럼 10 농도의 1 내지 512 희석에서 40 마이크로리터의 펩타이드 용액을 포함하는 컬럼 1까지 희석 과정을 반복한다. 완료되면 컬럼 10에서 20마이크로리터의 펩타이드 용액을 제거하고 버립니다. C.albicans 계대배양물을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 3, 900g에서 원심분리한다.

피펫팅 또는 디캔팅으로 상층액을 제거합니다. 1 밀리리터의 2 밀리몰 인산 나트륨 완충액으로 펠렛을 재현탁하고 현탁액을 1.7 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 버립니다.

다시, 펠릿을 1 밀리리터의 2-밀리몰 소듐 포스페이트 완충액에 재현탁시키고, 세척된 세포를 1 밀리리터의 소듐 포스페이트 완충액에 남겨두도록 2회 더 세척한다. 세척된 세포 현탁액의 세포 밀도를 결정하고, 이 현탁액을 2-밀리몰 소듐 포스페이트 완충액에서 밀리리터당 10 내지 5번째 세포로 5배로 희석한다. 희석된 C.albicans 세포 현탁액을 취하여 각 행의 컬럼 1 내지 10 및 컬럼 12에 20 마이크로리터를 첨가한 다음, 컬럼 11에 2-밀리몰 인산나트륨 완충액 20 마이크로리터를 첨가한다.

플레이트 1을 덮고 섭씨 30도의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 플레이트 번호 2의 모든 웰에 100 마이크로리터의 YPD를 첨가하여 생존율을 정량화하기 위해 새로운 96-웰 배양 플레이트를 준비한 다음, 플레이트 2의 모든 웰에 100 마이크로리터의 2-밀리몰 인산나트륨 완충액을 첨가한다. 플레이트 1의 샘플을 희석하려면 인큐베이터에서 플레이트 1을 회수하고 각 웰에 280마이크로리터의 1밀리몰 인산나트륨 완충액을 추가합니다.

내용물을 피펫으로 잘 혼합 한 후 플레이트 1에서 플레이트 2의 해당 웰로 8 마이크로 리터를 옮깁니다. 완료되면 덮개가 있는 플레이트 2를 섭씨 350도에서 17시간 동안 30rpm의 마이크로타이터 플레이트 셰이커에 놓습니다. 플레이트 2의 모든 웰을 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 모든 세포가 재현탁되도록 합니다.

흡광도 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트 2의 각 웰에 대해 600나노미터 파장에서 광학 밀도 판독값을 얻습니다. 성장 억제 백분율을 계산하고 C.albicans 성장에 대한 펩타이드의 영향을 결정하기 위해 펩티드 농도의 함수로 생존율 감소를 도표화합니다. 펩티드를 C.albicans 세포와 함께 배양한 후, 집락 형성 단위 또는 CFU 계수 방법 및 광학 밀도 측정을 통합한 설명된 프로토콜을 사용하여 항진균 활성을 정량화했습니다.

광학 밀도 판독값을 사용한 데이터는 반복실험의 작은 표준 편차로 표시된 바와 같이 재현성이 높았습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 균사 세포에서 광학 밀도 측정이 신뢰할 수 없기 때문에 세포를 섭씨 30도에서 배양하여 칸디다 알비칸스 세포를 효모 형태로 유지합니다. 이 방법의 효율성으로 인해 연구자들은 더 많은 수의 펩타이드와 펩타이드 농도를 테스트하여 펩타이드 활성에 대한 높은 삼중 연구를 수행할 수 있었습니다.