실험적으로 진화한 개체군에서 구조적 변이의 역학을 따릅니다.
February 3rd, 2023
우리는 실험적 진화 동결 아카이브에 쉽게 적응할 수 있는 비단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자 역학을 추적하는 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 삼중항 PCR 기술은 실험적 진화 과정에서 삽입 대립 유전자의 상대적 빈도를 정량화하기 위해 자동화된 병렬 모세관 전기영동과 결합되었습니다.
삽입, 결실, 복제 및 반전과 같은 구조적 변형은 과거에는 실험적으로 추적하기가 더 어려웠으며 앰플리콘 시퀀싱으로 빈도를 정확하게 측정할 수 없었습니다. 여기서 우리는 시간이 지남에 따라 구조적 변이 대립 유전자 빈도를 따르기 위해 삼중 프라이머 설계와 병렬 모세관 전기 반출을 결합하는 간단한 비용 효율적인 기술을 제공합니다. 이 방법은 실험적 진화에서 종점 시퀀싱을 보완하고 새로운 대립 유전자의 빈도를 추적하도록 설계되었습니다.
우리는 이 방법이 숙주 내 병원체 데이터로 작업하는 사람들에게도 도움이 되기를 바랍니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 연구 조교 인 Jeanne Hamet이 될 것입니다. 방법의 다른 단계는 파생된 대립유전자가 mutS라고 하는 박테리아 유전자에 IS10 삽입으로 인한 경우에 표시됩니다.
먼저 돌연변이 삽입 부위 주변의 야생형 대립유전자에서 짧은 앰플리콘을 증폭하기 위해 한 쌍의 프라이머를 설계합니다. 삽입서열 내에 2개의 정방향 프라이머 3개를 설계하여 야생형 앰플리콘으로부터 약간의 크기 변수를 생성한다. 고정된 야생형 및 돌연변이 대립유전자 클론의 24시간 배양에서 DNA를 추출하는 것으로 시작합니다.
DNA를 정량화한 후 각 DNA 추출물을 물로 마이크로리터당 5나노그램으로 희석합니다. 두 샘플을 50/50 비율로 고정합니다. 10나노그램의 DNA 샘플, 프라이머 및 PCR 마스터 믹스를 포함하는 20마이크로리터 반응을 설정합니다.
다음으로, 2%agarose gel을 이용하여 전기영동에 의해 PCR 산물을 분리한다. 야생형의 앰플리콘과 돌연변이 사이의 크기 차이는 겔에서 확인되어야 합니다. 보정 곡선을 얻으려면 먼저 야생형 DNA와 돌연변이 DNA를 다양한 비율로 혼합합니다.
PCR 산물을 마이크로리터당 0.1 나노그램 농도로 희석한다. 분리 젤을 준비하려면 신선한 젤과 염료를 혼합하십시오. 입구 버퍼를 교체합니다.
헹굼 버퍼를 평행 모세관 전기영동 기기의 올바른 서랍 위치에 놓습니다. 22 마이크로리터의 희석제 마커를 96 웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 이제 희석된 PCR 산물 2마이크로리터를 각 샘플 웰에 추가합니다.
하나의 웰에 1에서 6, 000 염기쌍 크기의 고감도 키트에서 DNA 크기 사다리를 추가합니다. 마이크로플레이트를 평행 모세관 전기영동 기기에 기기 소프트웨어에서 선택한 실행으로 놓습니다. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.
먼저, 알려진 크기에 따라 피크를 식별합니다. 각 앰플리콘을 정량화하여 검량선을 생성합니다. 마지막으로 두 대립 유전자의 상대적 양이 올바르게 측정되었는지 확인합니다.
이 보정 곡선은 PCR 증폭 및 병렬 모세관 전기영동 후 구조적 변형의 양을 계산하는 데 사용됩니다. 이러한 대표적인 결과는 mutS 유전자의 파괴적인 삽입을 따릅니다. 녹다운과 mutS는 하이퍼 돌연변이 표현형으로 이어져 박테리아가 기본 돌연변이 비율보다 더 많은 돌연변이를 샘플링할 수 있도록 합니다.
제시된 방법을 사용하여 mutS 구조적 변형 빈도를 1000세대에 걸쳐 추적했습니다. 신흥 돌연변이 대립 유전자의 비 단조 궤적이 밝혀졌습니다. 돌연변이 대립유전자는 680세대에서 처음 발견되었습니다.
그런 다음 대립 유전자의 빈도가 급격히 증가하여 713 세대까지 67 %에 도달했습니다. 이 증가는 정체되어 다음 53 세대 동안 10 % 만 증가하여 76 %예기치 않게 돌연변이 대립 유전자 빈도는 76 세대 동안 49 %에서 13 %로 감소한 후 고정으로 증가했습니다. 이 방법은 실험적 진화를 연구하는 사람들에게 도움이 될 것입니다.
이 프로토콜을 통해 사용자는 고정된 아카이브를 가져와 엔드포인트 시퀀싱 데이터로 관찰할 수 없는 진화 궤적을 탐색할 수 있습니다.
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개요
본 연구는 실험적 진화 과정에서 삽입을 포함한 구조 변이 알레르의 동태를 추적하는 새로운 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 3중 프라이머 설계와 병렬 모세관 전기영동을 결합함으로써, 이 기술은 시간에 따른 알레르 빈도 변화를 밝혀내어 진화 경로를 연구하는 데 유용함을 입증합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 유전학
- 실험적 진화
- 구조 변이
배경
- 구조 변이는 기존 방법으로는 정량화하기 어려웠습니다.
- 삽입 알레르 빈도를 증폭하고 측정하는 것은 진화에서의 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다.
- 이 방법은 기존 시퀀싱 기술을 보완하는 것을 목표로 합니다.
사용된 방법
- 3중 PCR 기술과 자동화된 병렬 모세관 전기영동 결합
- 세균 모델 시스템 (mutS 유전자)
- 알레르 빈도의 정량적 평가
주요 결과
- 1000 세대를 거쳐 mutS 알레르의 비단조적 궤적을 성공적으로 추적했습니다.
- 돌연변이 빈도가 처음에는 급증했다가 고정되기 전에 감소하는 복잡한 동태를 밝혀냈습니다.
- 진화 연구를 위한 동결 보관 샘플 분석 적용을 시연했습니다.
결론
- 본 연구는 종점 시퀀싱으로는 놓칠 수 있는 구조 변이 동태를 관찰하는 강력한 방법을 소개합니다.
- 이 접근 방식은 실험적 진화와 병원체 동태를 연구하는 연구자들에게 중요한 의미를 갖습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantifying structural variant (SV) allele dynamics is critical for understanding genetic adaptation and phenotypic diversity in microbial and pathogen populations. This method enables precise, cost-effective tracking of SV frequencies, addressing a key gap in discovery-stage genomics and supporting predictive confidence in variant-driven functional studies. Its scalability and compatibility with pooled samples position it as a valuable tool for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative tracking of SV allele frequencies to clarify variant-driven phenotypes.
- Supports functional target validation by monitoring de novo allele emergence in evolving populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-monotonic variant trajectories over time.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening by quantifying SVs in pooled samples.
- Standardizes SV detection with reproducible primer design and capillary electrophoresis readouts.
- Enables scalable, parallelized analysis suitable for high-throughput variant screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling SV quantification in intra-host pathogen populations.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by tracking variant dynamics in archived samples.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement decisions in microbial and pathogen research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic SV tracking from early hypothesis testing through translational research, especially in microbial and pathogen systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying emerging SVs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative SV measurements for assay readiness.
- Analytics: Provides calibration-based quantification and comparative analysis of allele frequencies.
- Translational Research: Enables SV tracking in natural and intra-host populations, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, cost-effective workflow for SV quantification across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in SV-driven studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible SV quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying variant impact early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of SV-related targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primer design and capillary electrophoresis instrumentation.
- Needs access to parallel capillary electrophoresis and quantitative analysis software.
- Demands cross-team standardization of calibration and normalization protocols.
- Adaptable to various SV types and pooled sample contexts with appropriate primer sets.
- Limited by requirement for detectable amplicon size differences and calibration accuracy.
