Name: 식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 식물 뿌리 세포 유형을 분리하고 전사체 라이브러리를 구축하는 방법을 Arabidopsis thaliana를 이용하여. 이 프로토콜은 단일세포 RNA 시퀀싱을 통해 유전자 발현 차이를 밝혀내어 세포 내 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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우리는 Shanghai Jiao Tong University 농업 및 생물학 학교의 단일 세포 다중 오믹스 시설에서 이 프로토콜을 설정했으며 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 32070608), 상하이 푸장 프로그램(보조금 번호 20PJ1405800) 및 상하이 자오퉁 대학교(보조금 번호 Agri-X20200202, 2019TPB05).

다음 프로토콜은 목부-극 페리사이클 세포(J0121), 측근 초기 세포, 외측 뿌리 캡 세포(J3411), 내피 및 피질 세포(J0571)(그림 1A)와 같은 뿌리 세포 유형에 대한 형광 및 형광 마커 라인이 없는 A. thaliana 야생형(WT) 종자에 최적화되었습니다. 이전에 발표된 보고서14에 이어 야생형 애기장대 식물에 GATA23 프로모터 구동 GFP 구축물을 도입함으로써 생성된 측근 개시 세포 마커 라인을 제외한 모든 마커 라인은 상업적 공급원(재료 표 참조)으로부터 수득하였다.
1. 식물 재료의 준비
<ol><li>A. thaliana WT 종자 및 형광 마커 라인 종자를 실온의 회전 배양기에서 20% 표백제로 15분 동안 배양하여 살균합니다.</li>
	<li>씨앗을 이중 증류수 (ddH2O)로 3-5 회 헹굽니다. 멸균된 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행합니다.</li>
	<li>WT 및 리포터 라인 시드를 0.8% 한천(w/v)15의 절반 강도 Murashige 및 Skoog(MS) 배지에 플레이트합니다. 4°C에서 2일 동안 성층화한 후 식물을 5일(23°C에서 16시간 빛) 동안 수직으로 성장시킵니다.</li>
</ol>2. 프로토플라스팅
<ol><li>용액 A 및 용액 B로 지칭되는 원형질체 용액 2,5를 준비한다(재료 표 참조).<ol><li>400 mM 만니톨, 0.05% BSA, 20 mM MES (pH 5.7), 10 mMCaCl2, 및 20 mM KCl을 함유하는 용액 A를 준비한다 ( 재료 표 참조). 용액 A를 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.</li>
		<li>용액 A의 새로운 분취량에 1%(w/v) 셀룰라아제 R10, 1%(w/v) 셀룰라아제 RS, 1%(w/v) 헤미셀룰라아제, 0.5%(w/v) 펙톨리아제 및 1%(w/v) 마세로자임 R10을 첨가하여 용액 B를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실험을 시작하기 전에 용액 A와 용액 B를 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다.</li>
	<li>깨끗한 칼날이나 가위로 뿌리를 잘라내고 뿌리를 ~0.5cm 크기로 자릅니다. 뿌리를 1.5mL의 용액 B에 담근 다음 실온에서 1.5-2시간 동안 부드럽게 회전(약 18rpm)합니다.</li>
	<li>40μm 스트레이너 메쉬를 통해 뿌리 원형질체를 여과합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>스트레이너 메쉬를 1-2mL의 용액 A로 헹굽니다.</li>
	<li>단계 2.4 및 단계 2.5의 액체를 합하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 피펫으로 상청액을 버리고 용액 A 500-600 μL에 세포 펠릿을 재현탁 한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>세포 분류를 위해 재현탁된 세포 용액을 새로운 5mL 시험관으로 옮깁니다.</li>
</ol>3. 형광 활성화 세포 분류(FACS)
<ol><li>전원을 켜고 분류기에서 기기 설정 단계를 완료합니다( 재료 표 참조). 형광 채널을 선택하고, WT 플랜트(형광 없음)를 대조군으로 사용하여 자가형광의 기준선을 결정하고, 형광 강도 및 FSC/SSC 싱글렛을 기반으로 분류 게이트를 조정합니다(그림 2).</li>
	<li>500μL의 용액 A(단계 2.1.1)를 1.5mL 수집 튜브에 추가하여 세포가 손상되는 것을 방지합니다. 튜브 당 2,000-3,000 개의 세포를 수집합니다.</li>
	<li>분류 후, 즉시 샘플을 얼음 위에 놓고, 세포를 함유하는 수집 튜브를 4°C에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리하고, 피펫으로 상청액을 제거한다.</li>
	<li>분류된 세포 2μL를 취하여 형광 현미경을 사용하여 형광을 확인합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>분류된 셀을 -80°C에 보관하거나 라이브러리 구축에 즉시 사용합니다(4단계).</li>
	<li>단일 셀 인덱스 정렬의 경우 96웰 플레이트를 어댑터에 넣습니다. 물방울이 판의 중앙 구멍에 떨어지도록 판의 위치를 보정하십시오. 정렬 시 단일 셀 정렬 모드를 선택하고 정렬된 셀의 목표 수를 1로 입력하고 정렬을 시작합니다.</li>
</ol>4. Smart-seq2 라이브러리 준비
<ol><li>입력량이 매우 적기 때문에 오염이 없는 환경에서 single-cell type RNA-seq 라이브러리 구축을 수행합니다. 실험을 시작하기 전에 표면 오염 제거제8 ( 재료 표 참조)과 75% 에탄올로 벤치를 청소합니다.</li>
	<li>0.33 μL의 10% Triton X-100, 0.55 μL의 RNase 억제제 및 0.22 μL의 0.1 M DTT를 조합하여 용해 완충액(혼합물 A)(표 1)을 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>혼합물 A 1μL를 분류된 샘플에 넣고 멸균 유봉으로 분쇄합니다. 바람직한 샘플 부피는 ≤0.5 μL; RNase가 없는 물을 사용하여 부피를 14μL로 구성합니다. 각 단일 세포 샘플을 0.2mL의 얇은 벽으로 된 PCR 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>0.44 μL의 oligo-dT 30 VN 역전사(RT) 반응 프라이머(100 μM)와 4.4 μL의 dNTP(10mM)를 포함하는 혼합물 B를 준비합니다(표 2)( 표 참조).</li>
	<li>각 튜브의 샘플 14μL에 혼합물 B 4.4μL를 넣고 샘플을 부드럽게 피펫으로 혼합한 다음 샘플을 72°C에서 3분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 즉시 샘플을 얼음 위에 올려 놓고 올리고-dT를 폴리 A 테일에 혼성화한다.</li>
	<li>역전사 반응 혼합물(혼합물 C)을 준비한다(표 3)( 재료 표 참조). 시료가 들어 있는 각 튜브에 혼합물 C 21.6μL를 추가합니다. 일반적인 PCR 기기에서 RT 프로그램을 켭니다(표 4).</li>
	<li>얼음 위에서 사전 증폭 반응을 수행합니다. 44 μL의 2x PCR 중합효소 혼합물과 0.88 μL의 IS PCR 프라이머 (10 μM)를 조합하여 혼합물 D를 준비한다 (표 5) ( 표 참조). 40 μL의 RT 반응 생성물에 40 μL의 혼합물 D를 첨가하고, 프리증폭 프로그램을 실행한다(표 6).</li>
	<li>Ampure XP 비드를 사용하여 사전 증폭 반응 생성물을 정제합니다( 재료 표 참조). 4.7단계의 각 샘플에 48μL의 비드(0.6:1 비율)를 추가하고 피펫팅으로 샘플을 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 샘플이 들어 있는 1.5mL 튜브를 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 비드를 방해하지 않고 샘플에서 상청액을 조심스럽게 버리십시오.</li>
	<li>비드를 80% 에탄올 200μL에 재현탁하여 세척하고 에탄올 함유 상청액을 버리기 전에 샘플을 자기 분리 스탠드( 재료 표 참조)에 3분 더 놓습니다.</li>
	<li>샘플을 10분 동안 자연 건조하고 공기 건조 중 오염 및 교차 오염을 방지하기 위해 튜브를 덮습니다.</li>
	<li>비드를 20 μL의ddH2O에 재현탁하고, 샘플을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 5분 동안 자기 분리 스탠드 위에 놓는다.</li>
	<li>각 튜브에서 상층액 18μL를 피펫으로 꺼내고 샘플을 새 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1μL의 샘플을 사용하여 DNA 정량 키트를 사용하여 cDNA의 품질을 평가하고, 단편 분석기( 재료 표 참조)를 사용하여 각 사전 라이브러리의 크기 분포를 결정하고, 나머지 샘플을 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>시퀀싱 라이브러리 준비 키트를 사용하여 단계 4.13의 사전 라이브러리 제품으로부터 일루미나 시퀀싱(16)을 위한 cDNA 라이브러리(8)를 구축한다(재료 표 참조).</li>
	<li>Ampure XP 비드를 사용하여 라이브러리를 정제하고(단계 4.14부터) 정제된 라이브러리를 정량화하고, 단계 4.13에 따라 각 라이브러리의 크기 분포를 결정합니다. 참고: 각 라이브러리의 동일한 나노몰을 풀링하여 그 중 어느 것도 동일한 Illumina 인덱스 조합을 갖지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 라이브러리를 원하는 시퀀싱 출력에 따라 비율로 풀링하고 Illumina 시퀀서의 동일한 레인에서 함께 시퀀싱할 수 있습니다. 일반적으로 각 라이브러리를 4-6GB 깊이로 시퀀싱하면 > 1,000만 개의 매핑된 읽기가 생성되며 애기장대 게놈의 20x-30x 범위를 제공합니다. 더 낮은 시퀀싱 깊이도 허용되지만 차등 발현 분석의 중요성에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>5. RNA-seq 데이터 분석
<ol><li>Trim-Galore17을 사용하여 원시 판독을 트리밍한 후 hisat2 18(daehwankimlab.github.io/hisat2)을 사용하여 참조 게놈에 매핑하고 Picard19(broadinstitute.github.io/picard)를 사용하여 PCR 중복 단편을 제거합니다.</li>
	<li>각 샘플에 대해 최소 3개의 생물학적 복제물을 사용하여 DESeq220 으로 차등적으로 발현된 유전자(DEG)의 원시 카운트 처리 및 후속 분석을 수행합니다. Pheatmap 패키지를 사용하여 유전자 발현의 클러스터링을 수행하고 발현 히트맵에서 시각화합니다. 참고: 유전자 및 TE(전치 가능한 요소)의 RPKM(킬로베이스당 매핑된 읽기 수당 읽기 수) 값은 Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie)로 계산되고 게놈 브라우저에서 시각화되었습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).</li>
<li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li>
<li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li>
<li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li>
<li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+aux%2FIAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li>
<li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li>
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<li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAsik%3A+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Source+Software%22%5BJournal%5D)">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li>
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<li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).</li>
</ol>

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Smart-seq2 기반 프로토콜은 수백개의 셀(8)로부터 신뢰할 수 있는 시퀀싱 라이브러리를 생성할 수 있다. 출발 물질의 품질은 전사체 분석의 정확성에 필수적입니다. FACS는 관심 세포를 준비하기 위한 강력한 도구이지만, 이 절차, 특히 원형질체 단계는 식물 응용 분야에 최적화되어야 합니다. 레이저 포획 미세해부(LCM) 또는 수동 해부된 세포도 입력(25,26)으로서 사용될 수 있으므로, 여기에 제공된 프로토콜은 공지된 마커 유전자를 갖거나 갖지 않는 다양한 식물 종 및 세포 유형에서 잠재적으로 사용될 수 있다.
식물 재료의 준비 식물 발달 생물학에서 FACS는 일반적으로 형광 마커를 발현하는 농축 세포 집단을 분리하는 데 사용됩니다. 이러한 마커를 발현하는 식물은 원형질체이며, 원형질체는 ...

세포는 모든 생명체의 기본 단위이며 구조적 및 생리적 기능을 수행합니다. 다세포 유기체의 세포는 명백한 동시성을 나타내지만, 다른 유형과 개별 세포의 세포는 발달 및 환경 반응 동안 전사체에 차이를 나타냅니다. 고처리량 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 이질성을 이해하는 데 있어 전례 없는 성능을 제공합니다. 식물 과학에 scRNA-seq를 적용하면 식물 세포 아틀라스1을 성공적으로 구성하는 데 기여했으며, 식물 조직2에서 희귀 세포 분류군을 식별하는 데 사용되었으며, 식물 조직의 세포 유형 구성에 대한 통찰력을 제공하고, 식물 발달 및 분화 중에 사용되는 세포 정체성 및 중요한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 식물 조직(1,2,3)에서 시공간 발달 궤적을 추론하여 새로운 마커 유전자4를발견하고, scRNA-seq를 사용하여 중요한 전사 인자5의 기능을 연구하여다른 식물3에서 동일한 세포 유형의 진화적 보존을 밝힐 수 있다. 비생물적 스트레스는 식물의 성장과 발달에 가장 중요한 환경적 영향 중 하나입니다. 단일 세포 전사체 시퀀싱을 통해 다양한 치료 조건에서 식물 조직의 세포 유형 구성 변화를 탐색함으로써 비생물적 스트레스 반응 메커니즘도 해결할 수 있습니다6.
scRNA 염기서열 분석을 사용하여 세포 유형 간의 전사 이질성을 해결할 수 있는 가능성은 세포 분리 방법 및 염기서열 분석 플랫폼에 따라 다릅니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 광 산란 및 세포의 형광 특성을 기반으로 scRNA-seq를 위해 세포의 하위 집단을 분리하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 형질전환 기술에 의한 형광 마커 라인의 개발은 FACS7에 의한 세포 분리의 효율성을 크게 향상시켰습니다. Smart-seq28을 사용하여 scRNA-seq를 수행하면 세포 이질성을 해부하는 능력이 더욱 향상됩니다. Smart-seq2 분석법은 유전자 검출에 대한 민감도가 우수하며, 낮은 전사체 입력(transcript input)에서도 유전자를 검출할 수 있다 9. 벌크 세포 유형 수집 외에도 최신 세포 분류기는 단일 세포 인덱스 분류 형식을 제공하여 Smart-seq210 또는 CEL-seq211과 같은 기타 다중 RNA-seq 방법을 사용하여 단일 세포 분해능으로 전사체 분석을 가능하게 합니다. 단일 세포 또는 세포 유형 분류는 병렬 다중 오믹스 연구(parallel multi-omics studies)와 같은 다른 많은 다운스트림 응용 분야에 잠재적으로 사용될 수 있습니다12,13. 여기에 제시된 것은 FACS에 의해 애기장대 마커 세포주의 뿌리에서 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 식물 세포 유형을 분리하기 위한 강력하고 다재다능한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 또한 다운스트림 전사체 분석을 위한 Smart-seq2 라이브러리 구성을 포함합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 스트레이너</td><td>소르파&nbsp;</td><td>622110</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Yeasen</td><td>70101ES76</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 단편 분석기</td><td>Aglient</td><td>Aglient 5200</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 고감도 DNA 키트</td><td>Aglient</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP 비드</td><td>BECKMAN</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>베타인</td><td>위안예</td><td>S18046-100g</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Mr Muscle</td><td>FnBn83BK</td><td>20%(v/v) 표백제</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>yuanye</td><td>S24109-500g</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 R10</td><td>야쿠르트(일본)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 RS</td><td>야쿠르트(일본)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(1.5mL)</td><td>에펜돌프</td><td>30121589</td><td></td></tr><tr><td>DNase, RNase, DNA 및 RNA Away Surface Decontaminants</td><td>Beyotime</td><td>R0127</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (0.1 M)</td><td> invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092680</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD FACS Melody</td><td>BD-65745</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁&nbsp; (1000 &마이크로; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁&nbsp; (200 &마이크로; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF140-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁(10 &마이크로; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF104-10-Q</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁(100 &마이크로; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>4차원 회전 믹서</td><td>Kylin -Bell</td><td>BE-1100</td><td></td></tr><tr><td>반셀룰라아제</td><td>시그마</td><td>9025-56-3</td><td></td></tr><tr><td>IS PCR 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA</td></tr> <tr><td>HiFi HotStart ReadyMix( 2X)</td><td>로슈&nbsp;</td><td></td><td></td>7958935001</tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9032-75-1</td><td></td></tr><tr><td>자기 분리 스탠드</td><td>invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td><td>알라딘</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>알라딘</td><td>145224948</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>yuanye</td><td>R21455-500ml</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5425</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 미니 원심분리기</td><td>Titan</td><td>Timi-10k</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트</td><td>illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>oligo-dT30VN 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'PCR</td></tr> <tr><td>기기</td><td>열 순환기</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>Plant marker lines</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td><td>invitrogen</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광측정기</td><td>invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&nbsp; (w/v)헤미셀룰라아제, 0.5 %&nbsp; (w/v)pectolyase 및 1%&nbsp; (승/패) 용액의 신선한 분취액에 Macerozyme R10 멸</td></tr><tr><td>균 유봉</td><td>BIOTREAT 453463</td><td></td><td></td></tr><tr><td>여과기 (40 &micro; m )</td><td>소르파&nbsp;</td><td>251100</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 역전사효소(200 U/&micro; L)</td><td>invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 완충액 (5x)</td><td>invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>시험관(5mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>캡이 있는 얇은 벽 PCR 튜브(0.5mL)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-05-C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>TSO 프라이머</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'</td></tr><tr><td>와류</td><td>타이탄</td><td>VM-T2</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

다세포 유기체에서 발달 프로그래밍 및 환경 반응은 다른 세포 유형 또는 세포 내에서도 매우 다양할 수 있으며, 이를 세포 이질성이라고 합니다. 최근 몇 년 동안 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술과 결합된 단일 세포 및 세포 유형 분리는 단일 세포 분해능에서 생물학적 과정을 연구하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 그러나 식물 세포를 분리하는 것은 식물 세포벽의 존재로 인해 상대적으로 더 어려우며, 이는 식물에서 단일 세포 접근법의 적용을 제한합니다. 이 프로토콜은 식물 세포를 사용한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 단일 세포 및 세포 유형 분리를 위한 강력한 절차를 설명하며, 이는 다운스트림 다중 오믹스 분석 및 기타 연구에 적합합니다. 애기장 대 뿌리 형광 마커 라인을 사용하여 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 특정 세포 유형이 어떻게 분리되는지 보여줍니다. 또한, Smart-seq2를 이용한 효과적인 다운스트림 전사체 분석 방법도 제공된다. 세포 분리 방법 및 전사체 분석 기술은 다른 세포 유형 및 식물 종에 적용할 수 있으며 식물 과학 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있습니다.

원형질체 분리 이 프로토콜은 형광 A. thaliana 루트 마커 라인의 원형질체 분류에 효과적입니다. 이러한 마커 라인은 형광 단백질과 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자를 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다(그림 1). 수많은 조직과 기관이 모델 식물과 작물에서 특정 형광 마커를 발현하는 세포 유형으로 해부되었습니다.
FACS 모집단, 분류된 세포 및 라이브러리 QC 야생형 식물을 대조군으로 사용하고 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)과 같은 게이트를 설정하여 관심 세포의 주요 집단과 자가형광 기준선을 결정하고 형광 특이적 표시 세포를 성공적으로 분류했습니다(그림 2). 최종 시퀀싱 라이브러리의 품질(단계 4.15로부터)은 단편 크기 분포 분석에 의...

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

단일 세포 또는 세포 유형에 대한 전사체 분석은 이질성에 의해 가려지는 유전자 발현의 미묘한 차이를 감지할 수 있으며, 이는 정교한 세포 내 조절 메커니즘을 밝히는 강력한 도구입니다. 형광 활성화 세포 분류 후 RN-seq 분석은 높은 전사체 검출 감도 및 다른 다중 오믹 접근법과의 호환성을 갖춘 단일 세포 또는 벌크 세포 유형 모드에서 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 처음 사용하는 사용자는 원형질체 분류 및 RNA-seq 라이브러리 준비의 일부 단계에 주의를 기울여야 합니다.Jun Zhang과 함께 우리 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Rongrong Xie가 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 먼저 애기장대 야생형 및 형광 마커 라인 종자를 20% 표백제에 넣고 실온에서 회전 배양기를 사용하여 15분 동안 배양하여 종자를 살균합니다. 멸균 된 벤치에서 작업하는 동안 이중 증류수로 씨앗을 3-5 번 헹굽니다.야생형 및 리포터 라인 종자를 부피 한천당 0.8% 중량으로 절반 강도 MS 배지에 플레이트합니다. 섭씨 4도에서 이틀 동안 식물을 층화하십시오. 그런 다음 섭씨 23도에서 5 일 동안 16 시간의 빛과 18 시간의 어둠주기로 수직으로 자랍니다.실험 전에 용액 A와 용액 B라고 하는 원형질체 용액을 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다. 깨끗한 칼날이나 가위를 사용하여 식물의 뿌리를 잘라 내고 뿌리를 약 0.5cm 조각으로 자릅니다. 잘게 잘린 뿌리를 1.5 밀리리터의 용액 B에 담그고 실온에서 1.5-2 시간 동안 부드럽게 회전시킨다.생성 된 뿌리 원형질체를 40 미크론 스트레이너 메쉬를 통해 여과하고 1-2 밀리리터의 용액으로 메쉬를 헹굽니다. 피펫을 사용하여 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 500 내지 600 마이크로리터의 용액 A에 재현탁시키고, 즉시 얼음 위에 놓는다. 세포 분류를 위해 재현탁된 세포 용액을 새로운 5밀리리터 시험관으로 옮깁니다.피복액 탱크를 채우고 폐기물 탱크를 확인하십시오. 그런 다음 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 기계를 켭니다. 분류기에서 기기 설정 및 자동 보정 단계를 수행합니다.형광 채널을 선택하고 형광이 없는 야생형 식물을 기준선 대조군으로 사용합니다. 형광 강도와 전방 산란 및 측면 산란 싱글렛을 기반으로 분류 게이트를 조정합니다. 1.5 밀리리터 수집 튜브에 500 마이크로 리터의 용액 A를 첨가 한 후, 분류를 시작하고 튜브 당 2, 000에서 3, 000 세포를 수집하십시오.분류 후 즉시 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 세포가 들어 있는 수집 튜브를 섭씨 300G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 피펫으로 상청액을 제거합니다. 2마이크로리터의 분류된 세포를 채취하여 형광 현미경을 사용하여 형광을 확인합니다.즉시 사용하지 않을 경우 정렬된 셀을 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 단일 세포 인덱스 분류의 경우 멤브레인이 있는 96웰 플레이트를 어댑터에 넣습니다. 물방울이 판의 중앙 구멍에 떨어지도록 판의 위치를 보정하십시오.96웰 플레이트에서 멤브레인을 제거하고 96웰 플레이트를 어댑터에 넣습니다. 정렬할 때 단일 셀 정렬 모드를 선택합니다. 정렬 된 셀의 목표 수를 1로 입력하고 정렬을 시작합니다.실험을 시작하기 전에 표면 오염 제거제와 75% 에탄올로 벤치를 청소하십시오. 라이브러리 준비 시퀀싱을 위해서만 모든 장비를 사용하십시오. 새로 준비한 혼합물 A 1 마이크로 리터를 분류 된 샘플에 첨가 한 후 멸균 된 유봉으로 분쇄합니다.RNAse free water를 사용하여 부피를 14 마이크로 리터로 구성하십시오. 그런 다음 각 샘플을 0.2밀리리터의 얇은 벽으로 된 PCR 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 혼합물 B를 준비합니다. 혼합물 B에 4.4 마이크로 리터를 샘플이 들어있는 각 PCR 튜브에 넣고 부드러운 피펫 팅으로 혼합합니다.샘플을 섭씨 72도에서 3분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 즉시 샘플을 얼음 위에 올려 놓고 올리고 dT를 폴리A 테일에 혼성화시켰다. 역전사 반응 혼합물 또는 혼합물 C를 샘플을 함유하는 각 튜브에 21.6 마이크로리터로 준비한다.역전사 프로그램에 따라 일반적인 PCR 장비에서 역전사 반응을 하는 샘플을 대상으로 합니다. 새로 제조된 사전 증폭 반응 혼합물 또는 혼합물 D 40.8 마이크로리터를 역전사 반응 생성물에 첨가하고 사전 증폭 프로그램을 실행합니다. 증폭 주기는 반응이 지수 단계에 접어들 때 정량적 PCR에 의해 결정될 수 있습니다.사전 증폭 반응 생성물을 정제하기 위해, 사전 증폭된 생성물을 PCR 튜브에서 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 48마이크로리터의 AMPure XP 비드를 각 시료에 넣고 배양 전에 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 샘플과 비드가 들어 있는 1.5밀리리터 튜브를 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다.비드를 방해하지 않고 샘플에서 상청액을 조심스럽게 버리십시오. 200마이크로리터의 80% 에탄올에 다시 현탁한 후 자기 분리 스탠드에 3분 더 놓습니다. 에탄올 함유 상층액을 버린 후, 샘플을 튜브에서 10분 동안 자연 건조시킨다.비드를 20마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 피펫을 사용하여 각 튜브에서 18마이크로리터의 상층액을 새로운 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.마지막으로, 텍스트에 설명된 단계에 따라 사전 라이브러리를 특성화한 다음 라이브러리 구성, 정제 및 정량화를 수행합니다. 형광 Arabidopsis thaliana 마커 라인은 형광 단백질을 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자와 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다. 형광 특이적으로 표시된 원형질체는 형광 강도와 전방 산란 및 측면 산란 단일항을 기반으로 성공적으로 분류되었습니다.분류된 세포는 명시야 및 형광 이미징을 사용하여 시각화되었습니다. 약 2, 000개의 목부 극 주위 세포, 측근 원시 세포, 내피 또는 피질 세포, 및 측근 캡 세포의 RNA 시퀀싱 라이브러리의 대표적인 결과가 표시됩니다. 프라이머 또는 어댑터 이량체 피크가 있는 작은 크기의 라이브러리는 크기 선택 후에도 여전히 시퀀싱할 수 있습니다.비정상적인 크기 분포를 가진 라이브러리는 라이브러리 준비가 실패했음을 나타냅니다. 유전자 발현 패턴을 분석하였다. 4가지 뿌리 세포 유형 중 하나에서 농축된 유전자를 클러스터링하고 다른 세포 유형 간의 유전자 발현의 특이성을 보여주는 히트 맵에 묘사했습니다.정확한 게이팅 및 분류와 RNA 분해 방지를 통한 표적 세포의 높은 품질과 순도는 성공적인 라이브러리 구축의 핵심입니다. 단일 세포 모드의 RNA-seq의 경우, 고유 분자 식별자와 통합된 여러 방법이 최근에 보고되어 성능이 크게 향상되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기...

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

여기에서는 전사 프로파일링을 위한 특정 식물 세포 유형의 레이저 보조 미미해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 종과 세포 유형에 적합하지만, 십자화과 속 Boechera에서 유성 생식 및 종말 생식에 중요한 암컷 생식세포의 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞추고 있습니다.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

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여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

여기에 제시된 것은 식물 조직의 레이저 포획 미세 절(LCM)을 위한 프로토콜입니다. LCM은 오염없는 방식으로 조직의 영역을 격리하기위한 현미경 기술입니다. 절차는 조직 고정, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출을 포함한다. RNA는 다운스트림 조직 특이적, 전사의 현세적으로 해결된 분석에서 사용된다.

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

우리는 애기장대 식물의 잎 표면과 아포라스트에서 세포외 RNA를 분리하는 간단하면서도 재현성이 높은 방법을 설명합니다.

애기장대 로제트를 이용한 잎 표면 및 아포플라스틱 RNA의 분리 및 분석에 대한 단계별 가이드

교미 및 tetrad 분리는 유전자 분석을 위해...

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

배우세요 식물 뿌리 세포 유형을 분리하고 전사체 라이브러리를 구축하는 방법을 Arabidopsis thaliana를 이용하여. 이 프로토콜은 단일세포 RNA 시퀀싱을 통해 유전자 발현 차이를 밝혀내어 세포 내 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

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