단일 셀 Transcriptome 분석

이 실험 절차의 전반적인 목적은 전사체 분석을 위해 단일 세포로부터 샘플을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 분리에 적합한 세포를 찾는 것으로부터 시작됩니다. 그 다음으로, 분리하려는 세포 옆에 마이크로 피펫을 배치합니다.

그 다음, 세포가 마이크로 피펫 팁 안으로 끌려 들어올 때까지 시린지에 흡입력을 가합니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로 피펫 팁을 수집 튜브 내부에서 부러뜨리고, 마이크로 피펫의 남은 내용물을 튜브 속으로 배출하는 것입니다. 최종적으로, 본 프로토콜에 기술된 arna 증폭법을 사용하여 증폭된 물질의 마이크로어레이 분석이나 PCR 또는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 응용법을 통해 세포 간 mRNA 집단의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 단일 세포 간의 통찰력과 차이점을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 수지상 돌기 또는 수지상 돌기의 유형과 같은 세포 내 구획에 적용하여 수지상 돌기 기능에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Jennifer Singh이 진행하겠습니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 배아 18일 차 쥐의 해마(Hippo Campi)에서 유래한 일차 뉴런을 35mm 디시에 있는 12mm 커버슬립 위에 배양하였으며, 서면 프로토콜에 기술된 대로 유지 관리하였습니다. 수확용 피펫을 준비하려면, 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 오토클레이브 처리된 유리 피펫을 전기생리학에 적합한 직경으로 당겨 제작하십시오.

제조사의 사전 설정 프로그램을 사용하므로, 세포 수집 전 팁 끝부분을 제거하기 때문에 보어 크기는 중요하지 않습니다. 세포를 수집할 준비가 되었을 때 팁이 손상되지 않도록 마이크로 피펫 보관 용기와 같은 먼지가 없는 환경에 피펫을 주의해서 보관하십시오. 수집한 물질을 보관하기 위해 1.7 mL 에이노르 튜브(einor tube) 필요한 개수에 2 µL의 PBS를 넣어 준비하십시오.

조직 배양 후드 내에서 인큐베이터로부터 커버슬립이 들어있는 35 millimeter 디쉬 1개를 꺼냅니다. 이 디쉬에서 커버슬립 하나를 빠르게 꺼내어 HBSS가 담긴 새로운 35 millimeter 디쉬의 뚜껑 위로 옮깁니다. 조작하지 않는 커버슬립들은 세포 상태가 악화될 수 있으므로 즉시 인큐베이터로 되돌려 놓는 것이 매우 중요합니다.

장시간 방치할 경우 주의가 필요합니다. 세포 수집을 위해서는 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 40 x 대물렌즈의 도립광학현미경이 필요합니다. 홀더에서 유연한 튜브가 연결된 피펫 홀더를 사용하고, 수집 중 피펫의 원치 않는 움직임을 방지하기 위해 튜브를 안정적인 표면에 고정하십시오.

튜브 끝에 니들을 삽입하여 루어 락(lure lock) 연결 방식의 1 mL 시린지를 장착하고 사용자 간에 교체할 수 있도록 합니다. 한 손의 손가락 사이에 킴와이프(Kim wipe)를 팽팽하게 잡고, 마이크로 피펫의 팁을 종이 위로 한두 번 매우 부드럽게 문질러 팁 끝을 정밀하게 절단함으로써 마이크로 피펫을 준비합니다. 이때 개구부의 크기는 표적 세포 크기의 약 75~100%가 되어야 합니다.

마이크로 파이펫을 마이크로 파이펫 홀더에 고정하고, 마이크로 파이펫 홀더를 마이크로 매니퓰레이터의 인서트에 부착합니다. 마지막으로 40x 대물렌즈를 설정합니다. 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓고 수확하기에 적합한 세포 영역을 찾습니다.

일차 뉴런 배양의 경우, 세포가 주변 세포들로부터 상대적으로 격리되어 있어야 합니다. 주변 세포나 돌기가 함께 수집되는 것을 방지하기 위해, 수집할 세포를 시야 중심에 위치시키십시오. 마이크로 조작기를 사용하여 마이크로 피펫을 디쉬 내 용액 방향으로, 광경로(light path) 안으로 전진시킵니다.

피펫 팁을 용액 속으로 내립니다. 접안렌즈를 통해 보았을 때, 피펫이 시야 내에 그림자 형태로 나타나야 합니다. 이 시점부터 세포 평면보다 훨씬 위쪽에서 주사기를 통해 가볍게 불어 넣어 양압을 가합니다.

피펫 팁이 시야 내에 들어올 때까지 위치를 조절하고, 조동나사를 사용하여 피펫 팁의 초점을 맞춥니다. 이 단계에서 피펫의 보어 크기가 너무 큰지 또는 작은지 평가합니다. 보어 크기가 적절하지 않은 경우, 수집 영역에서 피펫이 파손되는 것을 방지하기 위해 적절한 보어 크기를 찾을 때까지 다른 마이크로 피펫으로 교체하십시오.

마이크로 조작기를 사용하여 피펫 팁을 세포 쪽으로 이동시키기 전에, 조동 나사를 사용하여 초점면을 전진시키십시오. 세포가 가까워지면 미동 나사를 사용하여 세포와 피펫 팁 모두에 초점이 맞을 때까지 조정하십시오. 표적 세포에 도달하기 전에는 양압 가압을 중단하여 세포가 커버 슬립에서 밀려나지 않도록 하십시오.

마이크로 조작기를 사용하여 피펫 팁이 수확하려는 세포체에 닿도록 위치시킵니다. 시린지를 사용하여 세포가 피펫 팁 안으로 들어올 때까지 입으로 부드럽게 흡입합니다. 세포가 피펫으로 들어오지 않는 경우, 팁을 세포 쪽으로 천천히 더 가까이 이동시킨 후, 세포가 커버슬립에서 떨어져 올라올 때까지 아래쪽으로 살짝 움직입니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 즉시 위로 이동시켜 용액 밖으로 꺼냅니다. 홀더에서 피펫을 제거합니다. 준비된 1.7 milliliter eppendorf tube를 한 손에 잡고, 튜브의 하단 쪽 측면에 피펫 팁을 살짝 부딪혀 부러뜨립니다.

부러진 팁의 중심이 튜브 내부에 위치하도록 하여 0.1 milliliter 표시선을 향하게 한 뒤, 1 milliliter 주사기가 연결된 바늘을 피펫의 상단 개구부에 삽입합니다. 플런저를 빠르게 눌러 피펫 안의 용액이 튜브 속으로 분사되게 합니다. 이때 팁이 튜브 벽면에 묻은 액체에 닿지 않도록 주의하십시오.

모세관 현상으로 인해 액체가 피펫 안으로 다시 끌려 들어가므로, 세포는 피펫의 아주 끝부분에 남게 되며, 이는 세포를 적절히 배출하는 데 충분할 것입니다. 데스크톱 원심분리기를 사용하여 튜브의 내용물을 빠르게 원심 분리한 후, 드라이아이스에 얼리거나 얼음 위에 놓아 추가 공정 또는 PCR이나 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 응용 분야에 사용하십시오. 여기에는 단일 뉴런을 성공적으로 수확한 예시가 나와 있습니다.

먼저, 세포 밀도가 상대적으로 낮은 영역을 선택하였습니다. 그런 다음 피펫 팁을 원하는 세포 쪽으로 이동시켰습니다. 여기는 세포를 수집한 후의 시야를 보여줍니다.

주변의 프로세스들은 커버슬립 위에 그대로 남아 있음에 유의하십시오. 반대로, 이 그림은 효과적인 회수에 부적절한 크기의 피펫 팁 이미지 두 가지를 보여줍니다. 이 팁은 불완전한 회수로 이어지며, 여기에 표시된 팁은 주변 환경까지 함께 회수되는 결과를 초래할 것입니다.

수확 및 RNA 증폭 분석 후, 바이오분석기(bioanalyzer)를 사용하여 증폭된 RNA의 분포와 양을 조사하는 것이 권장됩니다. 단일 세포 물질로부터 증폭이 성공적으로 이루어지면 총량이 수 µg 범위로 나타나며, 분포는 완만하고 넓게 형성됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 RNA-free 기술을 사용하는 것이 중요합니다.