Name: 단일 셀 Transcriptome 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 배우세요 쥐 원발 신경 세포 배양에서 단일 세포를 분리하여 aRNA 증폭을 통한 transcriptome 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 세포 이질성과 유전자 발현 변이를 연구하는 신경과학 연구에 활용됩니다.

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이 문서에 포함된 그림에 대한 세포 문화를 제공하는 닥터 테리 Schochet하는 셀 문화를 도금하고 관리하기위한 케빈 미야에 감사합니다. 또한, 아르나 절차에 입력 케빈 미야 박사 피터 버클리, 그리고 Tiina Pertiz에 감사드립니다. 이 작품에 대한 자금이 노화에있는 국립 연구소, 정신 건강 및 펜실베니아의 연방에서 인적 자원 사실 찾기 자금의 국립 연구소에서했다.

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<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
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<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

박사 Eberwine 박사 Eberwine가 공유 소유자가있는 LBS 기술이 허가되었습니다 아르나의 특허 발명가이다.

노트 및 문제 해결 <ul><li> 당신은 전후 대상 셀을 격리 것을 보여주는 이미지와 나머지 penumbra가 온전히 남아 있다고 걸릴 수 있습니다. </li><li> 너무 많은 솔루션이 수확 그대로 피펫을 입력하는 경우, 3 Luer - 잠금 피팅 방법과 튜브에 긍정적인 압력을 유지 주사기에 대한 플런저를 사용할 수 있습니다. 원하는 볼륨 처리의 유형에 따라 달라질 수 있지만 최대 5 μl은 대부분의 어플 리케이션을위한 괜찮을 것입니다. </li></ul> 분자 생물 학적 기법에 대한 일반적인 도움말 <ul><li> 와동 모든 재고 튜브와 반응에 추가하기 전에 그들을 스핀. 절대 와동 효소. </li><li> 철저하게 버퍼가 적절한 농도에 있는지 확인하기 위해 효소를 추가하기 전에 반응을 섞는다. </li><li> 가능하면 stratacooler를 사용하여 -20 ° C에서 효소 주식 보관하십시오. 그렇지 않으면, 바로 사용하기 전에 제거 얼음을 계속하고, -20 ° C. 즉시 반환 </li><li> 항상 pipetting 오류를 줄이기 위해 하나 이상의 반응을 준비할 때 주인이 혼합합니다. 샘플의 개수에 따라 필요한 볼륨을 계산하고 10-20%를 추가합니다. </li><li> 스토어 RNA -80 ° C에서 저능아 저하합니다. RNA는 산성 조건에서 발생하는 RNA의 저능아 apurination에 버퍼에 저장되어있는 가장 안정적인 것입니다. </li></ul> 아르나 절차의 일반 개요 그림 4A는 아르나 절차의 첫 번째 라운드를 보여줍니다. 첫 번째 스트랜드 반응에서, T7 -​​ oligo (DT) 프라이머의 폴리 - T 부분은 polyA 꼬리에 바인딩하여 mRNA 종 (길고 흰 사각형)을 선택합니다. 일부 microRNAs는 polyadenylated하고이 프로 시저에 의해 캡처됩니다. 더 중요하지만, 세포에서 가장 풍부한 RNAS, ribosomal RNAS가되지 않습니다. 이 oligo는 템플릿으로 mRNA를 사용하여 cDNA의 보완 스트랜드 (긴 회색 사각형)를 합성하기 위해 역방향 Transcriptase위한 입문서 역할을합니다. T7 - oligo (DT) 프라이머의 T7 부분은 시작 mRNA에 순서 안티 센스와 프레임의 T7 RNA 효소 프로 모터를 포함합니다. 이것은 나중에 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 다음, 이전 단계에서 만든 mRNA / DNA 하이브리드의 mRNA는 보온 스트랜드의 DNA 합성에서 만든 오카자키 조각과 유사한 RNA &quot;primers&quot;을 (작은 흰색 사각형) 작성 Rnase H에 의해 부분적으로 분해됩니다. 의 DNA 중합 효소는 한 템플릿으로 mRNA를 보완 DNA를 사용하여 프라임 DNA 합성에 RNA 조각을 사용합니다. 그것이 &#39;3&#39;다음 RNA 조각, 그 5에 도달하면 nuclease 활동 ribonucleotides를 제​​거하고 deoxyribonucleotides으로 그들을 대체합니다. DNA ligase는 선도 가닥의 교체가 완료되지 않은 긴 ligate에 추가됩니다. RNA 조각이 DNA를 중합 효소 내가 만드는 초기 primers 역할을 어디 T4의 DNA 중합 효소는 지역에 채우기 추가됩니다 날이 종단을 두 번 누른 다음 IVT 반응을 수행하기 전에 정화입니다 cDNA 좌초. IVT 반응에 T7 RNA 효소는 템플릿으로 감지 가닥을 사용하여 두 cDNA 합성 좌초와 안티 센스 RNA 분자 (검고 긴 직사각형)에 반영된 T7 프로 모터에 바인딩합니다. 이것은 안티 센스 RNA 분자의 수천이 각각 두 번 좌초 cDNA 분자 (그림 4A)에서 생산되는 증폭 단계 역할을합니다. 그림 4B에 묘사된 두 번째 라운드는, 시작 RNA 이후 첫 라운드와는 약간 다른 역 전사 반응을 시작하는 안티 센스 (고체 검정 직사각형)이고 T7 -​​ oligo의 대상이되었다 polyadenylated 꼬리 부족 첫 라운드에서 (DT) 입문서. 따라서,이 반응은 임의 primers (작은 회색 사각형)과 이후 변성 RNA와 함께 준비하는 것입니다. 두 번째 스트랜드 반응은 다음 이전 반대 전사 반응에서 만든 감각의 RNA의 3 &#39;끝에 폴리 - A 시퀀스에 바인딩 T7 -​​ oligo (DT) 입문서로 준비하는 것입니다. 다른 IVT 반응은 첫 라운드에서 같은 방식으로 수행됩니다. 이 두 번째 라운드는 일반적으로 하나의 세포에서 증폭의 3 라운드를 달성하기위한 최소한 한 번 반복됩니다. 애플 리케이션 우리는이 문서에서 제시해야하는 기술은 애플 리케이션의 많은로 번역하실 수 있습니다. 단세포 격리 프로토콜은 급성 조각에 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 14 기술적으로 많은 도전하지만, 동일한 원칙이 다른 준비에 적용됩니다. 피펫의 크기가 약간 조정 경우 또한, 세포의 생리의 기록은 수확 생리 출력 뒤에 분자 메커니즘을 잘 제어 조사를 위해 허용하기 전에 할 수 있습니다. 또 약간의 수정이 셀 소마에서 프로세스를 분리하는 것입니다.이 응용 프로그램 15 하나의 피펫과 함께 세포의 시체를 수집하고 신선한 피펫로 돌아가서 100-300 식별 dendrit를 수집에스 또는 수집 관 당 axons. 16 일단 세포는 mRNA의 abundances와 작곡의 비교는 동일한 세포 집단 내에서조차 다른과 사이에 만들 수 있으며, 수확되었습니다. 세 번째 라운드 아르나로 biotinylated - UTP를 통합하면 이러한 상대적인 mRNA의 abundances을 결정하기 위해 microarray 분석을 위해 수 있습니다. 원래 mRNA 인구의 구성 또한 차세대 시퀀싱을 사용하여 아르나 절차 후 결정하실 수 있습니다. 증폭 아르나도 하나의 셀 유형에서 mRNAs의 전체 집합이 이전의에 후자의 셀 타입의 표현형의 전환을 유도하기 위해 다른 세포 유형으로 transfected하는 세포 표현형 변환 연구를 확인하는 데 사용할 수 있습니다 절차는 실험실에서 개발하여 TIPeR으로 알려져 있습니다. 17 이러한 연구는 질병 상태 및 세포 phenotypes 및 연구를 공부에 특히 유용합니다 연구실에서 현재 진행하고 있습니다. RT - PCR 또는 qPCR은 셀 - 특정 유전자의 표현을 확인하는 증폭 자료에 수행할 수 있습니다. 또한, transfection 또는 전달의 효율성의 평가는 단일 세포 수준에서 만들 수 있습니다. 장점 및 제한 으로 추상적으로 명시된 바와 같이, 분석을 위해 단일 ​​세포의 분리는 이기종 세포 인구의 분석과 본 평균 효과를 제거합니다. 이러한 평균 효과는 풍부한 기록을 통해 - 대표 밖 평균 많은 낮은 풍부한 성적 증명서의 확인을 방지하여 단일 세포 내에서 mRNA의 abundances를 허위. 유동세포계측법은 개별 세포를 정렬하는 데 사용하지만,이 방법은 세포 특정 마커와 고가의 장비에 대한 지식을 필요로하실 수 있습니다. 18 레이저 캡처 microdissection도 자외선 또는 적외선 레이저 캡처 microdissection 시스템과 심지어 단일 셀 및 subcellular 캡처를 허용하지만, 관심의 세포를 필요로 매우 얇은 부분의 표면에 위치합니다. 19 유동세포계측법 마찬가지로, 레이저 캡처 microdissection은 값비싼 장비가 필요합니다. 위에서 설명한 전극을 기반으로 수집 기술의 주요 장점 중 하나는 귀중한 electrophysiological 데이터가 동일한 세포에서 수행하는 기능과 transcriptome 분석을위한 허용, 수확하기 전에 관심있는 세포에서 얻을 수있다. 우리의 기술 20 단점입니다 그것은 micromanipulators를 사용하여 경험을 필요로 않습니다. micromanipulators 익숙한 수사관이 기술은 매우 직관적인 발견할 것이다, 그러나, 이러한 경험을 가진 개인은 필요한 좋은 움직임과 함께 편안한 될해야합니다. 모든 증폭 기술 고유의 크기와 염기 조성에 따라 특정 성적의 특혜 증폭입니다. 4,6,7 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)과 같은 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (RT - PCR) 및 cDNA의 급속한 증폭과 같은 기반 기술 성적 지수 증폭에 종료 (RACE) 결과, 선형 증폭의 반면 아르나의 증폭 절차 결과. 따라서 아르나 절차의 주요 장점 중 하나가 더 나은 유일한 선형 기하 급수적으로 확장 반대로 증폭 과정에서 발생하는 오류나 편견을 확장하여 mRNA의 성적의 상대적 abundances를 보존하는 기능에있다 오류와 편견했다. microarray 분석과 동봉된 아르나 절차는 치료 또는 치료 유사하거나 다른 형태의 단일 셀 사이의 mRNA의 abundances의 비교를위한 수 있습니다. 또한 증폭 자료는 차세대 시퀀싱을위한 제출하실 수 있습니다. 5,8는 그러나, 프로 시저에 대한 무작위 primers를 사용하는 반면에, oligo - DT 준비하는 절차는의 편견 증폭 위에서 설명한 이후 같은 분석에 관심 기울여야 3 &#39;은 mRNA 각각의 원형과 그 이후 증폭된 소재의 약간의 단축에 일반적으로 결과의 끝납니다. 치료는 몇 가지 잘못된 부재 통화가 약간 짧아 증폭 소재에서 발생할 수있는 표준 방법으로 microarray 결과를 분석에 주의해야한다. 또한, 시퀀싱하면서 결과가 실제로 전체 5 제공할 것입니다 &#39;원래의 mRNA 대부분의 순서를 5&#39;일부 mRNA의 시퀀스는 놓칠 수 있습니다. 이러한 이유로, amplifications의 반올림의 수를 제한해야합니다.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Spiegelgas 커버슬립</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 35x10 mm 배양 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 용수</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>세포 배양 및 커버슬립 세척에 사용되는 용액 제조를 위해</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>라미닌, 초고순도</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Earle's 용액이 함유된 MEM&amp;rsquo;염류 및 glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>세포 플레이팅을 위해</td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>사이토신 베타-D-아라비노푸라노사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Earle's balanced salt solution이 포함된 MEM&amp;rsquo;염 및 L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>세포 배양을 위해</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관 (외경 1.5mm, 길이 100mm)</td><td>킴블 체이스</td><td>34500 99</td><td>적절한 내경 크기만 확보된다면 어떤 붕규산 유리 피펫이라도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td>균형염 용액 (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>구성 성분들이 서로 반응하지 않는 한 어떤 용액이든 사용 가능합니다.&amp;rsquo;향후의 처리에 영향을 주지 않도록 합니다(즉, Ca가 없어야 함).&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 또는 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>게이지는 피펫의 직경에 따라 달라집니다.</td></tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 올리고</td><td>사용자 정의</td><td>Midland 인증 완료</td><td></td></tr><tr><td>2차 가닥 버퍼 (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>제2가닥 버퍼가 함께 제공됨</td></tr><tr><td>E.coli DNA 리가제</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>무작위 프라이머</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 역전사효소</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>키트(18080-044)에는 1차 가닥 버퍼(Y02321)와 DTT가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter사는 다른 여러 모델을 보유하고 있으며, 그 중 다수가 쿡북(cookbook)에서 논의됩니다.</td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>최신 Eppendorf 모델과 같은 다양한 다른 마이크로매니퓰레이터(micromanipulator)도 사용 가능합니다.</td></tr><tr><td>피펫 홀더</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>마이크로매니퓰레이터 및 피펫 외경(O.D.)에 따라 달라질 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀 transcriptome 분석

Transcriptome Analysis of Single Cells

대부분의 유전자 발현 분석 기술 문화 조직 homogenates이나 세포에서 세포의 이질적인 인구의 격리 물질에 의존하고 있습니다. 1,2,3 두뇌의 경우, 같은 해마로 영역 각각 다른 세포 유형의 복잡한 배열을 포함 서로 다른 mRNA 프로필. 단일 세포를 수확하는 능력은 세포 인구 사이 내의 분자의 차이점에 대한 심층 조사에 더 있습니다. 우리는 더 이상 처리를위한 세포를 수확하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 자주 전기 생리학에서 사용 Pipettes는 (열망 사용) 관심의 세포를 분리하기 위해 활용하고 편리하게 분자 생물학 기술의 번호와 추가 처리를 위해 Eppendorf 튜브에 그것을 입금하고 있습니다. 우리 프로토콜 세포 배양이나 급성 조각에서 개별 세포에서 dendrites의 수확 수정할 수 있습니다. 우리는 또한 단일 셀 isolations의 주요 다운 스트림 응용 프로그램으로 아르나의 증폭 방법을 설명합니다. 이 방법은 같은 리버스 녹음하거나 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 등의 유전자 발현 분석 기술의 대안으로 우리 연구실에 의해 이전에 개발되었습니다. 4,5,6,7,8이 기술의 선형 증폭을 위해 제공 polyadenylated RNA는 재료만을 femtograms로 시작하는 안티 센스 RNA 및 마이크로 그램의 금액에 결과. 선형 증폭 재료는 절연 세포의 transcriptome의 구성 요소의 상대적인 풍요의 PCR 증폭 지수보다 정확한 견적을 제공합니다. 기본 절차는 증폭의 두 라운드로 구성되어 있습니다. 간단히, T7 RNA 효소 프로 모터 사이트는 mRNA의 기록에서 만든 두 번 좌초 cDNA에 통합됩니다. 시험 관내 전사의 하루 (IVT) 반응은 다음 T7 RNA 효소는 이중 좌초 cDNA로부터 많은 안티 센스 성적표를 생산하는 수행됩니다. 두 번째 라운드는이 과정을 반복하지만 시작부터 자료 몇 가지 기술적인 차이와 안티 센스 RNA입니다. 그것은 증폭의 3 라운드의 결과로, 두 번째 라운드를 반복하는 기준입니다. 종종, 시험 관내 전사 반응에서 세 번째 라운드는 생산 안티 센스 RNA가 hybridized와 microarray를 감지 수 있도록 biotinylated 뉴클레오 사이드의 triphosphates를 사용하여 수행됩니다. 7,8

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

많은 유전자 발현 분석 기술은 조직 균질액이나 ... 내의 세포와 같이 이질적인 세포 집단으로부터 분리된 물질에 의존합니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 전사체 분석을 위해 단일 세포로부터 샘플을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 분리에 적합한 세포를 찾는 것으로 시작됩니다. 그다음 분리할 세포 옆에 마이크로 피펫을 위치시킵니다.다음으로 세포가 마이크로 피펫 팁 안으로 끌려 들어올 때까지 시린지에 흡입력을 가합니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로 피펫의 팁을 컬렉션 튜브 안에서 부러뜨리고, 마이크로 피펫에 남은 내용물을 튜브 속으로 배출하는 것입니다. 최종적으로, 본 프로토콜에 기술된 arna 증폭법을 사용하여 증폭된 물질의 마이크로어레이 분석이나, PCR 또는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 응용 방법을 통해 세포 간 mRNA 집단의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 단일 세포 간의 통찰력과 차이점을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 수상돌기나 특정 종류의 수상돌기와 같은 세포 내 구획에도 적용할 수 있어 수상돌기 기능에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Jennifer Singh이 담당하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, 쥐의 배아 18일차 해마에서 추출한 일차 뉴런을 35 mm 디쉬 내의 12 mm 커버슬립에 도말하고 서면 프로토콜에 기술된 대로 배양하였습니다. 수확용 피펫을 준비하려면, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 오토클레이브 처리된 유리 피펫을 전기생리학에 적합한 직경으로 뽑아내어 사용하십시오.제조사의 프리셋 프로그램을 사용하므로, 팁이 세포 수집 전에 절단되기 때문에 보어 크기는 중요하지 않습니다. 세포를 수확할 준비가 되었을 때 팁이 손상되지 않은 상태로 유지될 수 있도록, 마이크로 피펫 보관 용기와 같은 먼지가 없는 환경에 피펫을 조심스럽게 보관하십시오. 수확한 물질을 보관하기 위해 2 µL의 PBS를 추가하여 필요한 수의 1.7 mL 에핀도르프 튜브를 준비하십시오.조직 배양 후드 내에서 인큐베이터로부터 커버슬립이 담긴 35 millimeter 디쉬 1개를 꺼냅니다. 이 디쉬에서 커버슬립 한 장을 빠르게 꺼내 HBSS가 들어 있는 새로운 35 millimeter 디쉬의 뚜껑 위로 옮깁니다. 조작하지 않는 커버슬립의 경우, 세포의 상태가 나빠질 수 있으므로 즉시 인큐베이터로 되돌려 놓는 것이 중요합니다.장시간 방치할 경우 문제가 발생할 수 있습니다. 세포 수집을 위해서는 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 40 x 대물렌즈의 도립 광학 현미경이 필요합니다. 홀더에서 유연한 튜브가 연결된 피펫 홀더를 사용하며, 수집 중 피펫이 원치 않게 움직이는 것을 방지하기 위해 튜브를 안정적인 표면에 고정하십시오.튜브 끝에 바늘을 삽입하여 루어락(lure lock) 연결 방식의 1 mL 주사기를 장착하고 사용자 간에 교체할 수 있도록 합니다. 한 손의 손가락 사이에 킴와이프(Kim wipe)를 팽팽하게 잡고, 마이크로 피펫의 팁을 종이 위에 대고 1~2회 매우 부드럽게 문질러 팁 끝을 제어된 방식으로 파손시켜 마이크로 피펫을 준비합니다. 개구부의 크기는 표적 세포 크기의 약 75~100%가 되어야 합니다.마이크로 피펫을 마이크로 피펫 홀더에 고정하고, 마이크로 피펫 홀더를 마이크로 매니퓰레이터의 인서트에 부착합니다. 마지막으로, 40x 대물렌즈를 설정합니다. 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓고 수확하기에 적합한 세포 영역을 찾습니다.일차 뉴런 배양의 경우, 세포가 주변 세포들로부터 비교적 격리되어 있어야 합니다. 주변 세포나 돌기가 함께 수집되는 것을 방지하려면, 수집할 세포를 시야의 중심에 배치하십시오. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫을 디쉬 내의 용액 방향으로 전진시켜 광 경로로 진입시킵니다.피펫 팁을 용액 속으로 내립니다. 접안렌즈를 통해 보았을 때, 피펫이 시야 내에 그림자로 나타나야 합니다. 이때부터 세포 평면보다 훨씬 위쪽에서 주사기를 통해 가볍게 바람을 불어넣어 양압을 가합니다.피펫 팁이 시야 내에 들어올 때까지 위치를 조절하고, 조동나사를 사용하여 피펫 팁에 초점을 맞춥니다. 이때 피펫의 내경(bore size)이 너무 큰지 또는 너무 작은지 평가합니다. 내경이 적절하지 않은 경우, 수집 영역 내에서 피펫이 파손되는 것을 방지하기 위해 적절한 내경의 마이크로 피펫을 찾을 때까지 다른 피펫으로 교체하십시오.마이크로 조작기를 사용하여 피펫 팁을 세포 쪽으로 이동시키기 전에, 조동나사(course focus)를 사용하여 초점면을 전진시키십시오. 세포가 가까워지면 미동나사(fine focus)를 사용하여 세포와 피펫 팁 모두에 초점이 맞을 때까지 조정하십시오. 대상 세포에 도달하기 전에 양압 가압을 중단하여 세포가 커버슬립에서 밀려나지 않도록 하십시오.마이크로 조작기를 사용하여 피펫 팁이 수확할 세포체에 닿도록 위치시킵니다. 주사기를 사용하여 세포가 피펫 팁 안으로 들어갈 때까지 입으로 부드럽게 흡입합니다. 세포가 피펫으로 들어오지 않는 경우, 팁을 세포 쪽으로 부드럽게 더 가까이 이동시킨 후 커버슬립에서 떨어질 때까지 아래쪽으로 움직입니다.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 즉시 위로 들어 올려 용액 밖으로 이동시킵니다. 홀더에서 피펫을 제거합니다. 준비된 1.7 milliliter 에펜도르프 튜브를 한 손에 잡고, 튜브 바닥 쪽 측면에 피펫 팁을 살짝 부러뜨려 분리합니다.부러진 팁의 중심이 튜브 내부에 위치하도록 하여 0.1 milliliter 표시선을 맞춘 다음, 1 milliliter 주사기가 연결된 바늘을 피펫의 상단 개구부에 삽입합니다. 플런저를 빠르게 눌러 피펫 안의 용액이 튜브 속으로 분사되게 합니다. 이때 팁이 튜브 벽면의 액체에 닿지 않도록 주의하십시오.모세관 현상으로 인해 액체가 피펫 안으로 다시 빨려 들어가므로, 세포는 피펫의 맨 끝부분에 남게 되며 이는 세포를 적절히 배출하기에 충분합니다. 데스크톱 원심분리기를 사용하여 튜브의 내용물을 빠르게 원심 분리하고, 추가 처리나 PCR 또는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 응용 분야를 위해 드라이아이스에 얼리거나 얼음에 보관하십시오. 여기에 분리된 뉴런을 성공적으로 회수한 예시가 나와 있습니다.먼저, 세포 밀도가 상대적으로 낮은 영역을 선택했습니다. 그런 다음 피펫 팁을 원하는 세포 쪽으로 이동시켰습니다. 여기에서는 세포를 수확한 후의 시야가 표시됩니다.주변의 프로세스들은 커버슬립 위에 남아 있음에 유의하십시오. 반대로, 이 그림은 효과적인 수집에 부적절한 크기의 피펫 팁 이미지 두 장을 보여줍니다. 이 팁을 사용하면 수집이 불완전하게 이루어지며, 여기 보이는 다른 팁은 주변 환경까지 함께 수집되는 결과를 초래합니다.수확 및 RNA 증폭 후에는 바이오분석기(bioanalyzer)를 사용하여 증폭된 RNA의 분포와 양을 확인하는 것이 권장됩니다. 단일 세포 물질로부터 증폭이 성공적으로 이루어지면 총량이 수 µg 수준으로 나타나며, 분포가 매끄럽고 넓게 형성됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절한 수행 시 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행하는 동안에는 반드시 RNA-free 기술을 사용하는 것이 중요합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

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배우세요 쥐 원발 신경 세포 배양에서 단일 세포를 분리하여 aRNA 증폭을 통한 transcriptome 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 세포 이질성과 유전자 발현 변이를 연구하는 신경과학 연구에 활용됩니다.

단일 셀 Transcriptome 분석

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