단일 셀 Transcriptome 분석

이 절차의 전반적인 목표는 전사체 분석을 위해 단일 세포에서 샘플을 준비하는 것입니다. 이것은 먼저 분리에 적합한 세포를 찾음으로써 달성됩니다. 그런 다음 마이크로 피펫은 분리할 셀 옆에 배치됩니다.

다음으로 세포가 마이크로 피펫 끝으로 당겨질 때까지 주사기에 흡입이 적용됩니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로 피펫의 끝을 수집 튜브로 부수고 마이크로 피펫의 나머지 내용물을 튜브로 제거하는 것입니다. 궁극적으로, 프로토콜에 설명된 arna 증폭 방법을 사용하여 증폭된 물질의 마이크로어레이 분석을 통해 세포 간 mRNA 집단의 차이를 보여주는 결과를 얻거나 PCR 또는 차세대 염기서열분석과 같은 다른 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

이 방법은 단일 세포 간의 통찰력과 차이점을 제공할 수 있지만 수상돌기 또는 수상돌기 부류와 같은 세포 내 구획에도 적용할 수 있으며 수상돌기 기능에 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Jennifer Singh입니다.이 프로토콜이 시작되기 전에 배아 18일째의 1차 뉴런인 쥐 Hippo Campi를 35mm 접시에 담긴 12mm 커버 슬립에 도금하고 서면 프로토콜에 설명된 대로 유지했습니다. 수확을 위해 피펫을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 전기 생리학에 적합한 직경으로 오토클레이브 유리 피펫을 당깁니다.

제조업체의 사전 설정 프로그램을 사용하면 세포 수집 전에 팁이 파손되기 때문에 보어 크기가 중요하지 않습니다. 마이크로 피펫 보관 용기와 같이 먼지가 없는 환경에 피펫을 조심스럽게 보관하면 세포를 채취할 준비가 되었을 때 팁이 손상되지 않습니다. 수확된 물질의 저장을 위해 2마이크로리터의 PBS를 추가하여 원하는 수의 1.7밀리리터 einor 튜브를 준비합니다.

조직 배양 후드의 인큐베이터에서 커버 슬립 1 35mm 접시를 제거합니다. 이 접시의 커버 슬립 하나를 HBSS가 들어있는 새 35mm 접시의 뚜껑으로 빠르게 옮깁니다. 세포가 건강하지 않게 되면 조작되지 않는 커버 슬립을 인큐베이터로 반환하는 것이 중요합니다.

장기간 방치한 경우. 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 40 x 대물렌즈가 있는 도립광 현미경은 세포 채취를 위해 필요합니다. 홀더에서 멀어지는 유연한 튜브가 있는 피펫 홀더를 사용하고 튜브를 안정적인 표면에 부착하여 수집 중 피펫이 원치 않게 움직이는 것을 방지합니다.

튜브 끝에 바늘을 삽입하여 루어 잠금 연결이 있는 1ml 주사기를 부착하고 사용자 간에 교체할 수 있습니다. 한 손의 손가락 사이에 Kim Wipe를 팽팽하게 잡고 피펫 끝을 종이에 한두 번 매우 부드럽게 솔질하여 제어된 방식으로 팁을 부러뜨려 마이크로 피펫을 준비합니다. 개구부는 대상 셀 크기의 약 75-100%여야 합니다.

마이크로 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 고정하고 마이크로 피펫 홀더를 마이크로 매니퓰레이터의 인서트에 부착합니다. 마지막으로 40 x 목표를 설정합니다. 접시를 현미경 스테이지에 놓고 수확에 적합한 세포 영역을 찾습니다.

1차 신경 세포 배양의 경우, 세포는 이웃과 상대적으로 격리되어야 합니다. 주변 세포 및/또는 과정의 수확을 방지하려면 수확할 세포를 시야 중앙에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 접시의 용액을 향해 마이크로 피펫을 광 경로로 전진시킵니다.

피펫 팁을 용액으로 내립니다. 접안렌즈를 통해 보면 피펫이 시야에 그림자로 나타나야 합니다. 이 시점부터 주사기를 통해 세포의 평면보다 훨씬 높은 곳에 가볍게 불어 양압을 가합니다.

필드 내에 올 때까지 피펫 팁의 위치를 조정합니다 view 코스 포커싱 손잡이를 사용하여 피펫 팁에 초점을 맞춥니다. 이 시점에서 피펫의 보어 크기가 너무 크거나 너무 작은지 평가합니다. 보어 크기가 올바르지 않은 경우 올바른 보어 크기를 찾을 때까지 다른 마이크로 피펫으로 교체하십시오.수집 영역에서 피펫 파손을 방지하기 위해.

microm 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁을 세포 쪽으로 전진시키기 전에 과정 초점을 사용하여 초점면을 전진시킵니다. 세포가 가까워지면 세포와 피펫 팁에 모두 초점이 맞춰질 때까지 미세 초점을 사용합니다. 원고 세포에 도달하기 전에 양압 가를 중지하여 커버 슬립에서 날아가는 것을 방지하십시오.

마이크로 매니퓰레이터가 있는 피펫 팁을 수확할 세포 소마에 닿도록 배치합니다. 주사기를 사용하여 세포가 피펫 팁에 들어갈 때까지 입으로 부드럽게 흡입합니다. 셀이 피펫에 들어가지 않는 경우, 팁을 셀에 더 가깝게 그리고 커버 슬립에서 들어 올릴 때까지 아래쪽으로 부드럽게 움직입니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 용액에서 즉시 위로 이동합니다. 홀더에서 피펫을 제거합니다. 준비된 1.7ml einor 튜브를 한 손으로 잡고 튜브 측면에 있는 피펫 끝을 아래쪽으로 부드럽게 부러뜨립니다.

부러진 팁이 튜브 안쪽 중앙에 있는 0.1ml 표시를 목표로 하여 1ml 주사기에 부착된 바늘을 피펫의 상단 구멍에 삽입합니다. 플런저를 빠르게 눌러 피펫의 용액이 튜브로 분사되도록 합니다. 팁 부분이 튜브 측면의 액체에 닿지 않도록 주의하십시오.

모세관 작용으로 액체가 피펫으로 다시 들어가기 때문에 세포는 피펫 맨 끝에 남아 있어야 하며, 이는 세포를 적절하게 배출하기에 충분해야 합니다. 데스크탑 마이크로 퍼지를 사용하여 튜브의 내용물을 빠르게 회전시키고 드라이아이스에서 얼리거나 얼음 위에 올려 추가 처리 또는 PCR 또는 차세대 염기서열분석과 같은 다른 응용 분야를 위해 놓으십시오. 여기에 표시된 것은 분리된 뉴런의 성공적인 수확의 예입니다.

먼저, 상대적으로 낮은 밀도의 세포 영역이 선택되었습니다. 그런 다음 피펫 팁을 원하는 세포로 전진시켰습니다. 여기서 시야는 세포를 수확한 후의 모습입니다.

주변 프로세스는 커버 슬립에 남아 있습니다. 반대로, 이 그림은 효과적인 채취에 적합하지 않은 크기인 피펫 팁의 두 이미지를 보여줍니다. 이 팁은 불완전한 수확으로 이어지며 여기에 표시된 팁은 주변 환경의 수확으로 이어집니다.

수확 후 RNA 증폭 분석 후 바이오분석기를 사용하여 증폭된 RNA의 분포와 수량을 검사하는 것이 좋습니다. 단일 세포 물질에서 성공적인 증폭은 낮은 마이크로그램의 총량을 산출하고 부드럽고 넓은 분포를 갖게 됩니다 이 절차를 수행하는 동안 적절하게 수행하면 이 기술을 몇 분 안에 완료할 수 있으므로 RNA free 기술을 사용하는 것이 중요합니다.