Name: 콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 콩 프로토플래스트 분리법으로 식물 세포 신호 전달 및 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 방법. 이 기술은 대량의 균일한 세포를 얻어 생체 내 단백질 상호작용과 유전자 발현 분석에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (NSF-PGRP-IOS-1339388)에서 식물 게놈 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.

1입니다. 식물의 성장
<ol><li>콩에 대 한 사용자 지정 토양 혼합에 25 ° C에서 긴 하루 조건 (16 h 1500 µmol m-2의 -1에 빛)에서 온실에서 13cm 냄비에 5-10 콩 씨앗 (윌리엄스 82)를 뿌리 다 (1: 토양, 진주 암 및 어 뢰 모래의 비율이 1:1).</li>
</ol>2입니다. 플라스 미드 DNA의 준비
<ol><li>살 균 피 펫 팁 또는 이쑤시개 사용 하, 단일 식민지 또는 냉동된 글리세롤 재고의 대장균 의 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 운반 하 고 20 mL 50 mL 플라스 크에 적절 한 항생제와 Luria Bertani (파운드) 액체 매체에 접종.</li>
	<li>통에 하룻밤 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 5 분 동안 실 온에서 12000 x g에서 정지 centrifuging와 삭제는 상쾌한 박테리아를 수집 합니다. 추출 하 고 플라스 미드 플라스 미드 준비 장비의 제조 업체의 절차에 따라 정화.</li>
</ol>3. 원생 동물 격리
<ol><li>10 일 된 콩 모 종 (그림 1)에서 새로 확장 된 unifoliate 나뭇잎을 잘라. 참고: 적절 한 발달 단계에서 잎의 선택 콩 원생 동물 준비에 대 한 성공에 열쇠 이다. 만 그냥 확장된 잎을 사용 하 여 초기 발달 단계에서. 성숙한 잎, 세포 벽 소화 하기 어렵게 된다.</li>
	<li>신선한 면도날으로는 midrib unifoliate 잎 및 0.5-1에 남아 m m 스트립 다음 컷에서 제거 합니다. 참고: 10 mL 효소 솔루션에 소화 두 unifoliate 잎 10 개 이상의 변환에 대 한 충분 한 protoplasts를 줄 것 이다.</li>
	<li>집게, 전송의 쌍을 사용 하 여 리프 스트립 즉시 고 부드럽게 15 mL 튜브에 갓된 효소 솔루션 (표 1) 10 mL에. 진공 침투 잎은 실 온에서 15 분 동안 스트립.</li>
	<li>부드러운 실 온에서 4-6 h에 대 한 낮은 조명에서 동요 (40 rpm)와 효소 솔루션에서 리프 스트립을 품 어. 효소 솔루션 변하기 노란색-녹색 protoplasts 해제 됩니다 확인 하십시오. 현미경 (X10) 효소/protoplasts 솔루션을 확인 하십시오. 참고: 릴리스 protoplasts 모양, 소화 되지 않은 세포는 불규칙 한 또는 타원형 모양을 하는 동안 구형은.</li>
	<li>부드럽게 붓는 의해 50 mL 튜브에 효소/원생 동물 솔루션의 10 mL를 전송 하 고 소화를 막으려고 실 온에서 W5 솔루션 (표 1) 10 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 몇 번 반전. 부드럽게 깨끗 한 75 µ m 나일론 메쉬 위에 소화 되지 않은 잎 조직 제거를 50ml 튜브에 효소/protoplasts 솔루션을 붓으십시오.</li>
	<li>실 온에서 1-2 분 50 mL 튜브에 100 x g에서 흐름을 통해 효소/protoplasts 솔루션 원심 부드럽게 상쾌한 원생 동물 펠 렛을 방해 하지 않고 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>Resuspend는 protoplasts 그리고 (x10) 현미경 hemacytometer에 원생 동물 수를 계산 하 여 4 ° C에서 냉장된 W5 솔루션에서 2 x 105 mL-1 의 농도를 희석. 30 분 동안 얼음에 protoplasts를 유지.</li>
	<li>실 온에서 1-2 분 x 100g에 현 탁 액을 원심 그리고 W5 솔루션 원생 동물 펠 렛을 방해 하지 않고 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거. 실 온에서 2 x 105 mL-1 의 농도에 MMG 솔루션 (표 1)에서 protoplasts를 resuspend.</li>
</ol>4. 원생 동물 전이
<ol><li>1.5 mL 낮은 접착 microcentrifuge 튜브 포경된 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 protoplasts (2 x 105 mL-1에서 2 × 104 protoplasts)의 100 µ L aliquots를 확인 합니다. 부정적인 통제 역할을 한 약 수 옆으로 넣어. 각 protoplasts의 나머지 약 수로 플라스 미드 (10-20 µ g)의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>천천히 1.5 mL microcentrifuge 튜브의 내부 벽에 갓된 못 솔루션 (표 1)의 110 µ L을 추가 하 고 부드럽게 반전 솔루션은 균질 됩니다 때까지 튜브를 회전.</li>
	<li>15 분 동안 실 온에서 변환 혼합물을 품 어.</li>
	<li>중지 하려면 변환, 천천히 실내 온도에 1.5 mL 튜브에 W5 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 솔루션은 균질 됩니다 때까지 부드럽게 튜브를 반전 합니다. 실 온에서 1-2 분 100 g에 튜브 원심 하 고 상쾌한을 피 펫을 사용 하 여 삭제.</li>
	<li>튜브를 무선 솔루션 (표 1)의 1 mL을 추가 하 고 1-2 회 부드럽게 pipetting으로 resuspend. 코트 표면 하 고는 protoplasts 접시에 집착 하는 것을 방지 하 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 5% (vol/vol) 메 마른 송아지 혈 청 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>몇 초 후, 송아지 혈 청을 피 펫을 사용 하 여 삭제 합니다. Resuspended protoplasts 문화 접시의 우물으로 전송 합니다. 커버 뚜껑 접시.</li>
</ol>5. 원생 동물 부 화 및 수확
<ol><li>어둠 속에서 1-2 일 동안 실 온에서 protoplasts를 품 어. 참고: 우리는 2 일 보육 일일 보육에 비해 일반적으로 더 강한 형광 단백질 신호 하 고 형광 단백질 신호 최대 3-4 일 동안 지속 될 수 있습니다 발견.</li>
	<li>원생 동물 솔루션 낮은 접착 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송. Protoplasts 수확을 실 온에서 1-2 분 x 100g에 튜브 원심 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 유리 슬라이드에 10 µ L protoplasts를 전송.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법 또는 형광 형광 신호를 관찰 합니다. 변형 비 protoplasts를 사용 하 여 부정적인 제어 (신호가 관찰 한다).</li>
</ol>

<ol><li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00271144">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li>
<li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2474847">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li>
<li>Lörz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00330256">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li>
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<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16(2009).</li>
<li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+polyubiquitin+genes%3A+structure%2C+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing%2C+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li>
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<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li>
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<li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li>
<li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Transduction%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li>
<li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9028-4">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-011-0002-z">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li>
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<li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+protoplasts%3A+status+and+biotechnological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li>
<li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poinsettia+protoplasts-a+simple%2C+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14(2012).</li>
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<li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+DREB1%2FCBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11992820">GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

콩 protoplasts 및 과도 식 연구에 응용 프로그램의 격리에 대 한이 정서의 철저 하 게 테스트 하 고 우리의 실험실에서 아주 잘 작동. 절차는 간단 하 고 쉽게 고 일반 장비 및 최소 비용 요구. 우리의 프로토콜 이전에 보고 된 방법34,35,36,,3738에 비해 균일 한 고품질 protoplasts의 대량을 생성 합니다. 그러나, 원생 동물 수율과 변환 속도 영향을 미칠 많은 요인이 있기 때문에, 그것은 좋습니다 연구자의 실험 조건, 바람직한 결과 사용 되는 재료에 따라 조건 최적화에 대 한. 이 시스템은 식물 세포에 즉시 규제 및 생 화 확 적인 사건의 검사를 위해 아주 유용 하다, 그러나 장기 세포 프로세스 및 조직 또는 o...

Protoplasts는 식물 세포는 세포 벽 제거. 그들은 대부분의 기능을 유지 하 고 식물 세포의 활동, protoplasts는 관찰 하 고 평가 하는 다양 한 세포 이벤트, 좋은 모델 시스템 하 고 체세포 혼성1 을 공부 하 고 중생2공장에 유용한 도구. Protoplasts 공장 변환3,,45, 세포 벽 세포로 DNA의 통로 차단 그렇지 않으면 이후 널리 이용 되어 있다. Protoplasts 생리 적인 응답의 일부 및 따라서 단백질 subcellular 지 방화6,7,8, 공부 하는 기초 연구에 근본적인 가치를 제공 하 고 그대로 식물의 세포 프로세스 보유 단백질 단백질 상호 작용9,10, 발기인 활동11,,1213 에 셀 살고 있다.
식물 protoplasts의 196014 에 처음 알려졌다 고 절연 및 protoplasts의 변환에 대 한 프로토콜 개발 및 최적화 되었습니다. 원생 동물 격리의 표준 절차는 잎의 절단 및 세포 벽, 비 소화 조직 파편에서 출시 된 protoplasts의 분리에 의해 다음의 효소 소화를 포함 한다. 전환 전략 electroporation15,16, microinjection17,18및 폴 리 에틸렌 글리콜 기반 (PEG)4,,519 방법을 포함 합니다. 다양 한 종의 원생 동물 격리, 감귤 류20, 브라시카21, Solanaceae22 및 다른 장식적인 식물 가족23,24를 포함 하 여 성공 보고 되었습니다. 다양 한 조직 유형에 다양 한 종에 사용 하 고, 표현의 과도 애기 mesophyll 원생 동물 (TEAMP)에서 애기 thaliana 모델 식물의 잎에서 분리 된 시스템 잘 설립된25 되었습니다. 그리고 다양 한 응용 프로그램을 광범위 하 게 채택.
콩 (최대 글리신 (L.) Merr.) 가장 중요 한 단백질의 하나 이며 기름 작물26. 애기 와 달리 쌀, 유전자 변형 콩 식물을 얻기 보다 어렵고 낮은 효율 될 알려져 있다. Agrobacterium tumefaciens-중재 침투는 널리 사용 되 고 담배27 에서 상피 세포와 애기28,29, 모 종 변이 유전자 표현 연구 반면 Agrobacterium rhizogenes 콩30털 뿌리의 변화에 대 한 사용 되었습니다. 바이러스 유도 유전자 입을 접근 downregulation 대상 유전자31,32 와 과도 식33 의 체계적인 방식으로 활용 되어 있다. Protoplasts 이러한 접근에 대 한 소중 하 고 다양 한 대안을 제공합니다. Protoplasts 콩의 지상 자료에서 얻어질 수 있다 고 신속 하 고 동기화 transgene 식. 그러나, 198334에 콩 protoplasts의 초기 성공 격리, 이후 제한 보고서 콩35,,3637, protoplasts의 응용 프로그램에 38, 콩 protoplasts의 상대적으로 낮은 수확량 때문에 주로.
여기, 우리 콩 protoplasts의 격리에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜 및 변이 유전자 표현 연구에 대 한 응용 프로그램을 설명합니다. 콩 모 종에서 젊은 unifoliate 잎을 사용 하 여, 몇 시간 안에 많은 양의 중요 한 protoplasts 얻을 수 있었습니다. 또한, 우리는 간단 하 고 저비용 고효율 콩 protoplasts에 DNA를 전달 하는 말뚝 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 했습니다.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 "ONOZUKA" R-10</td><td>야쿠르트</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>야쿠르트</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td><td>ICN 생물 의학</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬</td><td>캐롤라이나</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 Miniprep 키트</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA 플라스미드 miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 플라스미드 Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free 마이크로fuge 튜브, 1.5mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>토양</td><td>Ingram's Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

콩 protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

콩 (최대 글리신 (L.) Merr.)는 중요 한 작물 종 이며 유전 그리고 생 화 확 적인 통로의 연구에 대 한 콩과 모델 되고있다. 따라서, 그것은 콩에서 효율적인 변이 유전자 표현 시스템을 설정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 콩 protoplasts의 준비에 대 한 간단한 프로토콜 및 일시적 기능 분석에 대 한 응용 프로그램을 보고합니다. 우리는 젊은 unifoliate 잎 콩 모 종에서 높은 품질 protoplasts의 대량에서 결과 발견. 못 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 하 여 우리 콩 unifoliate protoplasts를 사용 하 여 높은 변환 효율을 달성. 이 시스템 라이브 콩 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘의 검사에 대 한 효율적이 고 다재 다능 한 모델을 제공 하 고 더 나은 하는 데 도움이 콩의 다양 한 세포, 발달 및 생리 적 프로세스를 이해할 수 있습니다.

다른 장기 10 일 오래 된 콩의 원생 동물 준비 (그림 1)에 대 한 테스트 및 수율 (그림 2) 현미경 관찰 했다. Hypocotyl 및 epicotyl에서 세포 벽 거의 소화 했다, 하 고 일부 셀 (그림 2B, 2 C) 서로 게 연결 된. 떡 (그림 2D)와 루트 (그림 2A), 세포 벽은 세포의 작은 부분에만 제거 되었습니다. 반면, 많은 수의 protoplasts unifoliate 때 관찰 되었다 (그림 2E-G)을 사용. 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎 시험된 (<str...

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

이 방법의 전반적인 목표는 살아있는 대두 세포의 조절 및 신호 전달 메커니즘을 조사하기 위해 대두에서 고품질 원형아세포 세포를 얻는 것입니다. 이 방법은 즉각적인 표적 유전자가 무엇인지, 수혈 인자를 열고, 상호 작용 파트너가 단백질을 개방하는지와 같은 조절 네트워크의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 예술입니다.그것은 많은 양의 균일한 콩 원형세포 세포를 생산하며 간단하고 쉽습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 특정 단계에서 각질을 하지 않는 한 콩 잎에서 좋은 원형질체를 얻기가 매우 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 적절한 발달 단계에서 잎을 선택하는 것이 성공적인 대두 원형질체 준비의 핵심입니다.10일 된 콩 묘목에서 새로 팽창된 단엽 잎을 자릅니다. 샘플에서 높은 프로토플라스트 수율을 얻을 수 있는지 확인하려면 약간 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎 샘플을 최소 3개 이상 수집하십시오. 새 면도날로 각 단엽 잎에서 중간 갈비뼈를 제거한 다음 잔해를 0.5-1mm 스트립으로 자릅니다.한 쌍의 집게를 사용하여 잎 스트립을 15ml 튜브에 담긴 10ml의 갓 준비한 효소 용액에 즉시 부드럽게 옮깁니다. 실온에서 15분 동안 잎 스트립에 진공 침투합니다. 효소 용액에 잎 조각을 넣고 실온에서 4-6시간 동안 약한 조명에서 부드럽게 저어 배양합니다.원형질체가 방출되면 효소 용액이 황록색으로 변합니다. 10배 배율로 현미경으로 효소 원형질체 용액을 확인하여 원형질체 분해가 가장 좋은 샘플을 선택합니다. 방출된 원형질체는 구형인 반면, 소화되지 않은 세포는 불규칙하거나 타원형입니다.소화를 멈추려면 최상의 프로토플라스 분해액을 가진 10ml의 효소 원형질체 용액을 50ml 튜브에 부드럽게 붓고 실온에서 10ml의 W5 용액을 첨가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 효소 원형질체 용액을 50ml 튜브 위에 놓인 깨끗한 75미크론 나일론 메쉬에 부드럽게 부어 소화되지 않은 잎 조직을 제거합니다.다음으로, Flow Through Enzyme protoplast 용액을 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리한다. 그런 다음 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 원형질체 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 부드럽게 제거합니다. 프로토플라스트를 냉각된 W5 용액에 재현탁시키고 50ml 튜브를 얼음 위에 두십시오.현미경으로 혈구계에서 프로토플라스트 수를 계수한 후, 냉각된 W5 용액에서 밀리리터당 5번째 프로토플라스트의 2배의 농도로 10을 곱한 농도로 희석합니다. 원형질체를 얼음 위에 30분 동안 보관합니다. 현탁액을 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리합니다.그런 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 원형체 펠릿을 방해하지 않고 W5 용액을 부드럽게 제거합니다. 프로토플라스트를 실온에서 MMG 용액에 2배의 농도로 10의 2배에서 밀리리터당 5번째 프로토플라스트의 농도로 재현탁합니다. 형질전환을 위해 프로토플라스트를 준비하려면 절단되지 않은 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 1.5ml 저접착 마이크로원심분리기 튜브에서 프로토플라스트 100마이크로리터 분취량을 만듭니다.음성 대조군 역할을 하기 위해 하나의 부분 표본을 따로 둡니다. 프로토플라스트의 나머지 분취액에 10마이크로리터의 플라스미드 DNA를 추가합니다. 110밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 내벽에 갓 준비한 페그 용액 1.5마이크로리터를 천천히 추가합니다.그런 다음 용액이 균질해질 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집고 회전시킵니다. 실온에서 15분 동안 형질전환 혼합물을 배양합니다. 변형을 중지하려면 실온에서 각 1.5ml 튜브에 400마이크로리터의 W5 용액을 천천히 추가하고 용액이 균질해질 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.튜브를 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 각 튜브에 1ml의 WI 용액을 추가합니다.6개의 웰 조직 배양 플레이트의 웰 표면을 코팅하여 프로토플라스트가 플레이트에 달라붙는 것을 방지합니다. 각 웰에 5% 멸균 송아지 세럼 1ml를 첨가하고 몇 초 후에 피펫을 사용하여 송아지 세럼을 제거합니다. 재현탁된 원형질체를 배양판의 웰로 옮기고 플레이트를 뚜껑으로 덮습니다.수확하기 전에 원형질체를 실온에서 어둠 속에서 이틀 동안 배양합니다. 2일 후, 프로토플라스트 용액을 1.5ml 저접착 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리합니다.피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 10마이크로리터의 원형질체를 유리 슬라이드에 옮깁니다. 형광 또는 컨포칼 현미경 검사에서 비형질전환 원형질체를 음성 대조군으로 사용하여 형광 신호를 관찰합니다.원형아세포 세포는 10일 된 콩의 다른 장기에서 준비하여 현미경으로 관찰했습니다. 꼬리하수하부(hypocaudal)와 미각부(epicaudal)의 세포벽은 거의 소화되지 않았다. 그리고 일부 세포는 서로 붙어 있었습니다.꼬리 납과 뿌리에서 세포벽은 세포의 작은 부분에서만 제거되었습니다. 대조적으로, unifoliate가 사용되었을 때 많은 수의 원형질체가 관찰되었습니다. 이 사진의 묘목은 왼쪽에서 오른쪽으로 팽창하지 않거나, 단지 팽창하거나, 완전히 팽창 된 unifoliate 잎을 보여줍니다.팽창하지 않은 잎과 방금 팽창한 unifoliate 잎 모두 protoplasts의 높은 수율을 가져왔지만, 방금 확장된 unifoliate의 protoplasts의 크기는 unexpanded unifoliate보다 더 균일했습니다. 완전히 확장된 unifoliate의 경우, 세포벽은 대부분의 세포에서 여전히 손상되지 않았습니다. 다양한 양의 플라스미드 DNA를 테스트한 결과, DNA의 양이 많을수록 형질전환 효율이 더 높다는 것을 알 수 있었습니다.콩과 식물 특이적 E1 유전자에 융합된 GFP를 발현하는 구조체로 형질전환된 대두 원형질체의 컨포칼 이미지는 E1 GFP 융합 단백질의 핵 국소화를 보여주었으며, 이는 애기장대 원형질체 시스템을 사용하는 이전 연구와 일치합니다. 이 절차를 시도하는 동안 잎 물질의 올바른 단계 선택, 세포벽 소화 시간의 길이, 농도 연령 및 형질전환을 위한 플라스미드 DNA의 양과 같은 각 실험 조건을 경험적으로 최적화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 RNA 및 단백질 복제와 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 유전자 또는 단백질이 조절되거나 조절되지 않는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 고품질 대두 원형아세포 세포를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직에서 그대로 protoplasts를 분리하는 절차를 보여줍니다. 격리 protoplasts 적어도 96h 위해 그대로 유지하고 대신 한 달 된 성숙한 식물의 모종으로부터 격리되는 감안할 때,이 절차는 그대로 protoplasts가 필요한 assays을 신속.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

우리는 소개, 추적 및 식물 세포에서 GFP의 표현의 정량 분석​​에 대한 방법을보고합니다. 이 방법은 시간이 지남에 샘플을 다수의 세미 연속 이미지 수집을위한 맞춤 설계된 로봇 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 이미지 시리즈의 분석 ImageJ와 ImageReady의 사용을 보여줍니다.

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

여기에서 우리는 옥수수 중엽 세포에서 플라스미드의 대규모 라이브러리를 테스트하기 위해 수백만 개의 옥수수 원형질체를 일시적으로 형질감염시키는 고처리량 프로토콜을 제시합니다.

옥수수 중엽 원형질체의 확장 가능한 형질감염

여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

학습하세요 콩 프로토플래스트 분리법으로 식물 세포 신호 전달 및 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 방법. 이 기술은 대량의 균일한 세포를 얻어 생체 내 단백질 상호작용과 유전자 발현 분석에 활용할 수 있습니다.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

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