콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

이 방법의 전반적인 목표는 살아있는 대두 세포의 조절 및 신호 전달 메커니즘을 조사하기 위해 대두에서 고품질 원형아세포 세포를 얻는 것입니다. 이 방법은 즉각적인 표적 유전자가 무엇인지, 수혈 인자를 열고, 상호 작용 파트너가 단백질을 개방하는지와 같은 조절 네트워크의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 예술입니다.

그것은 많은 양의 균일한 콩 원형세포 세포를 생산하며 간단하고 쉽습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 특정 단계에서 각질을 하지 않는 한 콩 잎에서 좋은 원형질체를 얻기가 매우 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 적절한 발달 단계에서 잎을 선택하는 것이 성공적인 대두 원형질체 준비의 핵심입니다.

10일 된 콩 묘목에서 새로 팽창된 단엽 잎을 자릅니다. 샘플에서 높은 프로토플라스트 수율을 얻을 수 있는지 확인하려면 약간 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎 샘플을 최소 3개 이상 수집하십시오. 새 면도날로 각 단엽 잎에서 중간 갈비뼈를 제거한 다음 잔해를 0.5-1mm 스트립으로 자릅니다.

한 쌍의 집게를 사용하여 잎 스트립을 15ml 튜브에 담긴 10ml의 갓 준비한 효소 용액에 즉시 부드럽게 옮깁니다. 실온에서 15분 동안 잎 스트립에 진공 침투합니다. 효소 용액에 잎 조각을 넣고 실온에서 4-6시간 동안 약한 조명에서 부드럽게 저어 배양합니다.

원형질체가 방출되면 효소 용액이 황록색으로 변합니다. 10배 배율로 현미경으로 효소 원형질체 용액을 확인하여 원형질체 분해가 가장 좋은 샘플을 선택합니다. 방출된 원형질체는 구형인 반면, 소화되지 않은 세포는 불규칙하거나 타원

소화를 멈추려면 최상의 프로토플라스 분해액을 가진 10ml의 효소 원형질체 용액을 50ml 튜브에 부드럽게 붓고 실온에서 10ml의 W5 용액을 첨가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 효소 원형질체 용액을 50ml 튜브 위에 놓인 깨끗한 75미크론 나일론 메쉬에 부드럽게 부어 소화되지 않은 잎 조직을 제거합니다.

다음으로, Flow Through Enzyme protoplast 용액을 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리한다. 그런 다음 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 원형질체 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 부드럽게 제거합니다. 프로토플라스트를 냉각된 W5 용액에 재현탁시키고 50ml 튜브를 얼음 위에 두십시오.

현미경으로 혈구계에서 프로토플라스트 수를 계수한 후, 냉각된 W5 용액에서 밀리리터당 5번째 프로토플라스트의 2배의 농도로 10을 곱한 농도로 희석합니다. 원형질체를 얼음 위에 30분 동안 보관합니다. 현탁액을 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리합니다.

그런 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 원형체 펠릿을 방해하지 않고 W5 용액을 부드럽게 제거합니다. 프로토플라스트를 실온에서 MMG 용액에 2배의 농도로 10의 2배에서 밀리리터당 5번째 프로토플라스트의 농도로 재현탁합니다. 형질전환을 위해 프로토플라스트를 준비하려면 절단되지 않은 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 1.5ml 저접착 마이크로원심분리기 튜브에서 프로토플라스트 100마이크로리터 분취량을 만듭니다.

음성 대조군 역할을 하기 위해 하나의 부분 표본을 따로 둡니다. 프로토플라스트의 나머지 분취액에 10마이크로리터의 플라스미드 DNA를 추가합니다. 110밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 내벽에 갓 준비한 페그 용액 1.5마이크로리터를 천천히 추가합니다.

그런 다음 용액이 균질해질 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집고 회전시킵니다. 실온에서 15분 동안 형질전환 혼합물을 배양합니다. 변형을 중지하려면 실온에서 각 1.5ml 튜브에 400마이크로리터의 W5 용액을 천천히 추가하고 용액이 균질해질 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.

튜브를 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 각 튜브에 1ml의 WI 용액을 추가합니다.

6개의 웰 조직 배양 플레이트의 웰 표면을 코팅하여 프로토플라스트가 플레이트에 달라붙는 것을 방지합니다. 각 웰에 5% 멸균 송아지 세럼 1ml를 첨가하고 몇 초 후에 피펫을 사용하여 송아지 세럼을 제거합니다. 재현탁된 원형질체를 배양판의 웰로 옮기고 플레이트를 뚜껑으로 덮습니다.

수확하기 전에 원형질체를 실온에서 어둠 속에서 이틀 동안 배양합니다. 2일 후, 프로토플라스트 용액을 1.5ml 저접착 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 실온에서 1-2분 동안 100배 G로 원심분리합니다.

피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 10마이크로리터의 원형질체를 유리 슬라이드에 옮깁니다. 형광 또는 컨포칼 현미경 검사에서 비형질전환 원형질체를 음성 대조군으로 사용하여 형광 신호를 관찰합니다.

원형아세포 세포는 10일 된 콩의 다른 장기에서 준비하여 현미경으로 관찰했습니다. 꼬리하수하부(hypocaudal)와 미각부(epicaudal)의 세포벽은 거의 소화되지 않았다. 그리고 일부 세포는 서로 붙어 있었습니다.

꼬리 납과 뿌리에서 세포벽은 세포의 작은 부분에서만 제거되었습니다. 대조적으로, unifoliate가 사용되었을 때 많은 수의 원형질체가 관찰되었습니다. 이 사진의 묘목은 왼쪽에서 오른쪽으로 팽창하지 않거나, 단지 팽창하거나, 완전히 팽창 된 unifoliate 잎을 보여줍니다.

팽창하지 않은 잎과 방금 팽창한 unifoliate 잎 모두 protoplasts의 높은 수율을 가져왔지만, 방금 확장된 unifoliate의 protoplasts의 크기는 unexpanded unifoliate보다 더 균일했습니다. 완전히 확장된 unifoliate의 경우, 세포벽은 대부분의 세포에서 여전히 손상되지 않았습니다. 다양한 양의 플라스미드 DNA를 테스트한 결과, DNA의 양이 많을수록 형질전환 효율이 더 높다는 것을 알 수 있었습니다.

콩과 식물 특이적 E1 유전자에 융합된 GFP를 발현하는 구조체로 형질전환된 대두 원형질체의 컨포칼 이미지는 E1 GFP 융합 단백질의 핵 국소화를 보여주었으며, 이는 애기장대 원형질체 시스템을 사용하는 이전 연구와 일치합니다. 이 절차를 시도하는 동안 잎 물질의 올바른 단계 선택, 세포벽 소화 시간의 길이, 농도 연령 및 형질전환을 위한 플라스미드 DNA의 양과 같은 각 실험 조건을 경험적으로 최적화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 RNA 및 단백질 복제와 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 유전자 또는 단백질이 조절되거나 조절되지 않는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 고품질 대두 원형아세포 세포를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.