식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기 설립

이 절차는 특정 세포 유형에서 GFP를 발현하는 식물에 의존하며, 이는 형광 활성화 세포 분류 또는 사실을 사용하여 나머지 식물 세포와 분리될 수 있습니다. 이 예제에서는 애기장대(Arabidopsis)의 특정 세포 유형에서 발현되는 두 개의 마커 선을 사용합니다. Aliana 뿌리 묘목은 식물 트레이 또는 한천 플레이트에서 자랍니다.

그들의 뿌리는 수확되어 세포벽 소화 효소로 처리됩니다. 1시간 후 용액을 여과하여 큰 파편을 제거합니다. 그런 다음 용액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

GFP 양성 원형질체는 이후에 팩스로 분리됩니다. 분류된 물질은 게놈 전체 전사 프로파일과 같은 세포 유형별 분석에 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕 대학교 생물학과의 Ken Birnbaum 실험실의 Basian Barman입니다.

오늘 우리는 식물 원형질체의 형광 활성화 세포 분류 절차를 보여 드리겠습니다. 이 예에서는 애기장대 경로에서 두 가지 특정 세포 유형을 분류합니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 세포 유형별 전사 프로파일을 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 야생형 묘목과 GFP의 세포 유형 특이적 발현이 있는 묘목을 성장시킵니다. GFP를 모는 허수아비 프로모터는 한 그룹의 묘목에서 뿌리 배배엽과 정지 중심을 표시합니다.

그리고 또 다른 그룹에서, 뿌리 정지 중심은 GFP를 주도하는 5개의 발기인으로 표시됩니다. 묘목은 수경법으로 성장하고 뿌리가 성장 매체로 자랄 수 있도록 나일론 필터 위에 FIA 트레이가 있습니다. 또는 나일론 메쉬 위에 식물을 재배하고 1% 한천 플레이트를 수직으로 배치할 수 있습니다.

뿌리 수확을 돕는 것 외에도 필터를 사용하면 묘목을 새로운 식물 트레이 또는 한천 플레이트로 대량으로 옮겨 관심 촉매로 보충 할 수 있습니다. 이는 영양소, 호르몬 또는 스트레스 치료에 대한 세포 유형 특이적 전사 반응을 연구하기 위해 수행될 수 있습니다. 형광 현미경 아래를 확인하여 형광 마커가 예상대로 발현되는지 확인합니다.

마커의 발현 패턴은 처리의 결과로 변할 수 있으므로 적용된 처리 조건에서 일관성이 있는지 확인하십시오. 원형질체를 수확하고 준비합니다. 먼저 protoplasts 용액을 준비합니다.

부피 당 1.25 % 무게 셀룰라아제, 부피 당 무게 0.3 %, maser zyme 0.4 몰 D 만니톨 20 밀리 몰, MES 및 20 밀리 몰 KCL을 탈염수에 결합하고 pH 7.5에서 하나의 몰 트리스 HCL로 pH를 5.7로 조정합니다. 이 솔루션은 약간 탁합니다. 그런 다음 용액을 섭씨 55도까지 10분 동안 가열합니다.

해결책은 맑게 돌고, 실내 온도에 식히게 한 후에 양 BSA 10 millimolar 염화칼슘 및 5개의 millimolar beta 저 capto 에타놀 수확 1개의 phyto 쟁반에서 1 주일 된 묘목 당 0.1%weight를 추가할 것입니다. 허수아비 GFP 라인 또는 4일 된 8개의 플레이트의 경우 5G FP 묘목을 걷습니다. 메스로 나일론 메쉬에서 뿌리를 긁어낸 다음 원형질체 용액이 있는 용기에 넣습니다.

묘목 1500개당 약 10ml의 프로토플라스트 용액을 사용합니다. 플라스크를 실온에서 75RPM으로 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 배양 시간이 길어지면 프로토플라스트 수율이 증가할 수 있지만 프로토플라체 자체가 유전자 발현에 미치는 영향도 증가합니다.

이제 프로토플라스트가 방출되었으므로 40마이크로미터 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 여과하고 프로토플라스트 현탁액을 원뿔형 15mil 튜브 사이에 나눕니다. 사실이 막히는 것을 방지하고 세포를 분류하는 데 필요한 시간을 최소화하기 위해 너무 많은 파편이 없는 깨끗한 protoplasts 현탁액을 생성하는 것이 중요합니다. 스윙 버킷 원심분리기에서 튜브를 실온에서 10분 동안 500G로 원심분리합니다.

원심분리 속도는 원형질체를 생성하는 식물 절편의 구성과 효소 처리 중에 생성되는 세포 파편의 양에 따라 달라집니다. 원심분리 후, 대부분의 상층액을 제거하고 소량의 잔류 원형질체 용액에 프로톱플라스트를 함유한 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 마지막으로, 혈구분석기를 사용하여 원형질체를 계수하고 밀도를 측정하여 수율을 계산하고 사실 실행 매개변수를 결정합니다.

계수 한 후 원형질체를 검사하십시오. 이들의 무결성, GFP 발현 수준 및 오염된 세포 파편의 함량을 확인하십시오. 그런 다음 팩스를 진행합니다.

팩스로 바로 진행하지 않는 경우. 프로토플라스트는 효소가 첨가되지 않은 프로토 도금 용액 또는 W five 용액과 같은 배양 용액에서 세척, 재현탁 및 보관할 수 있습니다. 셀 분류기와 워크스테이션 컴퓨터를 켭니다.

여기서 우리는 Becton Dixon and Company에서 제조 한 fria를 사용합니다. 하나의 XPBS를 시스 유체로 사용하고 유체 시동 절차를 실행합니다. 100마이크로미터 노즐을 설치하고 20PSI 외피 압력을 설정합니다.

안정적인 흐름 흐름을 설정하고 낙하 지연을 보정합니다. 이 절차에는 보정이 표시되지 않습니다. mil당 1,000만 개의 세포만큼 높은 밀도를 가진 Protoplasts 현탁액을 성공적으로 분류할 수 있습니다.

원형질체의 침전을 방지하려면 사실에 대한 샘플 교반 옵션을 사용하십시오. 사실을 모호하게 만드는 것이 문제인 경우 세 가지 가능한 촬영 단계가 있습니다. 먼저 샘플 라인 백 플러시를 수행합니다.

둘째, 밀도를 줄이기 위해 프로토플라스트 현탁액을 희석합니다. 셋째, 원심분리 및 재현탁액 후 여과 단계를 반복하여 프로톱플라스트 용액을 세척합니다. GFP 양성 프로토플라스트와 GFP 음성 프로토플라스트를 구별하기 위해 단 4개의 매개변수만 사용되며, 488나노미터 레이저 전방 산란에 의한 여기가 입자 크기의 지표인 후 세포 파편이 입자 크기의 지표이고 측면 산란은 입자 입도의 지표입니다.

녹색 형광의 척도로 530나노미터에서 방출하고 적색 스펙트럼 자가형광의 척도로 610나노미터에서 방출. 먼저 전방 산점도 대 측면 산점도에 대한 점도를 설정합니다. 측정된 이벤트가 플롯의 중앙에 오도록 전압 설정을 적용합니다.

GFP 양성 PROTOPLAST는 자가형광이 있는 이벤트에 비해 녹색과 적색 방출의 비율이 증가하여 구별할 수 있습니다. 녹색 형광과 빨간색 스펙트럼 자가형광이 있는 점도표만 설정하십시오. 측정된 이벤트가 플롯에서 단일 대각선 모집단을 발생시키는 방식으로 전압 설정을 적용합니다.

야생형 프로토플라스트 현탁액을 볼 때, GFP 양성 프로토플라스트는 야생형 샘플에서 볼 수 없는 녹색 형광 이벤트의 명확한 집단을 생성해야 합니다. compensation constraints를 설정하여 녹색 형광과 빨간색 스펙트럼 자가형광 사이의 스펙트럼 중첩을 조정합니다. GFP 양성 PROTOPLASTS 현탁액을 사용하면 적절한 보상 제약 조건 설정을 통해 GFP 양성 단백질체를 비 GFP 전구체 및 파편이 아닌 단백질과 더 잘 분리하여 GFP 양성 이벤트를 식별하기 위한 게이트를 설정할

게이트 경계를 정의하는 데 도움이 되는 분류 실험을 준비할 때마다 GFP가 아닌 PROTOPLAST를 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 작은 파편이 분석에서 제외되도록 전방 산란 임계값 컷오프를 설정합니다. 전방 산점도 대 측면 산점도에서 GFP 양성 이벤트를 시각화하면 임계값을 설정해야 하는 위치를 결정하는 데 도움이 됩니다.

이 초기 팩트 실행에서 설정된 매개 변수는 향후 정렬에 다시 사용할 수 있습니다. 사실의 일상적인 사용을 위해 약간의 조정이 필요할 것입니다. RNA 추출의 경우 RNA 추출 버퍼가 포함된 수집 튜브를 준비하고, 최대 100마이크로리터의 분류 부피에서 350마이크로리터의 추출 버퍼를 가이드로 사용합니다.

20, 000 정렬 이벤트는 약 100 마이크로 리터의 총 정렬 볼륨을 산출합니다. 이제 팩스 매개변수와 작동 모드가 설정되고 수집 튜브가 준비되었으므로 정렬이 완료되면 프로톱플라스트 정렬을 시작합니다. 세포 현탁액이 상단에 모일 수 있으므로 샘플 수집 튜브를 혼합하면 RNA 추출 및 CD NA 증폭 후 마이크로어레이 분석에 최소 500개의 정렬된 이벤트를 사용할 수 있습니다.

여기서 우리는 RNEZ 마이크로 추출 키트, WT ovation PICO RNA 증폭 시스템 및 fl ovation CD NA 비오틴 모듈 V 2를 사용합니다. 다음은 비 GFP 허수아비, GFP 및 W 5G FP 묘목에서 파생된 원형질체에 대한 일반적인 팩스 결과입니다 100, 000 이벤트는 x축에서 녹색 형광과 적색 형광의 각 점도표에 표시됩니다. Y축에서 GFP 정렬 게이트 내에 있는 이벤트는 녹색으로 강조 표시됩니다.

이것은 뿌리 배배엽과 정지 중심을 표시하는 허수아비 GFP 또는 뿌리 정지 중심을 표시하는 5G FP를 표현하는 묘목의 전형적인 원형질체 수율을 요약한 것입니다. 뿌리 정지 중심에는 뿌리 내피에 비해 더 적은 세포가 있습니다. 따라서 더 많은 원형질체로 시작했음에도 불구하고 GFP 발현 세포의 수율은 여기에 표시된 허수아비 GFP 정렬에 비해 도보 5G FP 정렬에서 더 작습니다.

각 샘플은 10, 000 이벤트에서 추출된 RNA에 해당합니다. 추출된 RNA는 상부에 있는 허수아비 GFP 샘플의 리보솜 피크를 보여주는 바이오분석기에서 분석하고, 추출된 RNA 아래의 도보 5G FP 샘플은 마이크로어레이 분석에 추가로 사용할 수 있습니다. 로그 두 발현 수준의 이 산점도는 두 반복실험 간의 유사성을 보여줍니다.

세포 유형 특이적 분석을 위해 식물 원형질체의 형광 활성화 세포 분류를 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술은 다양한 식물 조직과 종에 적용할 수 있습니다. 파편 함량이 낮고 건강한 프로토플라스트를 가진 양호한 수율은 전사 및 기타 분석에서 더 나은 다운스트림 결과를 제공합니다.

또한 분류된 샘플을 비교하기 위해 식물 재료의 성장 조건을 동일하게 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.