식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

이 절차는 특정 세포 유형에서 GFP를 발현하는 식물을 이용하며, 형광 활성 세포 분쇄(fluorescence activated cell sorting) 또는 FACS를 통해 이러한 세포를 나머지 식물 세포로부터 분리할 수 있습니다. 이 예시에서는 Arabidopsis의 특정 세포 유형에서 발현되는 두 가지 마커 라인을 사용합니다. Aliana 뿌리 묘는 파이토 트레이(phyto trays) 또는 한천 배지 플레이트에서 배양합니다.

뿌리를 수확하여 세포벽 소화 효소로 처리합니다. 1시간 후, 용액을 여과하여 커다란 잔해물을 제거합니다. 그런 다음 용액을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.

GFP 양성 프로토플라스트는 이후 FACS를 통해 분리됩니다. 이렇게 분류된 시료는 전장 유전체 전사 프로파일과 같은 세포 유형 특이적 분석에 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕 대학교 생물학과 Ken Birnbaum 연구실의 Basian Barman입니다.

오늘은 식물 원형질체(protoplast)의 형광 활성 세포 분리(fluorescence activated cell sorting) 절차를 보여드리겠습니다. 이 예제에서는 Arabidopsis 뿌리의 두 가지 특정 세포 유형을 분리하겠습니다. 저희 연구실에서는 세포 유형 특이적 전사 프로파일을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 야생형 유묘와 세포 유형 특이적으로 GFP가 발현되는 유묘를 배양하십시오. 한 그룹의 유묘에서는 scarecrow 프로모터에 의해 GFP가 발현되어 뿌리 내피와 정지 중심(quiescent center)이 표시됩니다.

그리고 또 다른 그룹에서는, root quiescent center를 표시하기 위해 walks five 프로모터가 구동하는 GFP를 사용합니다. 묘는 나일론 필터 위에 놓인 FIA 트레이에서 수경 재배하며, 이를 통해 뿌리가 성장 배지로 자라나게 합니다. 또는, 나일론 메쉬 위에서 수직으로 배치된 1% agar 플레이트 상에서 식물을 재배할 수도 있습니다.

필터는 뿌리 수확을 돕는 것 외에도, 묘목을 새로운 피토 트레이(phyto tray)나 한천 배지로 대량 이동시켜 관심 있는 촉매제를 보충할 수 있게 해줍니다. 이는 영양소, 호르몬 또는 스트레스 처리에 대한 세포 유형별 전사 반응을 연구하기 위해 수행될 수 있습니다. 형광 현미경으로 확인하여 형광 마커가 예상대로 발현되었는지 검증하십시오.

처리에 따라 마커의 발현 패턴이 변할 수 있으므로, 적용된 처리 조건 하에서 마커의 발현 패턴이 일관된지 확인하십시오. 이어서 원형질체를 수확하고 준비합니다. 먼저 원형질체 용액을 준비하는 것부터 시작하십시오.

탈이온수에 1.25% w/v cellulase, 0.3% w/v maser zyme, 0.4 M D-mannitol, 20 mM MES 및 20 mM KCl을 혼합하고, pH 7.5의 1 M tris HCl을 사용하여 pH를 5.7로 조정합니다. 이 용액은 약간 혼탁할 수 있습니다. 그 다음, 용액을 55 °C에서 10분 동안 가열합니다.

용액이 투명해지면 실온까지 식힌 후, 0.1% w/v BSA, 10 mM 염화칼슘, 그리고 5 mM beta me 캡토 에탄올을 첨가하십시오. 한 개의 파이토 트레이에서 1주일 된 유묘를 수확하십시오. scarecrow GFP 라인의 경우, 또는 4일 된 5G FP 유묘 8플레이트를 사용하십시오. 메스로 나일론 메쉬에서 뿌리를 긁어낸 다음, 프로토플라스트 용액이 담긴 용기에 넣으십시오.

묘목 1500개당 약 10 milliliters의 원형질체 용액을 사용하십시오. 플라스크를 실온에서 75 RPM으로 한 시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양 시간을 늘리면 원형질체 수득률은 높아질 수 있으나, 유전자 발현에 미치는 원형질체 자체의 영향 또한 증가할 수 있습니다.

원형질체가 방출되었으므로, 40 µm 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 여과하고 원형질체 현탁액을 15 mL 원추형 튜브에 나누어 담습니다. 팩의 막힘을 방지하고 세포 분리에 소요되는 시간을 최소화하기 위해, 잔해물이 너무 많지 않은 깨끗한 원형질체 현탁액을 만드는 것이 중요합니다. 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 상온에서 500 G로 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.

원형질체를 얻기 위해 사용한 식물 부위의 구성과 효소 처리 과정 중 생성된 세포 파편의 양에 따라 원심분리 속도가 달라질 수 있음에 유의하십시오. 원심분리 후, 상층액의 대부분을 제거하고 원형질체가 포함된 펠릿을 소량의 잔류 원형질체 용액에 넣어 조심스럽게 재현탁합니다. 마지막으로, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 원형질체 수를 측정하고 밀도를 결정하여 수율을 계산하고 후속 실험 파라미터를 결정합니다.

계수 후, 프로토플라스트를 검사하십시오. 무결성, GFP 발현 수준 및 오염된 세포 파편의 함량을 확인하십시오. 그 다음, FACS 단계로 진행하십시오.

즉시 FACS를 진행하지 않는 경우, 원형질체(protoplast)를 세척하고 재현탁하여 효소가 첨가되지 않은 proto plating 용액이나 W5 용액과 같은 배양액에 보관할 수 있습니다. 세포 분석기(cell sorter)와 워크스테이션 컴퓨터의 전원을 켭니다.

본 실험에서는 Becton Dixon and Company 사에서 제조한 fria를 사용합니다. XPBS를 시스액(sheath fluid)으로 사용하고 유체 스타트업 절차를 실행합니다. 100 micrometer 노즐을 장착하고 시스 압력을 20 PSI로 설정합니다.

안정적인 흐름 스트림을 설정하고 드롭 지연(drop delay)을 보정하십시오. 본 절차에서는 보정 과정이 표시되지 않았음에 유의하십시오. ml당 1,000만 개의 세포에 달하는 고농도의 원형질체 현탁액도 성공적으로 분리할 수 있습니다.

원형질체(protoplast)의 침전을 방지하기 위해, 팩스의 샘플 교반 옵션을 사용하십시오. 팩스의 막힘 문제가 발생하는 경우, 세 가지 가능한 해결 단계가 있습니다. 우선, 샘플 라인의 역세척(back flush)을 수행하십시오.

둘째, 원형질체 현탁액을 희석하여 밀도를 낮춥니다. 셋째, 원심분리 및 재현탁 후 여과 단계를 반복하여 원형질체 용액을 정제합니다. 488 nanometer 레이저로 여기시킨 후 GFP 양성 원형질체와 GFP 음성 원형질체 및 세포 잔해를 구별하는 데 네 가지 매개변수가 사용되며, 전방 산란(forward scatter)은 입자 크기의 지표로, 측방 산란(side scatter)은 입자 과립도의 지표로 활용됩니다.

녹색 형광의 측정값으로 530 nanometers에서의 방출을, 적색 스펙트럼 자가형광의 측정값으로 610 nanometers에서의 방출을 사용합니다. 먼저 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter)의 도트 플롯을 설정하십시오. 측정된 이벤트들이 플롯의 중앙에 위치하도록 전압 설정을 적용하십시오.

GFP 양성 원형질체(PROTOPLASTS)는 자가형광이 나타나는 이벤트와 비교하여 녹색 방출 대 적색 방출의 비율이 증가하는 것으로 구분할 수 있습니다. 녹색 형광 대 적색 스펙트럼 자가형광을 나타내는 도트 플롯(dot plot)만을 설정하십시오. 측정된 이벤트들이 플롯상에서 단일 대각선 군집을 형성하도록 전압 설정을 적용하십시오.

야생형 원형질체 현탁액을 관찰할 때, GFP 양성 원형질체는 야생형 샘플에서는 볼 수 없는 뚜렷한 녹색 형광 이벤트 집단을 생성해야 합니다. 녹색 형광과 적색 스펙트럼 자가형광 사이의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 보정 제약 조건을 설정하십시오. GFP 양성 원형질체 현탁액을 사용할 때, 적절한 보정 제약 조건 설정을 통해 GFP 양성 원형질체를 비-GFP 원형질체 및 파편으로부터 더 잘 분리할 수 있으며, GFP 양성 이벤트를 식별하기 위한 게이트를 설정하십시오.

게이트 경계를 설정하는 데 도움을 주기 위해, 소팅 실험을 준비할 때마다 GFP 음성 원형질체(non GFP PROTOPLASTS)를 함께 준비하는 것이 권장됩니다. 마지막으로, 작은 파편들이 분석에서 제외될 수 있도록 전방 산란(forward scatter) 임계값 차단치를 설정하십시오. 전방 산란 대 측방 산란(forward scatter versus side scatter) 플롯에서 GFP 양성 이벤트의 시각화 자료를 통해 임계값을 어디에 설정해야 할지 결정하는 데 도움을 받을 수 있습니다.

이 초기 facts 실행에서 설정한 파라미터는 향후 정렬에 재사용할 수 있습니다. 실제 매일의 facts 사용 시에는 약간의 조정이 필요할 것입니다. RNA 추출을 위해 RNA 추출 버퍼가 담긴 수집 튜브를 준비하십시오. 가이드라인으로 정렬 부피 최대 100 µL 당 350 µL의 추출 버퍼를 사용하십시오.

20,000회의 분류 이벤트는 약 100 microliters의 총 분류 부피를 생성합니다. FACS 파라미터와 작동 모드가 설정되었고 수집 튜브가 준비되었다면, 프로토플라스트 분류를 시작하고 분류가 완료될 때까지 기다립니다. 세포 현탁액이 상단에 뭉칠 수 있으므로 샘플 수집 튜브를 혼합하십시오. RNA 추출 및 cDNA 증폭 후 마이크로어레이 분석에는 분류된 이벤트 중 500개만으로도 충분히 사용할 수 있습니다.

여기서는 RNEZ 마이크로 추출 키트, WT ovation PICO RNA 증폭 시스템 및 fl ovation CD NA 비오틴 모듈 V2를 사용합니다. 다음은 non GFP Scarecrow, GFP 및 W 5G FP 유묘에서 유래한 원형질체에 대한 전형적인 FACS 결과입니다. 각 도트 플롯의 X축은 녹색 형광, Y축은 적색 형광으로 하여 100,000개의 이벤트가 표시되어 있습니다. GFP 분리 게이트 내에 해당하는 이벤트는 녹색으로 강조 표시되었습니다.

이것은 뿌리 내피와 정지 중심을 표시하는 scarecrow GFP 또는 뿌리 정지 중심을 표시하는 walks 5G FP를 발현하는 유묘로부터 얻은 전형적인 원형질체 수득량의 요약입니다. 뿌리 정지 중심에는 뿌리 내피에 비해 더 적은 수의 세포가 존재합니다. 따라서, 더 많은 수의 원형질체로 시작했음에도 불구하고, GFP 발현 세포의 수득량은 여기에 표시된 scarecrow GFP 분류에 비해 walks 5G FP 분류에서 더 적게 나타납니다. 여기에는 3회 반복 시료의 전형적인 RNA 추출 결과가 제시되어 있습니다.

각 샘플은 10,000개의 이벤트에서 추출한 RNA에 해당합니다. 추출된 RNA를 바이오분석기(bioanalyzer)로 분석하면 상단에는 scarecrow GFP 샘플의 리보솜 피크가, 하단에는 walks 5G FP 샘플의 리보솜 피크가 나타납니다. 추출된 RNA는 마이크로어레이 분석에 추가로 사용할 수 있습니다. log2 발현 수준을 나타낸 이 산점도는 두 반복 실험군 사이의 유사성을 보여줍니다.

지금까지 세포 유형별 분석을 위해 식물 원형질체(protoplast)의 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)를 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 기술은 다양한 식물 조직과 종에 적용 가능합니다. 세포 부스러기 함량이 낮고 상태가 양호한 원형질체를 높은 수율로 얻으면, 전사체 분석 및 기타 분석의 후속 결과가 더 개선될 것입니다.

또한 분류된 샘플 간의 비교를 위해 식물 재료의 성장 조건을 동일하게 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모두 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.