Name: 식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 학습하세요 식물 프로토플라스트의 형광 활성 세포 정렬(FACS) 방법을 통해 Arabidopsis thaliana의 특정 세포 유형을 분리하는 기술입니다. GFP 형광 마커를 활용한 이 방법은 세포 유형별 전사체 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (부여 안돼. DBI 0,519,984)과 국립 보건원 (부여 안돼. 5R01GM078279)에 의해 지원되었다 ...

식물 1) 준비 <ol><li> Protoplasts는 효소를 소화 세포 벽의 오른쪽 혼합이 1을 사용된다는 가정하에 다양한 식물 종 및 조직에서 얻을 수 있습니다. 본격적인 실험이 수행되기 전에, 소재의 작은 규모의 소화는 조직의 protoplasting 효율성, 효소 등을 평가하고 셀 정렬에 대한 %로 긍정적인 세포를 추정하기 위해 좋습니다. 여기, 셀 타입 - 구체적으로 표현하는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하는 Arabidopsis thaliana의 모종의 뿌리에서 파생된 protoplasts. endodermis와 정지 센터는 P SCR로 표시됩니다 : GFP와 P WOX5에 의해 정지 센터 : : GFP 2,3 (그림 1). </li><li> 뿌리 (0.22 % W / V Murashige와 Skoog 기초 매체 [시그마], 1 %의 성장 매체로 통해 성장 수, 나일론 필터 (NITEX 250 μm의 메쉬)에, 모종은 (그림 2A 시그마) phytatrays에서 hydroponically 재배 W / V 자당, 0.05 % W / V MES [2 - (N - morpholino) ethanesulfonic의 산] 코와 산도 5.7). 또한, 식물이 수직으로 위치 1 % 한천 플레이트에 나일론 필터 (100 μm의 메쉬) (그림 2B) 위에 성장하실 수 있습니다. </li><li> 원하는 경우 뿌리의 수확뿐만 아니라 에이즈 상기 필터의 사용은 또한, 묘목 쉽게 추가 치료를 용이하게합니다. 필터는 묘목이 관심의 촉매로 보충하거나 새로운 phytatrays 한천 플레이트에 EN 메스를 전송할 수 있습니다. 예를 들어, phytatray 설정은 최대 Arabidopsis 모종의 질소 치료 4 transcriptional 응답 세포 유형의 특정 분석에 사용되었습니다. </li><li> 미세하여 형광 마커가 제대로 (자신이 치료에 의해 영향을받을 수있는 세포 유형 특정 마커로 치료 옵션을 사용하여 특히) 표시되었는지 확인하십시오. 이 경우에는 모종은 형광 현미경 (; 그림 1 니콘)에서 검사를하고 있습니다. 셀 유형 - 특정 형광 마커 라인이 정확하게 어떤 세포 유형이 표시됩니다 확인하고 표현의 다양성을 확인할 수 공촛점 현미경으로 처음 특성화되어야합니다. </li></ol> protoplasting 솔루션의 2) 준비 <ol><li> 1.25 % W / V Cellulase (Yakult), 0.3 % W / V Macerozyme (Yakult), 0.4 M D - mannitol, 20 MM MES와 demineralized 물 20 MM의 KCl을 (1 M 주식에서) 분해 및 5.7으로 산도를 조정 1 M 트리스 / HCL pH를 7.5로. 이 솔루션은 약간 흐린 것입니다. </li><li> 55 솔루션을 열 ° C 10 분 동안 (솔루션은 분명 바뀔 것이다)와 0.1 %를 추가하기 전에 실온까지 식지 W / V BSA (소 혈청 알부민), 10 MM CaCl 2, 5 MM β - 메르 캅 토 에탄올 . </li></ol> 3) 착취 및 식물 재료의 protoplasting <ol><li> 뿌리는 메스와 나일론 메쉬 그들을 근근이 살아가고하여 수확과 protoplasting 솔루션을 포함하고있는 플라스크에 입금됩니다. 일반적으로, protoplasting 솔루션의 10 ML은 1500 세들링 뿌리마다 사용됩니다. </li><li> 한 시간 만이라도 실온에서 부드럽게 flasks (75 RPM)를 흔들어. 더 이상 부화 시간은 원형질의 수율을 증가시킬 수 있습니다뿐만 아니라 유전자 발현에 대한 자체 protoplasting의 효과에 추가됩니다. </li><li> 40 μm의 셀 스트레이너 (BD 팔콘)로 원형질 솔루션을 필터링하고 원뿔 15 ML 튜브 (BD 팔콘)을 통해 솔루션을 나눕니다. </li><li> 이 원심 분리 속도가 사용된 protoplasts 종류의, 그들의 취약성과 효소 치료 기간 동안 생산 세포 파편의 크기에 따라 달라집니다 500 G. 주에서 10 분 동안 스윙 - 버킷 원심 분리기에 튜브를 스핀. </li><li> 뜨는의 대부분을 제거 나머지 솔루션 protoplasts을 resuspend하고 (그림 3) 미세 그들을 검사합니다. </li><li> protoplasts의 수와 밀도를 추정하는 hemacytometer을 사용합니다. 세포 밀도는 샘플 주입 속도, 외과에서 세포를 정렬하는 데 필요한 초 속도 당 행사와 따라서 전체 시간을 (또한 섹션 4.3 참조) 결정됩니다. </li><li> 3.7)은 외과로 바로 이동하거나없이 W5 (154 MM NaCl, 125 MM CaCl2, 5 MM KCl, 5 MM MES, 코와 5.7으로 산도를 조정) 또는 protoplasting 솔루션으로 부화 솔루션에 protoplasts 씻고 resuspend거나 효소를 추가했습니다. transcriptional 변경보고 특히 때에는 protoplasts 그것은 따라서 protoplasting 솔루션 protoplasts를 유지하고 진행하는 것이 좋습니다 인치 보관하는 버퍼를 변경으로 유전자 발현에 영향을 미칠 수 조건에 샘플의 노출을 최소화하기 위해 중요 가능한 한 빨리 외과합니다. </li></ol> protoplasts 4) 형광 활성 셀 정렬 <ol><li> 전원을 켜고 세포 분류기를 준비합니다. 여기 FACSAria (BD)가 사용됩니다. </li><li> 100 &amp; M과 흐름을 설정U; m 노즐과 20 PSI의 드레스 압력. </li><li> 세포 밀도와 샘플 사출 속도는 최상의 수율이나 빠른 속도를 원하는 달성 여부에 따라 특정 실험을 조정할 수 있습니다. 우리는 천만 셀 / ML 최대 밀도와 함께 성공적으로 정렬합니다. </li><li> protoplasts의 침강을 방지하기 위해 외과에 샘플 교반 옵션을 사용합니다. 1 : 외과의 막히는 것은 문제가있다면, 세 가지 문제 해결 단계가 있습니다. 샘플 온라인 backflush를 수행합니다. 2. 밀도를 줄이기 위해 귀하의 원형질 현탁액을 희석. 3. 원심 분리 및 resuspension 후 여과 단계 (3.3)를 반복하여 원형질의 솔루션을 정리. </li><li> 488 NM 레이저에 의해 여기 이후 붉은 스펙트럼 autofluorescence (RSA)에 GFP 및 20분의 610 nm의에 대한 30분의 530 nm의에서 앞으로 분산형 (FSC), 사이드 분산형 (SSC)와 방출을 측정하는 장치를 준비합니다. 이들은 본질적으로 GFP 양성 protoplasts을 분리하는 데 사용되는 유일한 매개 변수입니다. 여기 전압 설정은 다음과 같이되었습니다 : FSC - 60V, SSC 250V, 350V GFP 및 RSA 335V. 최적의 전압 설정은 모든 외과에 대해 서로 다른 것입니다 심지어 세포 분류기의 수명에 걸쳐 조정해야됩니다. </li><li> 앞으로 산란 대 사이드 분산을위한 dotplot를 설정하여 시작합니다. 측정된 이벤트 줄거리 중심으로되도록 전압 설정을 적용합니다. </li><li> 다음, 녹색 적색 형광 신호 대의 점 음모를 만들 수 있습니다. 야생 형 (비 GFP) 원형질의 정지를보고 때 측정 사건 줄거리의 중심 대각선 인구를 얻을 수 있도록 전압 설정을 적용합니다. GFP 표식 라인에서 파생된 원형질 서스펜션은 거친 타입 샘플에서 본 적이 녹색 형광 사건의 명확한 인구를 생성합니다. </li><li> GFP와 RSA 사이의 스펙트럼 중복에 대한 조정 보상 제약을 설정합니다. 적절한 보상 제약 설정은 비 GFP의 protoplasts와 부스러기에서 GFP 양성 protoplasts보다 분리 수 있습니다. RSA, 마이너스 17.91 %의 GFP : 여기에 사용되는 제약 조건은 다음과 같다. </li><li> 비 GFP의 protoplasts의 부정적인 컨트롤 게이트 경계 (그림 4) 정의에 투입 사용해야 GFP - 긍정적인 이벤트를 식별하기 위해 게이트를 설정합니다. </li><li> 분석에서 작은 파편를 떠나하기 위해 앞으로 흩어 커토프를 구현합니다. 컷오프의 위치를​​ 결정하는 데 도움이되도록 FSC 대 SSC의 음모에 GFP - 긍정적인 이벤트를 시각화. 여기서 단절는 5000으로 설정했습니다. 외과 조각이 높은 수준 정렬 행사와 샘플로 파편 계산됩니다이 예상보다 다른 %의 GFP 긍정적인 이벤트를 할 수 있습니다. 이것은 문제가 아니다. 그러나, 예제에서 더 많은 파편은 더 이상 정렬이됩니다. </li><li> 실험 및 분석에 대한 셀 타입의 풍부한에 따라 정렬 세포의 최적의 수율이나 최적의 순도에 대한 어느 외과 정밀 모드를 설정합니다. </li><li> RNA 추출을위한, RNA 추출 버퍼의 적절한 양의 컬렉션 튜브 (1.5 ML microfuge 튜브) 준비합니다. 이러한 설치로는, 20,000 정렬 이벤트 추출 버퍼 350 μl (RNeasy 마이크로 키트, QIAGEN)에 정렬되었습니다 약 100 μl의 총 볼륨을 얻을 것입니다. 정렬 완료 후 세포 현탁액은 상단에있는 수영장 수있는 샘플을 섞는다. </li><li> 샘플을 저장하거나 추출 RNA로 바로 진행합니다. 성공 microarray 분석은 같은 작은 500 정렬 행사에서 추출한 RNA로 preformed되었습니다. 여기, 우리는 RNeasy 마이크로 추출 키트 (QIAGEN) WT - 오베이션 피코 RNA의 증폭 시스템 및 FL - 오베이션 cDNA 비오틴 모듈 V2 (NuGEN)를 사용합니다. </li></ol> 대표 결과 약 1500 한 주 된 P SCR 중 하나 phytatray가 : GFP의 모종은 60,000 protoplasts (같은 hemacytometer에 의해 측정)에 대한 굴복. 65,000 외과 - 처리 이벤트의 2.6 %는 GFP - 긍정적인 것으로 정의되었고 (그림 4B) 정렬되었습니다. 약 1,500 4 일 된 P WOX5의 여덟 접시 : GFP의 모종 각 (12,000 총) 30,000,000 protoplasts (같은 hemacytometer에 의해 측정)에 대한 굴복. 16,000,000 외과 - 처리 이벤트의 0.063 %의 GFP - 긍정적인 것으로 정의되었고 (그림 4C) 정렬되었습니다. 10,000 정렬 이벤트는 일반적으로 RNA 추출을 위해 사용되며 20 일부터 140 NG 총 RNA (그림 5)을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Arabidopsis 루트에 셀 유형 특정 GFP 표지 라인. 형광 현미경 이미지는 미분 간섭 대비 (DIC) 및 Metamorph 소프트웨어 (분자 ​​장치)에서 실행 이클립스 90i 현미경 (니콘)에 GFP 필터로 찍은되었습니다. DIC와 GFP 이미지 시각화 목적으로 겹쳐 있었다. 이 영상 실험에 사용되는 두 개의 마커 라인이 표시되며A) P SCR : GFP와 B) P WOX5 : GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 식물 성장 조건을. 모종은 phytatrays (A) 또는 수직 위치를 한천 플레이트 (B)에 hydroponically 환경 컨트롤러에서 성장했다. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 플랜트 protoplasts는 GFP를 표현. 형광 현미경 이미지가 차등 간섭 대비 (DIC) 및 Metamorph 소프트웨어 (분자 ​​장치)에서 실행 이클립스 90i 현미경 (니콘)에 GFP 필터로 찍은되었습니다. DIC와 GFP 이미지 시각화 목적으로 겹쳐 있었다. 화살표는 버스트 세포, 세포 파편 및 GFP 양성 원형질을 나타냅니다. 이 흰색 라인 사이의 거리는 50 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. GFP 양성 protoplasts의 형광 활성 세포 분류 야생 유형 (A) P SCR에서 파생 Protoplasts이 :. : GFP (B) 또는 P WOX5 : GFP (C) 마커 라인이 FACSAria (BD)를 분석하고 정렬되었습니다 정의 게이트를 사용하여 대 레드 (20분의 610 NM; Y 축) 형광, 녹색 (X 축 30분의 530 NM)의 dotplot에. 100,000 이벤트가 각각의 음모에 제공됩니다. GFP의 분류 게이트 안에 떨어지는 이벤트가 녹색으로 강조 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 10.000 정렬 세포에서 RNA extractions 대표. 세포 RNA 추출 버퍼 (QIAGEN)에 직접 정렬되었습니다는 RNA는 정화와 2100 Bioanalyzer (애질런트)에 집중, 순도와 무결성을 확인했습니다. 두 마커 라인이 표시됩니다 세는 복제합니다.

<ol><li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+fluorescent+selection+permits+precise%2C+rapid%2C+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li>
<li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
</ol>

Protoplasts는 원칙적으로 유리한 조건을 최적화하는 것은 크게 RNA의 품질과 수량을 향상시키는, 식물 조직의 다양한에서 파생된 수 있습니다. protoplasting 솔루션 및 사용 선택 부화 버퍼 모두이 부분에 영향을 미칠 것이다. 여러 가지 형광 단백질을 사용 외과의 기능에 따라 사용할 수 있습니다, 예를 들어 GFP, RFP, YFP, CFP하거나 많은 변종 및 파생 상품. 마커의 표현이 여기에 같이뿐 아니라 세포 유형의 특정 발기인 또는 확장기 트랩에 의해 구동뿐만 아니라, 여러분이 좋아하는 발기인에 의해 호르몬 응답 합성 리포터 유전자 5 예 수 있습니다. 식물 protoplasts의 듀얼 컬러 외과도 가능합니다. 형광 긍정적인 선택 마커 5 벡터를 사용하여 과도 변환 분석을 수행할 때이 예를 들어, 적용할 수 있습니다. Protopla...

<table><tbody><tr><td>250 &amp;mu;m 나일론 메쉬</td><td>Sefar 여과</td><td>NITEX 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 나일론 메쉬</td><td>Sefar 여과</td><td>NITEX 03-100/47</td><td></td></tr><tr><td>사각형 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>죄송합니다. 번역할 원문 텍스트가 제공되지 않았습니다. 번역이 필요한 영문 텍스트를 입력해 주시면, 요청하신 지침에 따라 전문적인 한국어 과학 학술 번역을 제공해 드리겠습니다.</td><td></td></tr><tr><td>식물 재배 트레이</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1552</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog 기본 배지 (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>2-N-Morpholinoethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>10 M 스톡 용액</td></tr><tr><td>Eclipse 90i 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제 R-10</td><td>야쿠르트 제약</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>야쿠르트 제약</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-만니톨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041</td><td>1 M 스톡 용액</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-메르캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2536</td><td> 1 M 스톡 용액</td></tr><tr><td>궤도 진탕기</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;세포 스트레이너</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>원추형 15ml 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>탁상형 원심분리기</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로원심분리관</td><td>VWR international</td><td>20170-38</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>WT-Ovation Pico RNA 증폭 시스템</td><td>NuGEN</td><td>3300_12</td><td></td></tr><tr><td>FL-Ovation cDNA Biotin Module V2</td><td>NuGEN</td><td>4200_12</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

높은 해상도, 유전자 발현의 세포 유형의 특정 분석은 크게 발달 규제 및 모든 다세포 생물 환경 자극에 반응의 이해를 향상시킵니다. 원위치 하이브리드화와 리포터 유전자의 시각화에서 양적이를 데 사용 제한 범위 수 있지만 높은 해상도 RT - PCR 또는 특정 세포 유형에서 높은 처리량 transcriptome - 다양한 분석 RNA의 격리가 필요한 것입니다. 특정 세포 유형과 후속 형광 활성 세포 정렬 (외과)에 형광 단백질 마커를 표현하는 조직의 세포 분리는 가능한 RNA 추출, cDNA 합성 / 증폭 및 microarray 분석을위한 자료의 충분한 양을를 수집합니다. 셀 유형 - 특정 형광 기자 라인의 광범위한 집합은 식물 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 경우, Arabidopsis thaliana 루트 두 마커 라인이 사용됩니다 : P SCR : GFP (endodermis 및 정지 센터)와 P WOX5 : GFP를 (정지 센터). 모종 많은 (수천) hydroponically 또는 한천 플레이트에 성장하고 추가 분석을 위해 충분한 루트 자료를 얻기 위해 수확하고 있습니다. 식물의 세포 분열은 세포 벽 소화 효소에 의해 이루어진다. 이 절차는 높은 osmolarity - 유도 plasmolysis 및 상용 cellulases을 사용하게, pectinases 및 hemicellulases이 솔루션에 protoplasts을 해제합니다. GFP 양성 세포 외과는 488 nm의 레이저에 의해 흥분 protoplasts의 붉은 방출 스펙트럼 대 녹색의 시각화을 사용합니다. GFP 양성 protoplasts은 빨간색으로 방출하는 녹색들의 증가 비율로 구분할 수 있습니다. Protoplasts는 일반적으로 RNA 추출 버퍼에 직접 정렬하고 나중에 추가 처리를 위해 저장됩니다. 이 기술은 간단하고 실용적인 것으로 드러났습니다. 또한, 그것은 심지어 매우 부족한 세포 유형 (예 : 정지 중심 세포)에 대한, 그것이 transcriptome 분석을 위해 세포의 충분한 숫자를 분리하는 어려움없이 사용할 수 표시됩니다. 마지막으로, Arabidopsis 모종의 성장 설정은 그 (셀 타입 - 특정 biotic 또는 비생물적 스트레스 응답의 분석 예) 셀 정렬하기 전에 식물의 단순한 치료를 가능하게 증명합니다. 잠재적인 보조는 식물 protoplasts의 외과에 대해 설명합니다.

식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기 설립<em&gt; Arabidopsis thaliana</em셀 정렬하기 전에&gt; 모종.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

고해상도의 세포 유형 특이적 유전자 발현 분석은 발달 조절 및 환경적 요인에 대한 반응의 이해를 크게 향상시킵니다...

이 절차는 특정 세포 유형에서 GFP를 발현하는 식물을 이용하며, 형광 활성 세포 분쇄(fluorescence activated cell sorting) 또는 FACS를 통해 이러한 세포를 나머지 식물 세포로부터 분리할 수 있습니다. 이 예시에서는 Arabidopsis의 특정 세포 유형에서 발현되는 두 가지 마커 라인을 사용합니다. Aliana 뿌리 묘는 파이토 트레이(phyto trays) 또는 한천 배지 플레이트에서 배양합니다.뿌리를 수확하여 세포벽 소화 효소로 처리합니다. 1시간 후, 용액을 여과하여 커다란 잔해물을 제거합니다. 그런 다음 용액을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.GFP 양성 프로토플라스트는 이후 FACS를 통해 분리됩니다. 이렇게 분류된 시료는 전장 유전체 전사 프로파일과 같은 세포 유형 특이적 분석에 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕 대학교 생물학과 Ken Birnbaum 연구실의 Basian Barman입니다.오늘은 식물 원형질체(protoplast)의 형광 활성 세포 분리(fluorescence activated cell sorting) 절차를 보여드리겠습니다. 이 예제에서는 Arabidopsis 뿌리의 두 가지 특정 세포 유형을 분리하겠습니다. 저희 연구실에서는 세포 유형 특이적 전사 프로파일을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 야생형 유묘와 세포 유형 특이적으로 GFP가 발현되는 유묘를 배양하십시오. 한 그룹의 유묘에서는 scarecrow 프로모터에 의해 GFP가 발현되어 뿌리 내피와 정지 중심(quiescent center)이 표시됩니다.그리고 또 다른 그룹에서는, root quiescent center를 표시하기 위해 walks five 프로모터가 구동하는 GFP를 사용합니다. 묘는 나일론 필터 위에 놓인 FIA 트레이에서 수경 재배하며, 이를 통해 뿌리가 성장 배지로 자라나게 합니다. 또는, 나일론 메쉬 위에서 수직으로 배치된 1% agar 플레이트 상에서 식물을 재배할 수도 있습니다.필터는 뿌리 수확을 돕는 것 외에도, 묘목을 새로운 피토 트레이(phyto tray)나 한천 배지로 대량 이동시켜 관심 있는 촉매제를 보충할 수 있게 해줍니다. 이는 영양소, 호르몬 또는 스트레스 처리에 대한 세포 유형별 전사 반응을 연구하기 위해 수행될 수 있습니다. 형광 현미경으로 확인하여 형광 마커가 예상대로 발현되었는지 검증하십시오.처리에 따라 마커의 발현 패턴이 변할 수 있으므로, 적용된 처리 조건 하에서 마커의 발현 패턴이 일관된지 확인하십시오. 이어서 원형질체를 수확하고 준비합니다. 먼저 원형질체 용액을 준비하는 것부터 시작하십시오.탈이온수에 1.25% w/v cellulase, 0.3% w/v maser zyme, 0.4 M D-mannitol, 20 mM MES 및 20 mM KCl을 혼합하고, pH 7.5의 1 M tris HCl을 사용하여 pH를 5.7로 조정합니다. 이 용액은 약간 혼탁할 수 있습니다. 그 다음, 용액을 55 °C에서 10분 동안 가열합니다.용액이 투명해지면 실온까지 식힌 후, 0.1% w/v BSA, 10 mM 염화칼슘, 그리고 5 mM beta me 캡토 에탄올을 첨가하십시오. 한 개의 파이토 트레이에서 1주일 된 유묘를 수확하십시오. scarecrow GFP 라인의 경우, 또는 4일 된 5G FP 유묘 8플레이트를 사용하십시오. 메스로 나일론 메쉬에서 뿌리를 긁어낸 다음, 프로토플라스트 용액이 담긴 용기에 넣으십시오.묘목 1500개당 약 10 milliliters의 원형질체 용액을 사용하십시오. 플라스크를 실온에서 75 RPM으로 한 시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 배양 시간을 늘리면 원형질체 수득률은 높아질 수 있으나, 유전자 발현에 미치는 원형질체 자체의 영향 또한 증가할 수 있습니다.원형질체가 방출되었으므로, 40 µm 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 여과하고 원형질체 현탁액을 15 mL 원추형 튜브에 나누어 담습니다. 팩의 막힘을 방지하고 세포 분리에 소요되는 시간을 최소화하기 위해, 잔해물이 너무 많지 않은 깨끗한 원형질체 현탁액을 만드는 것이 중요합니다. 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 상온에서 500 G로 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.원형질체를 얻기 위해 사용한 식물 부위의 구성과 효소 처리 과정 중 생성된 세포 파편의 양에 따라 원심분리 속도가 달라질 수 있음에 유의하십시오. 원심분리 후, 상층액의 대부분을 제거하고 원형질체가 포함된 펠릿을 소량의 잔류 원형질체 용액에 넣어 조심스럽게 재현탁합니다. 마지막으로, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 원형질체 수를 측정하고 밀도를 결정하여 수율을 계산하고 후속 실험 파라미터를 결정합니다.계수 후, 프로토플라스트를 검사하십시오. 무결성, GFP 발현 수준 및 오염된 세포 파편의 함량을 확인하십시오. 그 다음, FACS 단계로 진행하십시오.즉시 FACS를 진행하지 않는 경우, 원형질체(protoplast)를 세척하고 재현탁하여 효소가 첨가되지 않은 proto plating 용액이나 W5 용액과 같은 배양액에 보관할 수 있습니다. 세포 분석기(cell sorter)와 워크스테이션 컴퓨터의 전원을 켭니다.본 실험에서는 Becton Dixon and Company 사에서 제조한 fria를 사용합니다. XPBS를 시스액(sheath fluid)으로 사용하고 유체 스타트업 절차를 실행합니다. 100 micrometer 노즐을 장착하고 시스 압력을 20 PSI로 설정합니다.안정적인 흐름 스트림을 설정하고 드롭 지연(drop delay)을 보정하십시오. 본 절차에서는 보정 과정이 표시되지 않았음에 유의하십시오. ml당 1,000만 개의 세포에 달하는 고농도의 원형질체 현탁액도 성공적으로 분리할 수 있습니다.원형질체(protoplast)의 침전을 방지하기 위해, 팩스의 샘플 교반 옵션을 사용하십시오. 팩스의 막힘 문제가 발생하는 경우, 세 가지 가능한 해결 단계가 있습니다. 우선, 샘플 라인의 역세척(back flush)을 수행하십시오.둘째, 원형질체 현탁액을 희석하여 밀도를 낮춥니다. 셋째, 원심분리 및 재현탁 후 여과 단계를 반복하여 원형질체 용액을 정제합니다. 488 nanometer 레이저로 여기시킨 후 GFP 양성 원형질체와 GFP 음성 원형질체 및 세포 잔해를 구별하는 데 네 가지 매개변수가 사용되며, 전방 산란(forward scatter)은 입자 크기의 지표로, 측방 산란(side scatter)은 입자 과립도의 지표로 활용됩니다.녹색 형광의 측정값으로 530 nanometers에서의 방출을, 적색 스펙트럼 자가형광의 측정값으로 610 nanometers에서의 방출을 사용합니다. 먼저 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter)의 도트 플롯을 설정하십시오. 측정된 이벤트들이 플롯의 중앙에 위치하도록 전압 설정을 적용하십시오.GFP 양성 원형질체(PROTOPLASTS)는 자가형광이 나타나는 이벤트와 비교하여 녹색 방출 대 적색 방출의 비율이 증가하는 것으로 구분할 수 있습니다. 녹색 형광 대 적색 스펙트럼 자가형광을 나타내는 도트 플롯(dot plot)만을 설정하십시오. 측정된 이벤트들이 플롯상에서 단일 대각선 군집을 형성하도록 전압 설정을 적용하십시오.야생형 원형질체 현탁액을 관찰할 때, GFP 양성 원형질체는 야생형 샘플에서는 볼 수 없는 뚜렷한 녹색 형광 이벤트 집단을 생성해야 합니다. 녹색 형광과 적색 스펙트럼 자가형광 사이의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 보정 제약 조건을 설정하십시오. GFP 양성 원형질체 현탁액을 사용할 때, 적절한 보정 제약 조건 설정을 통해 GFP 양성 원형질체를 비-GFP 원형질체 및 파편으로부터 더 잘 분리할 수 있으며, GFP 양성 이벤트를 식별하기 위한 게이트를 설정하십시오.게이트 경계를 설정하는 데 도움을 주기 위해, 소팅 실험을 준비할 때마다 GFP 음성 원형질체(non GFP PROTOPLASTS)를 함께 준비하는 것이 권장됩니다. 마지막으로, 작은 파편들이 분석에서 제외될 수 있도록 전방 산란(forward scatter) 임계값 차단치를 설정하십시오. 전방 산란 대 측방 산란(forward scatter versus side scatter) 플롯에서 GFP 양성 이벤트의 시각화 자료를 통해 임계값을 어디에 설정해야 할지 결정하는 데 도움을 받을 수 있습니다.이 초기 facts 실행에서 설정한 파라미터는 향후 정렬에 재사용할 수 있습니다. 실제 매일의 facts 사용 시에는 약간의 조정이 필요할 것입니다. RNA 추출을 위해 RNA 추출 버퍼가 담긴 수집 튜브를 준비하십시오. 가이드라인으로 정렬 부피 최대 100 µL 당 350 µL의 추출 버퍼를 사용하십시오.20,000회의 분류 이벤트는 약 100 microliters의 총 분류 부피를 생성합니다. FACS 파라미터와 작동 모드가 설정되었고 수집 튜브가 준비되었다면, 프로토플라스트 분류를 시작하고 분류가 완료될 때까지 기다립니다. 세포 현탁액이 상단에 뭉칠 수 있으므로 샘플 수집 튜브를 혼합하십시오. RNA 추출 및 cDNA 증폭 후 마이크로어레이 분석에는 분류된 이벤트 중 500개만으로도 충분히 사용할 수 있습니다.여기서는 RNEZ 마이크로 추출 키트, WT ovation PICO RNA 증폭 시스템 및 fl ovation CD NA 비오틴 모듈 V2를 사용합니다. 다음은 non GFP Scarecrow, GFP 및 W 5G FP 유묘에서 유래한 원형질체에 대한 전형적인 FACS 결과입니다. 각 도트 플롯의 X축은 녹색 형광, Y축은 적색 형광으로 하여 100,000개의 이벤트가 표시되어 있습니다. GFP 분리 게이트 내에 해당하는 이벤트는 녹색으로 강조 표시되었습니다.이것은 뿌리 내피와 정지 중심을 표시하는 scarecrow GFP 또는 뿌리 정지 중심을 표시하는 walks 5G FP를 발현하는 유묘로부터 얻은 전형적인 원형질체 수득량의 요약입니다. 뿌리 정지 중심에는 뿌리 내피에 비해 더 적은 수의 세포가 존재합니다. 따라서, 더 많은 수의 원형질체로 시작했음에도 불구하고, GFP 발현 세포의 수득량은 여기에 표시된 scarecrow GFP 분류에 비해 walks 5G FP 분류에서 더 적게 나타납니다. 여기에는 3회 반복 시료의 전형적인 RNA 추출 결과가 제시되어 있습니다.각 샘플은 10,000개의 이벤트에서 추출한 RNA에 해당합니다. 추출된 RNA를 바이오분석기(bioanalyzer)로 분석하면 상단에는 scarecrow GFP 샘플의 리보솜 피크가, 하단에는 walks 5G FP 샘플의 리보솜 피크가 나타납니다. 추출된 RNA는 마이크로어레이 분석에 추가로 사용할 수 있습니다. log2 발현 수준을 나타낸 이 산점도는 두 반복 실험군 사이의 유사성을 보여줍니다.지금까지 세포 유형별 분석을 위해 식물 원형질체(protoplast)의 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)를 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 기술은 다양한 식물 조직과 종에 적용 가능합니다. 세포 부스러기 함량이 낮고 상태가 양호한 원형질체를 높은 수율로 얻으면, 전사체 분석 및 기타 분석의 후속 결과가 더 개선될 것입니다.또한 분류된 샘플 간의 비교를 위해 식물 재료의 성장 조건을 동일하게 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모두 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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