Name: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 고분화 인간 망막 색소 상피 세포 배양에서 리포푸신 축적과 외절대 소화 용량을 평가하는 새로운 방법을. 이 연구는 노화 관련 망막 퇴행성 질환의 기전 이해와 치료 표적 발굴에 기여합니다.

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이 작업은 유리체-망막 수술 재단(VRSF), 시력을 위한 싸움(FFS) 및 국제 망막 연구 재단(IRRF)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 현재 국립 안과 연구소(National Eye Institute, EY033420)의 K08 보조금으로 지원되고 있습니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry AMD)와 바바라 던(Barbara Dunn), 디 앤 딕슨 브라운(Dee & Dickson Brown)의 개인 기부자들의 지원이 더욱 지원된다.

망막 색소 상피 식세포작용 및 리포푸신 축적 정량화

저자는 공개 할 것이 없습니다.

RPE 리포푸신은 수십 년 동안 연구되어 왔지만 그 독성은 2,9,16,42에 대해 논의되고 있습니다. 동물 모델11에서 리포푸신의 독성에 대한 모호성을 감안할 때, 인간 RPE를 사용하는 시험관 내 모델은 가치가 있다. 다양한 시험관 내 리포푸신 축적 모델이 설명되었지만 OS 공급과 고도로 성숙하고 차별화된 인간 RPE 배양을 모두 활용한 모델은 없습니다. 이 조합은 OS 공급이 생체 내에서 리포푸신 축적 방법을 요약하고 고도로 성숙한 인간 RPE 배양이 생체 내에서 RPE 거동을 가장 잘 복제하기 때문에 이상적인 모델을 나타냅니다. 흥미롭게도, 고도로 분화된 hfRPE 배양을 이용할 때, 반복...

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편의 일일 흡수 및 분해를 포함하여 위에 있는 광수용체에 대한 중요한 지원을 제공합니다(이 프로토콜 전체에서 약어 OS는 전체 외부 세그먼트가 아닌 OS 팁 또는 단편을 나타냄). 유사분열 후 RPE의 이러한 일일 섭취는 결국 포골리소좀 용량에 과부하를 일으키고 리포푸신이라고 하는 소화되지 않는 자가형광 세포 내 물질의 축적으로 이어집니다. 흥미롭게도, 여러 연구에서 RPE 리포푸신이 OS 식균작용 없이 축적될 수 있음이 입증되었습니다 1,2. 리포푸신은 시각 주기 레티노이드에서 파생된 가교 부가물을 포함하여 많은 성분을 가지고 있으며 80세 이상의 경우 RPE 세포 부피의 거의 20%를 차지할 수 있습니다3.
리포푸신이 독성이 있는지 여부는 뜨거운 논쟁거리입니다. 스타가르트병은 ABCA4의 돌연변이가 광수용체 외부 세그먼트 내에 포함된 시각 주기 레티노이드의 부적절한 처리를 유발하는 광수용체 및 RPE의 상염색체 열성 변성입니다. 부적절한 레티노이드 처리는 비스-레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)을 포함한 비스-레티노이드 종의 비정상적인 가교 결합 및 형성을 초래합니다. 연구는 A2E 독성에 대한 여러 메커니즘을 입증했습니다 4,5. 리포푸신은 임상 영상 촬영 중 안저 자가형광 신호에 기여하며, Stargardt의 환자와 동물 모델 모두 망막 변성 전에 증가된 안저 자가형광을 나타내며, 이는 리포푸신 수치와 독성 사이의 상관관계를 시사합니다 6,7. 그러나 나이가 들어감에 따라 리포푸신은 RPE 퇴행을 유발하지 않고 모든 인간에게 축적됩니다. 또한, RPE 변성이 노인 환자에서만 발생하는 연령 관련 황반변성(AMD)의 경우, 초기 및 중간 형태의 황반변성을 가진 사람들은 연령이 일치하지 않는 사람보다 안저 자가형광 신호가 적다8. 이러한 임상 소견은 조직학적 수준에서도 검증되었습니다 9,10.
RPE 리포푸신 축적의 동물 모델은 또한 리포푸신 독성에 대해 약간의 모호성을 남겼습니다. ABCA4 녹아웃 마우스는 착색된 배경에서는 망막 변성을 나타내지 않는 반면, 알비노 배경에서는 또는 청색광에 노출될 때 나타납니다11,12. 또한, ABCA4 녹아웃을 통해 유도된 리포푸신의 독성은 AMD13에서 볼 수 있듯이 자연 노화와 함께 발생하는 더 천천히 축적되는 리포푸신과 다를 수 있습니다.
리포푸신 축적의 시험관 내 모델은 리포푸신 축적이 RPE 건강에 미치는 영향을 연구하는 대안을 제공합니다. 이러한 모델은 단일 레티노이드 성분 공급에서 OS 공급에 이르기까지 리포푸신 성분을 조작할 수 있게 하고 동물 RPE가 아닌 인간에서 연구할 수 있도록 합니다. 지난 수십 년 동안 배양에서 RPE 리포푸신을 모델링하기 위해 여러 방법이 개발되었습니다. 다른 그룹과 함께, Boulton 박사의 그룹은 4세에서 85세 사이의 기증자로부터 4-7개의 인간 일차 RPE 세포를 통과하여 최대 3개월 동안 매일 소 OS를 공급했습니다14. 대안적으로, 자가포식의 억제는 또한 계대 3 내지 7 일차 인간 RPE 배양물에서 리포푸신 축적을 유도하였다15. 그러나, 고도로 분화된 계대 1, 1차 인간 산전 RPE(hfRPE) 배양물에서 치사율 이하의 리소좀 억제는 매일 OS를 반복적으로 첨가했음에도 불구하고 리포푸신을 유도하는 데 실패했다16.
보다 환원주의적인 접근 방식으로, 다른 사람들은 단일 리포푸신 성분, 특히 비스-레티노이드 A2E 4,17을 배양물에 공급했습니다. 이러한 연구는 리소좀 콜레스테롤과 세라마이드 항상성 등을 내포하는 개별 리포푸신 성분에 대한 잠재적인 직접적인 독성 기전을 정의한다는 점에서 가치가 있다18. 동시에, A2E19의 독성에 대한 논쟁이 있으며, 이를 세포에 직접 공급하는 것은 광수용체 OS의 식균 작용을 포함하는 리포푸신 축적의 전형적인 경로를 우회합니다. 리포푸신의 모든 성분을 RPE 배양물에 전달하기 위한 시도로, Boulton과 Marshall은 인간의 눈에서 리포푸신을 정제하여 태아 및 노인 인간 공여자로부터 유래한 인간 일차 RPE 배양물 4-7계대에 공급하였다20. 혁신적이기는 하지만 이 방법은 반복 실험을 위한 제한된 리포푸신 공급원을 나타냅니다.
RPE 배양에 OS를 반복적으로 공급하면 많은 시스템에서 리포푸신이 생성되지만, 고도로 분화된 1차 RPE 배양에서는 리포푸신이 생성되지 않습니다16. 광산화 OS는 생체 내에서 리포푸신 형성 중에 자연적으로 발생하는 비스-레티노이드 형성과 같은 가교 반응을 유도합니다. 이는 RPE 배양 시스템에서 리포푸신 유사 과립 형성을 가속화할 수 있으며, 심지어 고도로 분화되고 리포푸신 축적에 내성이 있는 시스템에서도 가속화될 수 있다16. 여기서, 고도로 분화된 hfRPE 및 인간 iPSC-RPE에서 리포푸신 유사 과립 축적을 유도하는 방법이 도입되며, 이는 Wihlmark의 공개된 프로토콜21에서 변형됩니다. 이 방법은 생체 내에서 리포푸시노생성에 대해 발생하는 것과 동일한 공급원(광수용체 OS) 및 경로(phagolysososomal OS 흡수)를 사용하여 리포푸신 유사 과립을 유도하는 이점이 있습니다. 또한, 생체 내에서 인간 RPE를 복제하기 위해 여러 연구에서 고도로 차별화되고 검증된 인간 RPE 배양에서 수행됩니다 22,23,24. 이러한 리포푸신 유사 과립은 소화되지 않는 자가형광 물질(UAM)이라고 하며, 이 프로토콜에서 UAM을 생체 내 리포푸신과 비교하는 데이터 및 논의를 제공합니다. 고도로 분화된 인간 RPE에서 UAM이 함유된 배양을 구축하고 평가하는 방법과 함께 RPE OS 식균 작용을 평가하는 업데이트된 방법도 도입되었습니다. 웨스턴 블로팅, 면역세포화학 및 FACS25,26,27을 포함하여 OS 식균 작용을 정량화하기 위한 여러 가지 우수한 펄스 추적 방법이 도입되었습니다. 그러나 OS 펄스 추적 초기에는 OS 활용률이 저하되는 조건이 내재화된 OS의 급격한 성능 저하를 촉진하는 조건과 혼동될 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 RPE에 의해 완전히 사용/저하된 도입된 OS의 총량("총 소비 용량")을 측정하여 이러한 모호성을 제거하는 데 도움이 됩니다. "총 소비 용량" 방법을 사용한 OS 식균 작용 속도에 대한 영향을 포함하여 이러한 프로토콜을 활용한 리포푸신 독성에 대한 통찰력은 생체 내에서 리포푸신의 독성을 밝히는 데 사용될 것으로 예상됩니다.

<table><tbody><tr><td>100mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>#353003</td><td>다른 사람들도</td></tr><tr><td>작동합니다 24-well Transwells</td><td>Corning</td><td>#3470</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LC3 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#4801S</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>Anti-rhodopsin 항체 1D4</td><td>Abcam</td><td>#5417</td><td>1:1000 희석. 에피토프는 C 터미널입니다.</td></tr><tr><td>항로돕신 항체 4D2</td><td>EnCor Biotech</td><td>MCA-B630</td><td>웨스턴 블롯에 대한 1:5000 희석, 면역 염색에 대한 1:1000 희석. 에피토프는 N-터미널입니다.</td></tr><tr><td>자가형광 소광제</td><td>Biotium</td><td>#23007</td><td>TrueBlack Lipofuscin 자가형광 소광제</td></tr><tr><td>소광제 Vector</td><td>Laboratories</td><td>SP-8400</td><td>Vector TrueVIEW 자가형광 소광제 키트</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤 소광효소&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>From A12216 키트</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica Stellaris SP8 with FALCON 모듈</td><td></td></tr><tr><td>Dark-adapted bovine retinas</td><td>W. L. Lawson Company</td><td>Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)</td><td>연락처 정보 : https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com</td></tr><tr><td>Filipin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4767</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Thermo Fisher</td><td>Attune NxT</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>BD</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>핸드헬드 UV 라이트&nbsp;</td><td>Analytik Jena US</td><td>UVGL-55</td><td></td></tr><tr><td>Human MFG-E8</td><td>Sino Biological</td><td>10853-H08B</td><td></td></tr><tr><td>Human purified Protein S</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HPS</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>J60015-AD</td><td></td></tr><tr><td>LDH assay</td><td>Promega</td><td>J2380</td><td>LDH-Glo 세포 독성 분석</td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Prolong Gold antifade reagent</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#72485</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드</td><td>Tekdon</td><td>맞춤형</td><td>사양: 다음 "컷아웃"이 있는 PTFE 마스크 -&nbsp; 각각 17mm x 9mm 크기의 3개의 유리 직사각형, 17mm 면이 슬라이드 상단에서 4mm, 슬라이드 하단에서 4mm가 되도록 방향, 25mm x 75mm의 표준 현미경 슬라이드를 가정합니다. 각 사각형은 다른 사각형 및 슬라이드 가장자리에서 최소 6mm 떨어져 있습니다. 슬라이드에 PTFE 마스크를 인쇄하고 한쪽 면에 젖빛 유리가 있는 슬라이드에 인쇄하여 슬라이드에 라벨을 붙일 수 있도록 합니다.</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>#5872</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000122 RC DC 단백질 분석</td><td></td></tr><tr><td>TEER 전극</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM3</td><td></td></tr><tr><td>자외선 가교제 장치</td><td>Analytik Jena US</td><td>UVP CL-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

improved lipofuscin models and quantification of outer segment phagocytosis capacity in highly polarized human retinal pigment epithelial cultures

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

망막 색소 상피(RPE)에 의한 광수용체 외부 세그먼트의 일일 식균 작용은 리포푸신(lipofuscin)이라고 하는 세포 내 노화 색소의 축적에 기여합니다. 리포푸신의 독성은 가장 흔한 유전성 망막변성인 스타가르트병에서 잘 알려져 있지만, 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)에서 더 논란의 여지가 있습니다. 인간에서 리포푸신 독성을 결정하는 것은 어려웠으며 Stargardt의 동물 모델은 독성이 제한적이었습니다. 따라서 생체 내에서 인간 RPE를 모방하는 시험관 내 모델은 리포푸신 생성, 제거 및 독성을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 현재까지 대부분의 세포 배양 리포푸신 모델은 세포주에 있었거나 전체 광수용체 외부 세그먼트의 단편/팁이 아닌 복합 리포푸신 혼합물의 단일 성분을 RPE에 공급하여 보다 완전하고 생리학적인 리포푸신 모델을 생성했습니다. 여기에 기술된 것은 고도로 분화된 일차 인간 산전 RPE(hfRPE) 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 RPE에서 리포푸신 유사 물질(소화되지 않는 자가형광 물질, 또는 UAM으로 명명됨)의 축적을 유도하는 방법이다. 식균 작용을 통해 RPE에 의해 흡수된 자외선 처리된 OS 단편의 반복 공급에 의해 배양에 축적된 UAM. UAM이 생체 내에서 리포푸신과 유사하고 다른 주요 방법도 논의됩니다. 이 리포푸신 유사 축적 모델과 함께 UAM 과립의 광범위한 자가형광 스펙트럼을 동시 항체 염색과 구별하는 이미징 방법이 도입되었습니다. 마지막으로, RPE 식균 작용 능력에 대한 UAM의 영향을 평가하기 위해 외부 세그먼트 조각/팁 흡수 및 분해를 정량화하는 새로운 방법이 도입되었습니다. "총 소비 용량"이라고 하는 이 방법은 고전적인 외부 세그먼트 "펄스 추적" 분석에 내재된 RPE 식균 작용 용량의 잠재적인 오해를 극복합니다. 여기에 소개된 모델과 기술은 리포푸신 생성 및 제거 경로와 추정 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

OS의 광산화를 위한 설정은 그림 1Ai에 나와 있습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드는 슬라이드의 나머지 부분에 퍼지지 않고 열린 직사각형당 많은 양의 OS 용액을 로드할 수 있습니다. OS가 있는 슬라이드는 뚜껑이 벗겨진 멸균 페트리 접시 안에 들어 있으며 UV 램프는 그림 1Aii와 같이 슬라이드 위에 놓입니다. 대안적으로, 슬라이드는 도 1Aiii에 도시된 바와 같이 UV 가교결합제 장치에 배치될 수 있다. 광산화 후 OS 자가형광은 현미경과 유세포 분석으로 평가한 바와 같이 크게 증가합니다(그림 1B). 광산화 후 단백질 가교 정도는 쿠마시 염색을 사용하여 SDS-PAGE로 평가할 수 있으며, 이는 우성 단백질 밴드(단량체 로돕신)가 고차 응집체 및 도말로 전환되는 것으로 표시됩니다(<strong c...

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

리포푸신은 노화와 함께 RPE에 보편적으로 축적되지만 독성을 식별하기는 어려웠습니다. 여기에서 우리는 RPE 생리학에 대한 리포푸신의 효과를 식별하는 데 도움이 되도록 고도로 분극되고 성숙한 RPE 배양에서 리포푸신과 유사한 축적을 개발할 수 있는 프로토콜을 개발합니다. 인간의 리포푸신 독성을 연구하는 것은 RPE가 죽으면서 리포푸신이 감소한다는 사실에 의해 혼란스럽습니다.리포푸신 독성의 동물 모델은 매우 이질적인 결과를 가져왔다. 우리는 리포푸신 독성 연구를 용이하게 하기 위해 리포푸신 유사 물질 축적의 시험관 내 모델을 신중하게 만들었습니다. 우리 모델의 성공의 열쇠는 생체 내에서 리포푸신을 유발하는 것과 동일한 과정, 즉 광수용체 외부 세그먼트의 식균 작용을 통해 리포푸신 생성을 유도하면서 고도로 분화된 배양을 유지하는 것입니다.당사의 체외 프로토콜은 생체 내에서 RPE를 충실하게 모방하기 위해 고도로 차별화된 RPE 배양에 리포푸신 유사 물질이 축적된다는 점에서 독특합니다. 이러한 상황에서 우리는 RPE 배양이 리포푸신 축적 및 리포푸신의 독성 효과에 대해 매우 내성이 있음을 발견했습니다. 또한 RPE 배양에서 리포푸신 유사 축적에 의해 유도된 표현형을 분석하는 과정에서 총 소비 용량이라는 새로운 유형의 식균 작용 분석을 만들었습니다.이 분석을 통해 우리는 고전적인 펄스 체이스 식균 작용 분석과 함께 제공되는 혼란스러운 해석을 피하면서 외부 세그먼트를 식균하는 RPE의 전체 용량을 결정할 수 있습니다. 우리는 RPE 스트레스 요인이 일반적으로 불활성 리포푸신을 RPE 세포 사멸에서 보다 병리학적인 역할로 이끌 수 있는 것을 더 잘 이해하기 위해 이 리포푸신 유사 물질 축적 모델을 활용하게 된 것을 기쁘게 생각합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기사에서는 균질화 및 자당 구배 원심분리를 사용하여 돼지/소 망막에서 초원심분리를 통해 광수용체 외분절 조각(POS)을 정제하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 -80°C에서 보관할 수 있는 라벨링 또는 라벨링되지 않은 POS 부분 표본을 대량으로 준비할 수 있습니다.

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

망막 색소 상피(RPE)는 리포푸신으로 축적된 시각 주기 부산물을 재생하여 감각 망막을 지원합니다. 이러한 제품은 자가 형광성이며 in vivo에서 정성적으로 이미지화할 수 있습니다. 여기에서는 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 RPE 리포푸신을 정량적으로 이미지화하는 방법을 설명합니다.

망막 질환의 평가에 대한 정량적 안저 자기 형광

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

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Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures (동영상) | JoVE Journal

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