Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Qitao Zhang; Gillian Autterson; Jason  M. L. Miller

doi:10.3791/65242

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Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

JoVE 신문
생물학

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JoVE 신문 생물학

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

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10:39 min

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April 14, 2023

DOI:

10.3791/65242-v

DOI:

10.3791/65242-v

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10:39 min

April 14, 2023

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Qitao Zhang¹, Gillian Autterson¹, Jason M. L. Miller^1,2

¹Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor ²Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

내레이션 대본

리포푸신은 노화와 함께 RPE에 보편적으로 축적되지만 독성을 식별하기는 어려웠습니다. 여기에서 우리는 RPE 생리학에 대한 리포푸신의 효과를 식별하는 데 도움이 되도록 고도로 분극되고 성숙한 RPE 배양에서 리포푸신과 유사한 축적을 개발할 수 있는 프로토콜을 개발합니다. 인간의 리포푸신 독성을 연구하는 것은 RPE가 죽으면서 리포푸신이 감소한다는 사실에 의해 혼란스럽습니다.

리포푸신 독성의 동물 모델은 매우 이질적인 결과를 가져왔다. 우리는 리포푸신 독성 연구를 용이하게 하기 위해 리포푸신 유사 물질 축적의 시험관 내 모델을 신중하게 만들었습니다. 우리 모델의 성공의 열쇠는 생체 내에서 리포푸신을 유발하는 것과 동일한 과정, 즉 광수용체 외부 세그먼트의 식균 작용을 통해 리포푸신 생성을 유도하면서 고도로 분화된 배양을 유지하는 것입니다.

당사의 체외 프로토콜은 생체 내에서 RPE를 충실하게 모방하기 위해 고도로 차별화된 RPE 배양에 리포푸신 유사 물질이 축적된다는 점에서 독특합니다. 이러한 상황에서 우리는 RPE 배양이 리포푸신 축적 및 리포푸신의 독성 효과에 대해 매우 내성이 있음을 발견했습니다. 또한 RPE 배양에서 리포푸신 유사 축적에 의해 유도된 표현형을 분석하는 과정에서 총 소비 용량이라는 새로운 유형의 식균 작용 분석을 만들었습니다.

이 분석을 통해 우리는 고전적인 펄스 체이스 식균 작용 분석과 함께 제공되는 혼란스러운 해석을 피하면서 외부 세그먼트를 식균하는 RPE의 전체 용량을 결정할 수 있습니다. 우리는 RPE 스트레스 요인이 일반적으로 불활성 리포푸신을 RPE 세포 사멸에서 보다 병리학적인 역할로 이끌 수 있는 것을 더 잘 이해하기 위해 이 리포푸신 유사 물질 축적 모델을 활용하게 된 것을 기쁘게 생각합니다.

Summary

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.