편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

이 절차는 편광 멤브레인 이동에 대한 small GTP ACE의 효과를 분석합니다. 먼저, 작은 GTP ACE와 리포터 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드를 편광 세포의 세포핵에 co-inject합니다. 그런 다음 세포질에 축적된 작은 GTPA가 세포질에 축적되는 동안 소포체 또는 TGN에서 리포터 단백질을 정지시킬 온도에서 DNA를 발현하고 추가 단백질 합성을 방지하기 위해 cyclo heide가 있는 세포 표면으로 리포터 단백질을 추적합니다.

마지막으로, 면역형광 분석을 위해 세포 표면의 리포터 단백질에 라벨을 붙입니다. 이 분석에서 얻은 결과를 통해 컨포칼 현미경을 통해 표면 국소화의 변화를 시각화할 수 있습니다. trans transfect와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 마이크로 주입으로 달성된 짧은 과발현 시간 동안 2차 효과가 최소화되어 관심 단백질의 1차 효과를 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 작은 gtpa가 편광 멤브레인 이동을 어떻게 조절하는지와 같은 세포 극성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성공적인 미세주입에 필요한 개별 단계를 시각적 도움 없이는 설명하기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다: 제조업체의 프로토콜에 따라 Sigma Aldrich 내독소가 없는 맥시 준비 키트로 내독소가 없는 혈장 DNA를 분리합니다. 이 실험에서는 0.4마이크로미터 공극 크기의 투명 12mm 트랜스웰 필터 3개를 사용하여 배양합니다.

이 셀은 5번째 MDCK 셀 중 10개의 4배를 각 필터에 장착합니다. 이틀 후, 현미경으로 배양물을 검사하여 세포가 닫힌 단층에서 성장하고 있는지 확인합니다. 미세 주입용.

미세주입 당일, 5리터 MM 성장 배지와 15mm 하이로 구성된 360 x 15mm 플레이트를 준비하여 섭씨 39도의 인큐베이터에 넣습니다. 또한 1밀리리터 MEM 성장 배지와 50밀리몰 하이, 밀리리터당 0.1밀리그램의 시클로헥시미드로 구성된 12웰 플레이트 3개를 준비하여 섭씨 31도의 인큐베이터에 넣습니다. 미세 주입 현미경을 켜고, 가열된 스테이지 10 x 및 32 x 대물렌즈와 einor 펨토 제트가 있는 도립 현미경처럼 설정합니다.

가열된 스테이지를 섭씨 39도로 설정합니다. 또한 에어 테이블에 질소 가스 탱크 공급을 엽니다. 이제 DNA를 여과 된 물로 밀리리터 당 0.2 밀리그램의 최종 농도로 희석하십시오.

그런 다음 13, 000 RPM의 einor 마이크로 원심 분리기에서 30 분 동안 DNA를 회전시킵니다. 상단 부분을 제거하고 새 튜브에 넣습니다. 다음으로, 수술용 블레이드를 사용하여 배양 접시에서 첫 번째 필터를 꺼내 MDCK 세포를 준비하고, 필터 홀더에서 필터를 잘라낸 다음 섭씨 39도의 가온 MEM 성장 배지 5ml와 50밀리몰 하이가 포함된 준비된 60 x 15mm 플레이트에 넣습니다.

배양 플레이트에서 필터의 무게를 줄이려면 수술용 블레이드를 필터 중앙에 놓고 배양 플레이트를 현미경의 가열된 스테이지로 옮깁니다. 2-3마이크로리터의 희석된 DNA를 마이크로주삿바늘에 넣습니다. 바늘의 보호 덮개를 비틀어 바닥에 떨어뜨립니다.

바늘을 홀더에 넣으려면 주입의 메뉴 키를 누르고 밸브가 차단되었는지 확인하십시오. 바늘을 홀더에 나사로 고정합니다. 바늘을 너무 세게 조이지 않도록 주의하십시오.

파손될 수 있으므로 메뉴 키를 다시 누르십시오. 따라서 적용된 보상 압력은 미세 주입 절차 중에 매체가 바늘로 빨려 들어가는 것을 방지합니다. 마지막으로 조이스틱을 탭하여 저장된 원점 복귀를 지우고 바늘을 세포 위로 내립니다.

10 x 대물렌즈를 사용하여 바늘을 액체 위의 광선으로 가져옵니다. 이제 세포에 초점을 맞춥니다. 초점 휠을 180도 위로 돌려 다시 초점을 맞추고 바늘을 찾습니다.

바늘을 천천히 움직여 초점을 맞춥니다. 그런 다음 다시 초점을 흐리게 합니다. 세포에 다시 초점을 맞추기 위해 노력하고 있습니다.

바늘에 다시 초점을 맞춥니다. 바늘이 매체 표면에 닿을 때까지 반복하여 후광이 관찰됩니다. 세포에 초점이 맞춰진 지점에 계속 도달하지만 바늘은 여전히 초점면에서 흐릿합니다.

이제 32 x 목표로 전환하고 코스 설정을 찾으십시오. 바늘 끝으로 정점 막을 만지고 약 10마이크로미터를 빼서 Z 한계를 설정합니다. 핵은 정점막 아래 약 10마이크로미터에 놓여 있습니다.

이제 가능한 한 빨리 바늘을 초점면에서 몇 미크론 밖으로 가져옵니다. 핵 위의 바늘로 조준하고 조이스틱의 주입 버튼을 눌렀다 놓습니다. 95PSI에서 시작하여 올바른 사출 압력을 찾으십시오.

압력이 너무 높으면 세포가 폭발합니다. 압력이 너무 낮으면 흰색 점이 지속되지만 다른 작업은 발생하지 않습니다. 셀 크기 변화 없이 상 변화를 포함하는 성공적인 주입을 수행합니다.

세포에 있는 수술 블레이드의 구멍 안에 100-500개의 세포를 주입합니다. 그런 다음 배양 접시와 수술용 칼날이 있는 세포를 섭씨 39도의 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 1밀리리터, MEM 플러스 50밀리몰, 밀리리터당 0.1밀리그램의 준비된 12웰 플레이트로 세포를 옮기고 섭씨 31도에서 2시간 동안 배양합니다.

발현된 GFP 신호의 표백을 방지하려면 표면 염색을 위한 모든 후속 절차 중에 알루미늄 호일로 덮어 시편을 빛으로부터 보호하십시오. 배양 접시에 담긴 세포를 얼음 위의 금속판에 놓고 씻습니다. 얼음을 차갑게 한 PBS plus plus를 사용하면 얼음 피펫의 금속판에 깨끗한 파라폼 조각을 놓고 관심 단백질의 ecto domain을 인식하는 항체를 30마이크로리터 방울 떨어뜨립니다.

이제 세포가 들어있는 필터를 거꾸로 드롭 위에 놓고 필터 뒷면에 항체 몇 방울을 추가합니다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS plus plus로 세포를 세 번 세척하고 실온에서 15분 동안 3% 파라폼 알데히드로 고정합니다.

PBS plus plus로 세포를 한 번 세척하고 PBS plus plus에서 5분 동안 평형을 이룹니다. 이제 투과성 완충액을 차단하여 세포를 배양합니다. 실온에서 1시간 배양하고 BPB에서 1-200으로 1차 항체를 희석하여 발현된 RAB GTP ACE 원심분리기를 10분 동안 검출합니다.13, 000 RPM 피펫에서 30 마이크로리터의 항체 용액을 습식 챔버에 놓인 깨끗한 매개변수에 넣습니다.

필터의 세포를 거꾸로 항체 방울에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 실온에서 셀을 다시 오른쪽이 위로 향하게 하여 12로 놓습니다. 웰 플레이트를 만들고 세척 단계를 포함하여 적절한 2차 항체를 사용하여 배양 후 실온에서 BPB로 30분에 걸쳐 5회 세척합니다.

필터의 세포를 탈이온수에 세 번 담그고 오른쪽을 위로 향하게 하여 10마이크로리터 마운트의 마이크로 슬라이드에 놓고 그 위에 18 x 18mm 마이크로 커버 유리를 놓고 페이셜 티슈를 사용하여 커버 슬립을 셀에 부드럽게 누릅니다. 마지막으로 V-S-V-G-T-S-O 45 GFP를 인코딩하는 플라스미드의 모의 주입에서 매니큐어로 밀봉합니다. 단백질은 잘 분극되지 않은 세포에서 적색 표면 염색으로 판단되는 대로 잘 분극된 MDCK 세포의 기저측 표면으로 전달됩니다.

GFP 융합 단백질의 일부는 정점 막으로 전달됩니다. 대조군 표본이 이와 같으면 데이터를 신뢰할 수 없으며 더 나은 편광 세포로 실험을 반복해야 합니다. GFP 융합에 표현된 모든 것이 섭씨 31도의 추격전 동안 기저외막으로 전달되는 것은 아니며, 총 단백질에 대한 광범위한 세포 내 녹색 신호에 의해 입증되면 이 기술은 개발 후 약 10-12시간이 소요됩니다.

이 기술은 멤브레인 트래매킹 분야의 연구자들이 편광된 상피 세포에서 조절 단백질을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세 주입 기술을 사용하여 편광 상피 세포에서 단백질을 발현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.