Name: 편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 편광 상피 세포에서 microinjection을 이용한 소형 GTPases 기능 분석 방법을. 이 기술은 단백질의 1차적 효과를 연구하며 2차적 효과를 최소화하여 막 수송 메커니즘을 정밀하게 규명합니다.

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이 작품은 H. Fölsch에 건강 (GM070736)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다. SF 앙은 A * STAR 대학원 장학금 수상에 의해 지원되었고, RS 캉은 질병 교육 프로그램의 세포 및 분자 기초 (GM8061)에 의해 지원되었다

1. 플라스미드 DNA의 분리 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 내독소 무료로 DNA를 준비하는 시그마 - 알드리치 내독소 무료 maxiprep 키트를 사용하십시오. 그것이 안정적으로 DNA의 준비로부터 endotoxins를 제거하기 때문에이 키트는 우리를 위해 작동합니다. 세포 핵에 DNA을 주사 Endotoxins는 세포 죽음을 초래합니다. </li><li> 분리된 DNA, 소용돌이 및 Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 1 분 스핀 100 μl 페놀 / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1)을 추가합니다. 새로운 튜브로 상부 급수 단계를 전송 100 μl 클로로포름 / isoamylalcohol (24:1), 위와 같이 소용돌이와 스핀을 추가합니다. 새로운 튜브로 DNA를 포함하는 상부 물 위상을 전송합니다. 이 단계는 microinjection 바늘의 막히는 것을 방지 DNA에서 어떤 단백질을 제거하는 필요합니다. </li><li> 300 MM X 2 권 100 % 에탄올의 최종 농도 나 아세테이트 (산도 6.0)을 추가하여 DNA를 침전. 하룻밤 -20 ° C에서 알을 품다. Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 20 분에 대한 DNA를 스핀, 70 % 에탄올로 한 번 씻어, 300 μl 내독소 - 무료 물 (시그마 - 알드리치)에 resuspend. </li><li> DNA 농도를 결정합니다. 일반적인 DNA의 농도는 1에서 5 μg / μl 범위. </li></ol> 2. MDCK 세포의 문화 <ol><li> MDCK 세포를 분리. 세포 및 종자 4 카운트 취소 12 mm 트랜 스웰 필터 (0.4 μm의 기공 크기, 코닝 코스타, 3460)로 X 10 5 세포. 모의 분사 제어 및 종자 세 필터를 필요 두 개의 서로 다른 돌연변이 RAB의 단백질을 포함하는 실험. </li><li> 이 MM L - 글루타민, 37에서 0.1 MG / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 7 % (권 / 권) 태아 소 혈청 (= 멤 성장 미디어) ° C와 5% CO 2. 함께 멤 매체 문화 MDCK 세포 </li><li> 매일 basolateral 챔버에서 미디어를 변경합니다. 그것이 동물의 상피 세포의 상황을 모방하기 때문에 이것은 편광 과정을 보조. </li><li> 세포가 닫힌 monolayer에 성장하고 있는지 여부를 현미경 2 일 이후 시딩 체크. 당신이 monolayer에 구멍을 검색할 수없는 경우, 3 일에 실험을 수행합니다. 구멍이 아직있다면, 하루 4 실험을 수행합니다. </li></ol> 3. Microinjection 절차 및 사후 분사 Incubations <ol><li> 실험 당일 39 ° C 배양기에 5 ML의 멤 성장 미디어 플러스 각 필터 및 장소에 대해 하나 60 X 15mm 판 50 MM HEPES를 준비합니다. 또한, 1 ML 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES 및 0.1 MG / ML cycloheximide 당 필터, 그리고 31 ° C 배양기에 장소 12 잘 플레이트 잘 하나가 설정할 수 있습니다. </li><li> 귀하의 microinjection 현미경의 전원을 켜고 39의 가열 무대 ° C. 우리는 열띤 무대로 바뀌 현미경 (Axiovert 200, 칼 자이스 혈구 MicroImaging 주식 회사), 10X 32X과 목표, 그리고 Eppendorf Femtojet (Injectman NI2)를 사용합니다. 마지막으로, 질소와 공기 테이블을 공급 질소 가스 탱크를 엽니다. </li><li> 100 μl - 10의 총 볼륨의 0.2 MG / ML의 최종 농도 필터링된 물 (0.2 μm의 필터를 사용하여)와 DNA를 희석. 그 후, 30 분 13,000 rpm으로 Eppendorf의 microcentrifuge에서 DNA를 스핀. 새로운 튜브에 최고 부분과 장소를 제거합니다. 이 단계는 microinjection 바늘로 희석 DNA를 로드할 때 정확하게 "깨끗한"DNA를 로드할 수있는 처​​리됩니다. 당신의 DNA는 지금 microinjection 준비가되었습니다. </li><li> 문화 요리의 첫 번째 필터 밖으로 복용하여 세포를 준비합니다. 외과 블레이드 (깃털 외과 블레이드, 스테인레스 스틸, 아니 11), 5 ML, 39 ° C 따뜻한 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES (60 X 15mm 판)에 필터 홀더와 장소에서 필터를 잘라 함께. 당신이 그것을 밖으로 절단에 사용되는 수술 칼날과 문화 접시에있는 필터를 아래로 무게. 수술 칼날의 구멍이 필터의 중앙을 둘러싸는 것을 필터 등에 놓으십시오. 현미경의 온수 무대에 여러분의 문화 접시를 놓습니다. </li><li> microinjection 니들 (Femtotip II, Eppendorf, 930,000,043)에 희석 DNA (이 경우 plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP에서 = 모의 분사 제어)로부터 2-3 μl를로드, 바늘의 보호 커버를 비틀어하고 바닥에 떨어뜨 리다 . 이제 바늘의 소유자로 실수를 할 준비가되어 있습니다. 이렇게하려면 injectman의 메뉴 키를 눌러하여 밸브가 종료되었는지 확인하십시오. 의 홀더에 바늘 나사, 그 파손을 초래할 수 있으므로 너무 단단히 바늘에 나사하지 조심하십시오. 이제 다시 메뉴 키를 적용 P C는 microinjeciton 절차 동안 바늘로 빨려에서 미디어를 방지할 수 있습니다. 마지막으로 저장된 유도를 삭제하여 조이스틱을 누릅니다. </li><li> 세포에 바늘을 줄이려면 10X 목적을 사용하여 액체 위의 광선에 바늘을 가지고. 지금 세포에 초점 휠에게 180 선회 최대로 다시 포커스를 가지고 집중하고, 바늘을 찾으십시오. 그 후, 천천히 (다시 초점으로 세포를 데리고 나갈 수) 다시 초점 밖으로 내보일 후, 초점에 바늘을 이동에 대한에 바늘을 가지고다시 cus. 니들이 언론의 표면을 건드리면 때까지 반복하는 지점이 표시됩니다 모든 후광입니다. 당신이 세포가 초점에되는 지점에 도달하지만 바늘이 (초점 비행기 즉, 밖으로) 여전히 32X 목표 및 고급 설정 변경 굵은 퍼지 경우. </li><li> 바늘 끝과 혀끝의 멤브레인를 감동 핵으로 10 μm의 약 공제한 혀끝의 막 아래에 약 10 μm의를 누워하여 Z - 한도를 설정합니다. </li><li> 당신이 Z - 한도를 설정한 후, 오른쪽 사출 압력을 찾으십시오. 95 PSI에서 시작합니다. 압력이 너무 높은 경우, 전지가 폭발합니다. 귀하의 압력이 너무 낮으면, 당신은 유지 흰 점이 표시되지만 다른 아무것도 나타나지 않습니다. 성공적인 주사로, 당신은 셀 크기를 변경하지 않고 위상 변화를 볼 수 있습니다. 사출 들어, 최대한 빨리 초점 비행기의 바늘에게 미크론의 몇을 가지고. 핵 위에 바늘 (즉, 개별 세포의 중간)와 조이스틱의 사출 버튼을 누르면 목표로하지만, 버튼을 길게하지 않습니다. </li><li> 당신의 세포에 자리잡고하여 수술 블레이드의 구멍 내에 100-500 세포를 주사. 작업이 완료되면, 2 H.위한 문화 요리와 수술 칼날 39 ° C 배양기로하고, 부화하여 세포를 배치 이 기간 동안 VSVGts045 - GFP가 표현되고 응급실에 분비. 그러나, 39 ° C에서, VSVGts045 - GFP가 제대로 배 수없고 따라서 응급실을 떠날 수 없습니다. 한편, 관심의 작은 GTPase는 공동 분사 실험에서 cytosol에 축적됩니다. </li><li> 2 H 후, 31 ° C. 2 H 위해 12 잘 플레이트와 부화 1 ML 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES 및 0.1 MG / ML cycloheximide에 세포를 배치 이 추적 기간 동안, VSVGts045 - GFP가 제대로 배 응급실에두고 세포 표면에 전달됩니다. </li><li> (plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP를 삽입하고 예를 들어 Rab13Q67L를 V5 - 태그) 필터를 두 (plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP를 삽입하고 예를 들어 Rab13T22N를 V5 - 태그) 세에 대한 3.10 - 3.1 단계를 반복합니다. 각 분사가 20 정도 걸릴 거예요 - 60 분. 당신이 세포를 수정하기 전까지 그러나, 그것은 온도 변화의 incubations와 표면 얼룩을 통해 모든 필터도 동일한 방식으로 처리하기 위해 절대적으로 중요합니다. 고정 후, 당신은 동시에 모든 필터에 대한 얼룩 프로토콜의 나머지 부분을 수행할 수 있습니다. </li></ol> 4. Immunofluorescence 분석을위한 표면 스테 이닝 참고 VSVGts045 - GFP의 GFP 신호의 표백 방지하기 위해, 이후의 모든 절차 중에 알루미늄 호일로 덮고하여 빛으로부터 표본을 보호합니다. <ol><li> 당신이 표면 얼룩을 수행하고자하는 경우, 얼음에 금속 접시에 문화 접시에서 세포를 넣고 얼음 차가운 PBS 2 + (PBS [0.2 g / 리터 KCl, 0.2 g / 리터 KH 2 PO 4 1X 너의 세포를 씻어 8g / 리터 NaCl, 그리고 2.17는 g / 리터 나 2 HPO 4 X 7 H 2 O] 플러스 0.1 g / 리터 CaCl 2 0.1 g / 리터 MgCl 2 X 6 H 2 O). 그 후, 장소이 경우에는 단백질의 ectodomain을 인식 항체의 30 μl 마우스 단클론 항체 TK1 (IgG 1, 후반 토마스 크라 이스에서 얻은), 얼음에 금속 플레이트에 위치 깨끗한 parafilm에. 거꾸로 드롭에 귀하의 세포와 필터를 배치하여 필터의 뒷면에 항체의 몇 방울을 추가합니다. 얼음 1 H에 대해 품어. </li><li> 12 잘 판에 플레이스 세포는, 얼음 차가운 PBS 2 배 세척 + (또는 RT 따뜻한 PBS 2 + 전에 표면의 얼룩없이), 그리고 RT 15 분 3 % paraformaldehyde로 수정. </li><li> PBS 2 +로 한번 세포를 씻고 + 5 분 PBS 2 둡니다. </li><li> / permeabilization 버퍼 (BPB) (2 % [WT / 권] BSA, 0.4 % [WT / 권] PBS 2 사포닌 +) 10 % [권 / 권] 염소 혈청을 차단에서 세포를 품어. RT 1 H를 품어. </li><li> 이 예제 BPB의 안티 - V5 (마우스 단클론 항체 IgG 2A, Invitrogen), 1:200에서 표현 RAB GTPase를 감지하는 기본 항체를 희석. 13,000 RPM 10 분 Eppendorf의 microcentrifuge에 희석 항체를 스핀. 깨끗한 parafilm에 항체 솔루션의 장소 30 μl가 젖은 챔버에 배치. 거꾸로 항체 드롭에 필터 세포를 놓고 RT 1 H에 대해 숙고하다. </li><li> 12 잘 플레이트와 RT에서 BPB 30 분 이상 5 배 세척에 다시 플레이스 셀 (오른쪽까지). </li><li> 이 경우에는 염소 안티 - 마우스 IgG 1 알렉사 (표면에 탐지 VSVG 들어, Invitrogen) 594 - 라벨 및 Cy5 - 라벨 이차 항체가이 예제의 염소에 당신의 RAB의 GTPase를 인식 안티 - 마우스 IgG 2A에서 적절한 보조 항체를 희석 BPB로 1:200 (잭슨 ImmunoResearch) Cy5 - 표시 및 상기 스핀. 다운 항체 드롭에 필터를 거꾸로에 젖은 챔버 및 장소 세포에서 깨끗한 parafilm에 플레이스 30 μl 항체 솔루션입니다. RT 1 H를 품어. </li><li> 4.6 단계를 반복합니다. </li><li> 탈이온수 및 장소 R로 배 필터 딥 세포microslides에 항공 측면까지. 세포의 상단에 10-15 μl 마운트 (10 % 증류수에 [WT / 권] DABCO 50 % [WT / 권] 글리세롤) 추가합니다. 상단과 얼굴 조직을 사용하여 플레이스 18X18 mm 마이크로 커버 유리 부드럽게 세포에 마이크로 덮개 유리를 누르십시오. 매니큐어로 밀봉합니다. </li><li> 공촛점 현미경으로 표본을 분석할 수 있습니다. 우리는 63X 물 침지 렌즈를 갖춘되었다 Microsystem LSM 510, 칼 자이스 혈구 MicroImaging 주식 회사를 사용합니다. </li><li> 그림의 준비를 위해, 조정 등 어도비 포토샵과 어도비 일러스트 레이터와 같은 프로그램을 사용하여 이미지를 결합하여. </li></ol> 5. 대표 결과 작은 GTPases의 공동 표현은 정렬을 VSVG을 방해하는 방법에 대한 예제를 보려면 친절하게 혀끝의 missorting 3, 4 또는 표면 전달 7 억제 하나에 대해 게시된 기사를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 표면 얼룩 (빨강, 그림 1에있는)에 의해 판단으로 모의 분사에서 단지 인코딩 플라스미드 VSVGts045 - GFP의 주사를 즉, 단백질은 잘 편광 MDCK 세포의 basolateral 표면에 배달됩니다. 모든 VSVGts045 - GFP의가 31 추적하는 동안 basolateral 멤브레인 전달됩니다 ° C로 전체 단백질에 대한 광범위한 세포 신호에 의해 입증 (녹색 1, A와 B에게 피규어). 잘 편광되지 않은 세포 VSVGts045 - GFP는 혀끝의 멤브레인 (그림 1 B) 또한 전달됩니다. 컨트롤의 표본은 그림 1에서 B 세포처럼 보인다면, 당신은 귀하의 데이터를 신뢰하고 ​​더 나은 - 양극 세포와 실험을 반복 수 없습니다. 스케일 바 5 μm의 수 있습니다.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
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<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
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<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공 microinjection 실험을위한 가장 중요한 단계는 DNA와 세포의 극성의 품질과 순도 있습니다. 양극 세포없이 사출 제어 이미 VSVG을 mistargeted가되며 실험은 사용할 수 없습니다. DNA는 질이 나쁜 경우, DNA가 가난한 사람들에게 최고의 사출 바늘 또는 모두에 원하는 단백질없이 표현을 방해할 수 있습니다. 또한, 같은 pRKV 같은 높은 표현 수준으로 이어질 것으로 알려진 표현 plasmids를 사용하는 것이 좋습니다입니다. 다른화물 단백질의 분류에 대한 테스트를 원하는 경우, 온도 변화 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 밀도 지단 백질 수용체를 표현하기 위해, 우리는 37 microinjection을 수행 ° 37 1 H 보육 다음 C ° C, 20 4 H ° C (TGN에서화물을 체포하기 위해) 37 2 H ° 0.1 MG / ML cycloheximide의 존재에 C는 표면에 단백질을 추적합니다. 이러한 FC 수용체 같은 단백...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 온수 단계 200 현미경 Axiovert </td><td> 칼 자이스 혈구 부동산 </td><td> 맞춤 주문 </td></tr><tr><td> Injectman NI2 Femtojet의 micromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> 맞춤 주문 </td></tr><tr><td> Femtotips II (Microinjection의 바늘) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader 팁 </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> 클리어 12 - mm 트랜 스웰 필터 지원 </td><td> 코닝 코스타 </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> 내독소없는 플라스미드 maxiprep 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

편광 상피 세포에 plasmids의 microinjection에 의해 작은 gtpases의 기능을 분석

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

혀끝의 도메인이 &#39;무료&#39;표면을 얼굴 basolateral 세포막이 기판과 이웃 세포와 접촉에 화학적 및 기능 뚜렷한 혀끝의과 basolateral 도메인으로 자신의 플라즈마 막 분극 상피 세포. 두 멤브레인 도메인은 확산 장벽을 형성 꽉 분기점에 의해 구분됩니다. 이러한 마딘 - 다비 케이 나인 신장 (MDCK) 세포로 상피 세포가 폴리 카보 네이트 필터에서 높은 밀도의 씨앗을 품고 여러 일 1 2 양식 때 혀끝의 - basolateral 분극은 문화에 성공적으로 recapitulated 수 있습니다. 세포 극성의 구축 및 유지 보수는 그러한 RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 및 Rab13 3 4 5 6 7로 라스의 superfamily의 작은 GTPases의 배열에 의해 규제됩니다. 비활성 GDP - 바운드 상태와 활성 GTP - 바운드 주 사이의 모든 GTPases와 마찬가지로 이들 단백질은 사이클. 뉴클레오 티드 바인딩 지역의 특정 돌연변이 자전거 8 방해. 예를 들어, Rab13T22N는 영구적으로 GDP - 형태로 고정하기 때문에 &#39;부정적인 지배&#39;로 명명됨, Rab13Q67L 더 이상 GTP를 hydrolyze 수없는 반면에 있으므로 &#39;지배 운영중&#39;상태 7 잠겨입니다. 그들의 기능을 분석하는 셀에 GTPases 모두 지배적인 부정과 지배 적극적인 대립 유전자는 일반적으로 내생 단백질 구의 기능을 방해하는 높은 수준에서 표현됩니다. 짧은 시간 금액에 overexpression 높은 수준을 달성하기 우아한 방법은 필터 microinjection 기술을 사용하여 지원에 성장 양극 세포의 핵에 직접 관련 단백질을 인코딩 plasmids을 소개하는 것입니다. 이것은 종종 특히 혀끝의 또는 basolateral 도메인에 정렬됩니다 플라즈마 막 수용체를 인코딩 기자 plasmids의 공동 주사와 결합됩니다. 자주 basolateral 도메인에 정렬화물을 분석하는 데 사용되는화물은 기공을 갖는 구염 바이러스 당단백질 (VSVGts045) 10 이상의 온도에 민감한 allele입니다. 이 단백질은 39 ° C에서 제대로 접을 수 없어 관심의 규제 단백질이 cytosol에서 조립하는 동안 따라서 endoplasmic reticulum (ER)에 유지됩니다. 31 이동 ° C 다음 VSVGts045는 플라즈마 막 11 응급실에 여행을 제대로 접어 떠날 수 있습니다. 이 추적은 일반적으로 청소기 결과를 선도하는 추가의 단백질 합성을 방지하기 위해 cycloheximide의 존재에서 수행됩니다. 여기 상세 basolateral 정렬에 관련된 규제 단백질의 포괄적인 분석을 허용 온도 교대를 포함하여 편광 세포와 후속 incubations에 plasmids를 microinjecting의 절차를 설명합니다.

이 문서는 자세한 microinjection 기술을 사용하여 편광 상피 세포의 작은 GTPases의 overexpression 및 분석에 관련된 절차를.

편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

상피세포는 세포막을 생화학적 및 기능적으로 구별되는 정단면과 기저측면 도메인으로 분극화하며, 여기서 정단면 도메인은 ...을 향합니다.

본 절차는 소형 GTP ACE가 분극화된 막 수송에 미치는 영향을 분석합니다. 먼저, 소형 GTP ACE와 리포터 단백질을 인코딩하는 DNA 플라스미드를 분극화된 세포의 핵 내로 공동 주입합니다. 그 다음, 소형 GTPA가 세포질에 축적되는 동안 리포터 단백질이 소포체 또는 TGN에 정지될 수 있는 온도에서 DNA를 발현시킵니다. 이어서, 추가적인 단백질 합성을 방지하기 위해 cyclo heide를 처리한 상태에서 리포터 단백질이 세포 표면으로 이동하도록 체이스(chase) 과정을 진행합니다.마지막으로, 면역형광 분석을 위해 세포 표면의 리포터 단백질을 표지합니다. 이 분석을 통해 얻은 결과는 공초점 현미경을 통해 표면 국소화의 변화를 시각화할 수 있게 해줍니다. 형질전환과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 미세 주입으로 달성되는 짧은 과발현 시간 동안 이차적 효과가 최소화되어 관심 단백질의 일차적 효과를 연구할 수 있다는 점입니다.이 방법은 작은 GTPase가 어떻게 극성 막 수송을 조절하는지와 같은 세포 극성 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성공적인 미세주입에 필요한 개별 단계들은 시각적 보조 자료 없이는 설명하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep kit를 사용하여 엔도톡신이 없는 플라스마 DNA를 분리하십시오. 본 실험에서는 배양을 위해 공극 크기가 0.4 µm인 투명한 12 mm transwell 필터 3개를 사용하십시오.필터당 4 × 10⁵개의 MDCK 세포를 분주합니다. 2일 후, 현미경으로 배양 상태를 관찰하여 세포가 닫힌 단층(closed monolayer)으로 성장했는지 확인합니다. 마이크로인젝션을 위해.미세주입 당일에, 5L의 MM 배지와 15mM HEIS를 혼합하여 360 x 15mm 플레이트를 준비하고 39°C 인큐베이터에 넣습니다. 또한, 1mL의 MEM 배지, 50mM HEIS 및 0.1mg/mL cycloheximide를 혼합하여 12웰 플레이트 3개를 준비하고 31°C 인큐베이터에 넣습니다. 미세주입 현미경의 전원을 켜고, 가열 스테이지와 10x 및 32x 대물렌즈, 그리고 einor femto jet이 장착된 도립 현미경을 설정합니다.가열 스테이지를 39 °C로 설정하십시오. 또한 에어 테이블로 연결되는 질소 가스 탱크 공급 밸브를 여십시오. 이제 DNA를 여과수로 희석하여 최종 농도가 0.2 mg/mL가 되도록 하십시오.그 후 DNA를 마이크로 원심분리기에서 13,000 RPM으로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 새 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 수술용 칼을 사용하여 배양 접시에서 첫 번째 필터를 꺼내어 MDCK 세포를 준비합니다. 필터 홀더에서 필터를 잘라내어 39 °C로 데운 5 mL의 MEM 성장 배지와 50 mM HEPES가 들어 있는 준비된 60 x 15 mm 플레이트에 넣습니다.배양 플레이트 내의 필터를 고정하기 위해, 필터 중앙에 수술용 칼날을 놓은 다음 배양 플레이트를 현미경의 가열 스테이지 위로 옮깁니다. 희석된 DNA 2~3 µL를 미세주입 바늘에 충전합니다. 바늘의 보호 캡을 돌려 제거한 후 바닥으로 떨어뜨립니다.바늘을 홀더에 배치하려면, 주입기의 메뉴 키를 누르고 밸브가 닫혀 있는지 확인하십시오. 바늘을 홀더에 돌려 끼웁니다. 이때 바늘을 너무 세게 조이지 않도록 주의하십시오.파손의 위험이 있으므로 메뉴 키를 다시 누르십시오. 이렇게 하면 적용된 보정 압력이 미세주입 과정 중 배지가 바늘 안으로 흡입되는 것을 방지합니다. 마지막으로 조이스틱을 탭하여 저장된 홈 위치를 지우고 바늘을 세포 위로 내립니다.10배 대물렌즈를 사용하여 액체 위의 광선 속으로 바늘을 위치시킵니다. 이제 세포에 초점을 맞추십시오. 초점 조절 휠을 위로 180도 돌려 다시 초점을 높여 바늘을 찾으십시오.바늘을 천천히 초점으로 이동시킵니다. 그런 다음 다시 초점에서 벗어나게 합니다. 다시 세포의 초점을 맞추기 위해 조절합니다.바늘의 초점을 다시 맞춥니다. 바늘이 배지의 표면에 닿아 헤일로(halo)가 관찰될 때까지 이 과정을 반복합니다. 세포에 초점이 맞지만 바늘은 여전히 초점 평면 밖에 있어 흐릿하게 보일 때까지 계속 진행합니다.이제 32배 대물렌즈로 전환하고 조동나사를 조절합니다. 바늘 끝으로 apical membrane에 접촉한 후 약 10 µm를 빼서 Z축 제한 범위를 설정합니다. 핵이 apical membrane 아래로 약 10 µm 지점에 위치하기 때문입니다.이제 바늘을 초점 평면에서 수 마이크론 위로 최대한 빠르게 이동시키십시오. 바늘 끝이 핵 위에 오도록 맞춘 다음, 조이스틱의 주입 버튼을 눌렀다 떼십시오. 적절한 주입 압력을 찾기 위해 95 PSI부터 시작하십시오.압력이 너무 높으면 세포가 파열됩니다. 압력이 너무 낮으면 흰색 점이 지속되지만, 그 외에는 아무런 반응이 일어나지 않습니다. 세포 크기의 변화 없이 상전이가 일어나는 성공적인 주입을 수행하십시오.세포 위에 놓인 수술용 칼날의 구멍 안에 100~500개의 세포를 주입합니다. 그다지 세포가 담긴 배양 접시와 수술용 칼날을 39 °C 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 1 mL의 MEM 및 50 mM 0.1 mg/mL cyclo heximide가 준비된 12-well 플레이트에 세포를 옮기고 31 °C에서 2시간 동안 배양합니다.발현된 GFP 신호의 광퇴색을 방지하기 위해, 이후의 모든 표면 염색 과정 동안 알루미늄 호일로 덮어 시료를 빛으로부터 보호하십시오. 배양 접시에 담긴 세포를 얼음 위에 놓인 금속판 위에 올리고 세척합니다. 우선 얼음처럼 차가운 PBS++로 세척한 후, 얼음 위 금속판에 깨끗한 파라폼 조각을 배치하고 표적 단백질의 엑토 도메인을 인식하는 항체를 30 µL씩 떨어뜨립니다.이제 세포가 포함된 필터를 액적 위에 뒤집어 놓은 다음, 필터 뒷면에 항체를 몇 방울 떨어뜨립니다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 세포를 ice cold PBS++로 3회 세척하고, 실온에서 3% paraform aldehyde로 15분 동안 고정합니다.PBS++로 세포를 한 번 세척한 후, PBS++에서 5분 동안 평형화합니다. 이제 세포를 투과성 블로킹 버퍼(blocking permeable buffer)에서 배양합니다. 실온에서 1시간 동안 배양하고, 발현된 RAB GTP ACE를 검출하기 위해 1차 항체를 BPB로 1:200으로 희석합니다. 13,000 RPM에서 10분 동안 원심 분리합니다. 습윤 챔버(wet chamber)에 놓인 깨끗한 파라필름 위에 항체 용액 30 µL를 피펫으로 분주합니다.필터를 뒤집어 세포가 항체 방울에 닿도록 배치하고 1시간 동안 배양합니다. 실온에서 세포를 다시 정방향으로 12-well 플레이트에 옮기고, 적절한 2차 항체와 함께 배양한 후 세척 단계를 포함하여 실온에서 BPB로 30분 동안 5회 세척합니다.필터 위의 세포를 탈이온수에 세 번 담근 후, 10 µL의 마운팅 용액이 도포된 마이크로 슬라이드 위에 정방향으로 올립니다. 그 위에 18 by 18 mm 마이크로 커버 글라스를 덮고, 안면 조직(facial tissues)을 사용하여 커버 슬립을 세포 방향으로 부드럽게 누릅니다. 마지막으로 매니큐어로 밀봉합니다. VSV-G-TS045-GFP를 인코딩하는 플라스미드만을 사용하는 모의 주입(mock injection)의 경우, 단백질이 잘 분극화된 MDCK 세포의 기저외측 표면으로 전달되며, 이는 잘 분극화되지 않은 세포에서 나타나는 붉은색 표면 염색을 통해 판단할 수 있습니다.GFP 융합 단백질의 일부가 정단막으로 전달될 것입니다. 대조군 시료가 이와 같이 보인다면 데이터를 신뢰할 수 없으며, 더 잘 분극화된 세포를 사용하여 실험을 반복해야 합니다. 전체 단백질에 대한 광범위한 세포 내 녹색 신호에서 알 수 있듯이, 31 °C에서 추적하는 동안 발현된 모든 GFP 융합 단백질이 기저측막으로 전달되는 것은 아니라는 점에 유의하십시오. 이 기술을 숙달하면 개발 후 약 10~12시간이 소요됩니다.이 기술은 막 수송(membrane trafficking) 분야의 연구자들이 분극화된 상피세포 내의 조절 단백질을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세주입법(microinjection technique)을 사용하여 분극화된 상피세포에서 단백질을 발현시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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