Name: Label-free Amyloid Structural Characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 배우세요 편광에 민감한 2광자 현미경을 활용한 라벨 프리 아밀로이드 구조 분석 방법입니다. 이 기술은 아밀로이드 섬유 방향성을 검출하고 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 폴란드 국립과학센터가 자금을 지원한 쏘나타 비스9 프로젝트(2019/34/E/ST5/00276)의 지원을 받았다.

Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy를 이용한 구형석 특성화

<ol><li>Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetazzi%2C+RA+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).</li>
<li>Kress, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+orientational+behavior+of+MHC+class+I+protein+and+lipid+probes+in+cell+membranes+by+fluorescence+polarization-resolved+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging.</a> Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).</li>
<li>Duboisset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioflavine-T+and+Congo+Red+reveal+the+polymorphism+of+insulin+amyloid+fibrils+when+probed+by+polarization-resolved+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).</li>
<li>De Luca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ensemble+polymorphism+and+single+aggregate+structural+heterogeneity+in+insulin+amyloid+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excited+polarization-dependent+autofluorescence+of+amyloids+as+a+label-free+method+of+fibril+organization+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).</li>
<li>Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+in+superstructures+-+local+ordering+revealed+by+polarization+analysis+of+two-photon+excited+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence.</a> Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).</li>
<li>Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+orientation+in+molecular+ensembles+by+polarization+sensitive+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+two-photon+imaging+of+amyloid+plaques+in+deep+brain+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).</li>
<li>Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids-fluorophores+interactions+probed+by+combined+nonlinear+polarized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).</li>
<li>Mojzisova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-sensitive+two-photon+microscopy+study+of+the+organization+of+liquid-crystalline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA.</a> Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).</li>
<li>Olesiak-Banska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+crystal+phases+of+DNA%3A+Evaluation+of+DNA+organization+by+two-photon+fluorescence+microscopy+and+polarization+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis.</a> Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).</li>
<li>Olesiak-Banska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+multifunctional+probes+in+a+liquid+crystalline+DNA+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix.</a> Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).</li>
<li>Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-photon+excited+autofluorescence+of+lysozyme+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).</li>
<li>Brasselet, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrasselet%2C+S+%22Fluorescent+Methods+to+Study+Biological+Membranes%22">Fluorescent Methods to Study Biological Membranes</a>. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).</li>
<li>Krebs, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+spherulites+by+amyloid+fibrils+of+bovine+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).</li>
<li>Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+birefringence+on+polarization+resolved+nonlinear+microscopy+and+collagen+SHG+structural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging.</a> Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).</li>
<li>Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+distortion+effects+in+polarimetric+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Ferrand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultimate+use+of+two-photon+fluorescence+microscopy+to+map+orientational+behavior+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores.</a> Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).</li>
<li>Chipman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization+index+and+the+average+degree+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Depolarization index and the average degree of polarization.</a> Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).</li>
<li>de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+reference+standards+for+two-photon+absorption+in+the+680%26%23x2013%3B1050+nm+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680&#x2013;1050 nm wavelength range.</a> Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).</li>
<li>Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+in+cartilage+under+strain+probed+by+polarization+sensitive+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy.</a> Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611(2019).</li>
<li>Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+model+of+the+molecular+orientational+distribution+probed+by+polarization-resolved+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+A%22%5BJournal%5D)">Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation.</a> Physical Review A. 85 (4), 043829(2012).</li>
<li>Loksztejn, A., Dzwolak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+Bifurcation+in+aggregating+insulin%3A+an+induced+circular+dichroism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study.</a> Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

편광에 민감한 이광자 현미경은 아밀로이드 상부구조 내부의 원섬유의 국부적 순서를 연구하는 데 유용한 도구로, 표준 다광자 설정을 약간만 수정하면 됩니다. 비선형 광학 현상에서 작동하기 때문에 단광자 여기 형광 현미경 방법에 비해 각도 광선택을 줄이고 축 분해능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 단일 광자 여기 형광 현미경 기술19,20과 비교할 때 더 낮은 광 산란, 더 낮은 광독성 및 더 깊은 샘플 침투로 이어집니다. 우리가 이미 증명한 바와 같이, 이는 무표지 방식으로 수행될 수 있는 구형석(spherulites)과 같은 단백질의 조밀하게 충전된 응집체의 측정에 매우 적합하다21.
그러나 여기에 설명된 방법을 효과적으로 사용하려면 몇 가지 주요 문제에 주의를 기울여야 합니다. 시료 전처리와 그 품질, 즉 배양부터 시작하여 항상 아밀...

지난 수십 년 동안 단백질과 그 응집체1의 바이오이미징을 위한 수많은 형광 현미경 기술이 크게 발전했지만, 샘플 2,3 내에서 국소 순서를 확인하는 데 사용된 것은 소수에 불과합니다. 형광 수명 이미징 현미경4는 아밀로이드 상부 구조-구형석의 고유한 구조적 이질성을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 구형석(spherulites)과 같은 복잡하고 조밀하게 포장된 생물구조 내부의 국소 질서에 대한 정량적 결정은 편광에 민감한 방법을 사용하여 해결할 수 있습니다3. 그러나 UV-VIS 파장을 사용하여 생체 내 형광단을 여기시키면 조직 광 산란이 높기 때문에 표면 조직 침투를 사용하는 표준 형광 기술은 제한적입니다5. 또한 이러한 이미징은 종종 특정 형광 프로브를 설계하고 표적 생체 분자에 바인딩해야 하므로 이미징을 수행하는 데 필요한 비용과 작업량이 증가합니다.
최근 이러한 문제를 해결하기 위해 우리 팀은 생물학적 구조의 무표지 이미징을 위해 편광 민감성 이광자 여기 형광 현미경(ps-2PFM)을 채택했습니다 6,7. Ps-2PFM은 여기 빔의 선형 편광 방향에 대한 이광자 형광 강도의 의존성을 측정하고 방출된 형광8의 편광을 분석할 수 있습니다. 이 기술을 구현하려면 표준 다광자 현미경 설정 여기 경로(그림 1)를 반파장 플레이트로 보완하여 광 편광면을 제어해야 합니다. 그런 다음 여기 레이저 빔의 편광에 대한 이광자 여기 형광 강도의 의존성을 나타내는 극좌표 그래프가 두 개의 애벌랜치 포토다이오드에 의해 수집된 신호에서 생성되어 형광 편광의 두 개의 상호 수직 구성 요소를 수집합니다.
마지막 단계는 데이터 분석 프로세스로, dichroic mirrors 또는 high numerical aperture objective와 같은 광학 요소가 편광에 미치는 영향을 고려합니다. 이광자 공정의 특성으로 인해 이 방법은 초점면 외부의 형광단의 이광자 여기가 확률적으로 제한되기 때문에 각도 광선택이 감소하고 축 분해능이 향상됩니다. 또한 심부 조직 이미징을 위한 근적외선 프로브(NIR)의 생체 내 이미징에 대해 유사한 방법을 성공적으로 구현할 수 있음이 입증되었습니다9. Ps-2PFM은 이전에 세포막10 및 DNA11,12의 이미지 형광단뿐만 아니라 금 나노 입자13과 같은 생물학적 시스템의 비표준 형광 마커에 적용되었습니다. 그러나, 이 모든 예에서, 생체 분자의 조직에 관한 정보는 간접적으로 얻어졌고 형광단과 생체 분자 사이의 사전 정의된 상호 배향을 필요로 했습니다.
최근 논문 중 하나에서 우리는 ps-2PFM이 구형석의 아밀로이드 피브릴에 결합된 아밀로이드 특이적 염료인 Thioflavin T의 아밀로이드 상부 구조 및 형광의 자가형광 국소 분극을 결정하는 데 성공적으로 적용될 수 있음을 보여주었습니다6. 또한, 또 다른 연구에서는 ps-2PFM을 서브미크론 크기 영역에서 아밀로이드 구형 구형 내부의 아밀로이드 피브릴 배향을 검출하는 데 사용할 수 있음을 입증했으며, 이는 투과 전자 현미경(TEM) 이미징7과 연관시켜 확인되었습니다. 이 결과의 달성은 i) 하나 또는 두 개의 광자로 여기될 때 구형석-아밀로이드의 고유 자가형광이 450에서 500nm 범위에 위치한 방출 최대값 및 표준 형광 염료14와 유사한 이광자 흡수 단면을 나타내는 고유 자가형광을 나타내고, ii) 생물학적 막 및 DNA 구조를 표지하는 염료의 ps-2PEF가 어떻게 적용될 수 있는지 설명하기 위해 이전에 소개된 수학적 모델 덕분에 가능했습니다. 구형석과 염료에 의해 표시되는 형광 8,11,15. 따라서 분석을 진행하기 전에 이 주제6에 관한 첫 번째 논문의 본문과 지원 정보 모두에 설명된 필수 이론을 살펴보는 것이 좋습니다. 여기에서는 소 인슐린 구형석의 무표지 아밀로이드 구조적 특성 분석을 위해 ps-2PFM 기법을 적용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>Sample preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, 24 x 24 mm</td><td>Chemland</td><td>04-298.202.04</td><td></td></tr><tr><td>DPX mountant for histology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6522</td><td>Slide mountant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL,</td><td>polypropylene Chemland</td><td>02-63102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>spherulite incubation에 사용</td></tr><tr><td>HLP 5UV 정수 시스템</td><td>Hydrolab</td><td></td><td>시료 준비에 사용되는 디이온화 물 공급원</td></tr><tr><td>염산(&ge; 37 %, APHA &le; 10),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-M</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 인슐린 분말(&ge; 25 units/mg (HPLC))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올(HPLC 등급)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270474</td><td></td></tr><tr><td>오목한 76 x 26 x 1mm가 있는 현미경 슬라이드</td><td></td><td>Chemland 04-296.202.09</td><td></td></tr><tr>그림 2에 사용된<td>Olympus BX60</td><td>Olympus</td><td></td><td>편광 광학 현미경</td></tr><tr><td>PTFE 스레드 씰 테이프, 12mm x 12mm x 0.1mm, 60gm2</td><td>Chemland</td><td>VIT131097</td><td></td></tr><tr><td>Microscope ps-2PFM setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FELH0800 - &Oslash; 25.0 mm 롱패스 필터</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FESH0700 - &Oslash; 25.0 mm 쇼트패스 필터</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDQ100 광자 계수 애벌런치 포토다이오드&nbsp;</td><td>ID Quantique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다광자 단역 통과 방출 필터 720nm&nbsp;</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장착 무채색 반파 플레이트, 690-1200nm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Apo 오일 이멀젼 100x/1.4 NA</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피에조 3D 스테이지</td><td>피에조시스템 Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>편광 빔스플리터</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S130C - 슬림 포토다이오드 파워 센서, Si, 400 - 1100nm, 500mW</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabView 2018</td><td>National Instruments</td><td></td><td>버전 18.0.1f2</td></tr><tr><td>Matplotlib 라이브러리</td><td></td><td></td><td>버전 3.3.2</td></tr><tr><td>NumPy 라이브러리</td><td></td><td></td><td>버전 1.19.2</td></tr><tr><td>SciPy 라이브러리</td><td></td><td></td><td>버전 1.5.2</td></tr><tr><td>Spyder Python 3 IDE</td><td></td><td></td><td>버전 4.1.5</td></tr></tbody></table>

label-free amyloid structural characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경

Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization

1광자에 비해 2광자 여기(excitation)는 광독성이 낮고, 조직 침투가 깊고, 조밀하게 밀집된 시스템에서 효율적으로 작동하고, 형광단의 각도 광선택이 감소하기 때문에 바이오이미징 실험에 유용합니다. 따라서 이광자 형광 현미경(2PFM)에 편광 분석을 도입하면 선형 광학 프로세스를 기반으로 하는 표준 이미징 방법에 비해 샘플의 분자 조직을 보다 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 연구에서는 편광에 민감한 2PFM(ps-2PFM)과 복잡한 생체 구조-아밀로이드 구형 입자 내 분자 순서 결정에 대한 응용에 중점을 둡니다. 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환은 종종 손상된 단백질 접힘 과정으로 인해 형성된 아밀로이드 단백질 응집체의 검출을 통해 진단됩니다. 이들의 구조를 탐구하면 생성 경로를 더 잘 이해할 수 있고, 결과적으로 더 민감한 진단 방법을 개발할 수 있습니다. 이 논문은 소 인슐린 구형석 및 구형 아밀로이드 단백질 응집체 내부의 국소 피브릴 순서 측정에 적합한 ps-2PFM을 제시합니다. 또한, 우리는 제안된 기술이 구형석 내부의 피브릴의 3차원 조직을 해결할 수 있음을 증명합니다.

제시된 프로토콜은 ps-2PFM을 사용한 테스트를 위한 아밀로이드 상부 구조 준비, 현미경 시스템 구성 및 적절한 샘플 측정에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 그러나 최종 측정 세트 전에 APD를 등방성 기준과 적절하게 정렬하는 것이 중요하며, 이를 통해 두 검출기에서 유사한 모양과 강도의 대칭 신호를 수집할 수 있습니다(그림 4C). X축과 Y축의 검출기에서 측정된 강도 간의 최소한의 차이도 추가 측정, 특히 분석 중에 적절한 보정 계수로 고려해야 합니다. 장착 후, 단일 구형석을 포함하는 샘플은 그림 2B에서와 같이 POM에 특징적인 몰타 십자가를 제공하고, 2PFM 래스터 스캔을 수행한 후, 이미지는 그림 5A에 표시된 것과 유사하게 보여야 하며, 이는 구형 석공석 6,7...

이 논문은 편광에 민감한 이광자 현미경을 적용하여 표지가 없는 아밀로이드 상부구조-구형석 내의 국소 조직을 특성화하는 방법을 설명합니다. 또한 샘플을 준비 및 측정하고, 필요한 설정을 조립하고, 데이터를 분석하여 아밀로이드 섬유의 국소 조직에 대한 정보를 얻는 방법을 설명합니다.

Label-free Amyloid Structural Characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경

Compared to its one-photon counterpart, two-photon excitation is beneficial for bioimaging experiments because of its lower phototoxicity, deeper tissue ...

우리의 목표는 아밀로이드라고 하는 단백질 응집체의 검출을 위한 새로운 광학 마커와 기술을 개발하는 것입니다. 그들은 알츠하이머병 및 제2형 당뇨병과 같은 다양한 질병에 관여합니다. 따라서 이러한 질병을 치료하기 위해서는 아밀로이드를 시각화하는 기술이 필요합니다.우리는 이광자 현미경을 사용하여 아밀로이드 상부 구조 내부의 아밀로이드 피브릴 방향을 검출할 수 있음을 입증했습니다. 아밀로이드 특이적 염료를 사용할 뿐만 아니라 아밀로이드의 자가형광을 이용해서도 달성할 수 있습니다. 우리의 기술은 비선형 광학 현상에서 작동하기 때문에 단광자 형광 현미경 기술과 비교할 때 각도 광선택을 줄이고 축 분해능을 향상시키며 광 산란을 낮추고 광독성을 낮추고 더 깊은 샘플 침투를 달성할 수 있습니다.편광에 민감한 이광자 형광 현미경은 단백질 응집체뿐만 아니라 DNA 소포 및 지질막과 같은 다양한 복잡한 생물학적 구조의 내부 구조를 이미지화하는 데 유망한 도구입니다.

polarization-sensitive-two-photon-microscopy-for-label-free-amyloid

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 비디오는 형광 이미징을 위해 발광 결합 올리고티오펜 염료(헵타머-포르밀 티오펜 아세트산 또는 hFTAA)를 사용하여 조직 절편의 아밀로이드를 염색하는 기술에 대해 설명합니다. 아밀로이드는 β장이 풍부한 비정상 단백질 응집체입니다. 조직 샘플에서 이들을 검출하면 아밀로이드 관련 질환 또는 단백병증의 진단 및 치료에 도움이 됩니다.

아밀로이드 침전물의 hFTAA 염색: 조직 절편에서 형광 이미징을 위해 올리고티오펜 기반 염료를 사용하여 아밀로이드 피브릴을 시각화하는 기술

출처: Nyström, S., et al., 초분광 컨포칼 현미경 및 형광 수명 이미징에 의한 발광 복합 올리고티오펜으로 염색된 아밀로이드 조직 이미징. J. Vis. 특급 (2017). 이 동영상은 hFTAA 염료를 사용하여 아밀로이드 조직을 반영하는 색상으로 구분된 이미지에서 소형 코어를 파란색/녹색으로, 불안정한 주변부를 빨간색/노란색으로 표시하여 형광 수명 이미징 현미경 또는 FLIM으로 아밀로이드 구조를 분석하는 방법을 보여줍니다.

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 조직 절편의 아밀로이드 구조 분석

아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

이 기사에서는 간단하고 혁신적인 2차 고조파 생성 현미경 접근 방식을 통해 세뇨관병증 모델에서 미세소관 로딩 희소돌기아교세포를 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학

막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

1D 및 2D 1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

DNA 종이접기는 DNA 분자의 자기 조립을 프로그래밍하여 정밀한 나노 크기의 물체를 제작하는 강력한 방법입니다. 여기에서는 DNA 종이접기에서 생체 반응성 로봇을 접는 프로토콜, 투과 전자 현미경 이미징(TEM)을 위한 정제 및 음성 염색에 대해 설명합니다.

DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화

본 논문에서는 다양한 재료의 화학 물질의 물질 전달 매개 변수를 정량화하기위한 절차가 표시됩니다. 이 프로세스는 실시간으로, 고진공에서 질량 분석법에 의해 기록 된 방출 프로파일을 수증기 역 확산 기반의 분석 모델을 이용하는 것을 포함한다.

페인트의 화학 물질 운송의 특성을 역 분석 접근

의도적으로 설계 금속 - 유기 골격 물질의 합성, 활성화 및 특성은 빌딩 블록 (building block)이 호환되지 않거나 원치 않는 형체가 열역학적으로 원하는 형태를 통해 선호하는 아르 특히, 도전이다. 우리는 초 임계 CO 2 건조를 통해 모세 혈관 및 활성화 용매를 이용한 링커 교환, 분말 X-선 회절의 응용 프로그램은 이러한 문제의 일부를 해결할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

기능화의 합성 및 특성 금속 - 유기 프레임 워크

배우세요 편광에 민감한 2광자 현미경을 활용한 라벨 프리 아밀로이드 구조 분석 방법입니다. 이 기술은 아밀로이드 섬유 방향성을 검출하고 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

Label-free Amyloid Structural Characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경

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