Name: CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 고밀도 CMOS 미세전극 어레이를 활용한 대규모 신경 집합체 다중모달 기록 및 분석 방법입니다. 이 기술은 해마와 후각구 회로 및 인간 iPSC 유래 신경망의 시공간 활동을 고해상도로 포착하여 신경 기능과 장애 메커니즘 이해에 기여합니다.

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이 연구는 기관 기금(DZNE), Helmholtz Validation Fund(HVF-0102) 내 Helmholtz Association, Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering(DIGS-BB)의 지원을 받았습니다. 또한 드레스덴 DZNE-드레스덴의 행동 동물 실험 플랫폼(Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther, Jens Bergmann)의 지원에도 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1의 일부는 플랫폼 BioRender.com 를 사용하여 작성되었음을 알려드립니다.

HD-MEA에 대한 멀티모달 대규모 신경 기록 및 분석 

저자는 경쟁 또는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

상호 연결된 뉴런 앙상블에서 발생하는 시공간 뉴런 활동의 복잡한 역학은 오랫동안 신경 과학의 흥미로운 주제였습니다. 패치 클램프, 표준 MEA 및 Ca2+ 이미징과 같은 기존 방법론은 뇌 복잡성에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 네트워크 전반의 포괄적인 계산 역학(computational dynamics)을 포착하는 데 부족한 경우가 많다(21,22,23). 이 JoVE 연구에서 자세히 설명된 HD-MEA 플랫폼의 기술 프로토콜은 세포 어셈블리에서 광범위한 네트워크(즉, 급성, 생체 외 마우스 뇌 절편 및 체외 인간 iPSC 네트워크)에 이르기까지 다양한 양식에 걸쳐 신경 역학에 대한 파노라마 보기를 제공하는 중요한 도약을 나타냅니다26,29,30,32.
급성 생체 외 마우스 뇌 절편은 신경 연구의 기초 도구였으며 분자 및 회로 수준 조사를 용이하게 했습니다 6,7. 그러나 조직 생존력을 유지하는 문제는 지속적인 병목 현상이었습니다. 이 연구에서 설명된 프로토콜은 HD-MEA 플랫폼에서 이점을 활용하기 위해 이러한 슬라이스의 품질과 수명을 최적화하기 위해 중요한 수정 사항을 도입합니다. 이 프로토콜은 - i) 슬라이스 균일성 달성, 슬라이스 시간이 길어지는 절충 시간에도 불구하고 정밀도와 조직 손상 최소화로 인해 조직 초퍼보다 비브라톰을 사용하는 것이 선호됩니다. ii) 조직 생존력을 유지하기 위해 추출에서 기록에 이르기까지 공정 전반에 걸쳐 일정한 탄수화를 보장합니다. iii) 온도를 조절하고 기록하기 전에 적절한 회복 시간을 허용합니다. iv) 아가로스 블록 또는 몰드를 사용하여 뇌를 안정화하고 찢어짐을 방지하며 접착제 접촉을 최소화합니다. v) HD-MEA 저장소 내에서 탄화된 aCSF의 최적 유속을 유지하여 슬라이스 상태를 보장하면서 디커플링, 노이즈 및 드리프트와 같은 문제를 방지합니다(표 2).
생쥐 뇌 절편과 인간 iPSC 제제 모두에서 전극-조직 계면 결합을 향상시키는 것이 가장 중요합니다30,46,47. 당사의 프로토콜은 접착 촉진 분자인 폴리-dl-오르니틴(PDLO) 활용의 중요성을 강조합니다. 이 분자는 전기 신호를 검출하기 위한 표면적을 증가시킬 뿐만 아니라 전기 전도도를 증가시킨다(46). 이를 통해 세포 접착, 성장 및 기능적 네트워크 특성의 개발을 촉진합니다. 이러한 최적화는 HD-MEA 플랫폼의 효율성을 향상시키는 데 중추적인 역할을 합니다. 이는 마이크로 스케일의 ex-vivo 및 in-vitro 커넥톰과 시공간 발화 시퀀스에 대한 정확하고 일관된 분석을 보장합니다. 특히, PDLO는 신경 세포 배양에서 자발적 발화 활동과 전기 자극에 대한 반응성을 촉진하는 데 있어 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리-l-오르니틴(PLO)과 같은 다른 기질을 능가하는 것으로 나타났습니다. 또한, PDLO는 HD-MEA의 표면 기능화에 사용되었으며, 전극-슬라이스 결합 인터페이스를 향상시키고 OB 및 HC 슬라이스26,29 모두에서 신호 대 잡음비를 증가시키는 것으로 나타났다. 맞춤형 플래티넘 앵커를 추가하면 전극-슬라이스 인터페이스 커플링이 더욱 강화되어 더 높은 신호 대 잡음비로 녹음할 수 있습니다.
생체 외 마우스 뇌 절편과 체외 인간 iPSC 네트워크 모두에 HD-MEA를 활용하면 광범위하고 멀티스케일 및 멀티모달 역학을 탐색하는 데 능숙한 방법이 도입됩니다. 그러나 이러한 혁신적인 접근 방식은 특히 데이터 관리에서 상당한 문제를 야기합니다 48,49,50,51. 18kHz/전극 샘플링 주파수에서 수집된 단일 HD-MEA 레코딩은 155MB/s의 엄청난 데이터를 생성합니다. 데이터 볼륨은 여러 슬라이스, 다양한 약리학적 조건 또는 장시간의 기록 기간을 고려할 때 급격히 증가합니다. 이러한 정보의 유입에는 강력한 스토리지 인프라와 간소화된 처리를 위한 고급 컴퓨팅 도구가 필요합니다. 수천 개의 신경 앙상블에서 동시에 데이터를 수집할 수 있는 HD-MEA 플랫폼의 기능은 장점이자 장애물입니다. 뇌 기능의 계산 역학에 대한 최고의 통찰력을 제공하지만 정교한 분석 프레임워크도 필요합니다. 이 JoVE 프로토콜에서는 대규모 이벤트 감지, 분류, 그래프 이론, 주파수 분석 및 기계 학습을 포함한 계산 전략의 예를 제공했습니다. 이러한 방법은 복잡한 신경 데이터 분석의 문제를 해결하기 위한 집중적인 노력을 강조합니다. 그럼에도 불구하고 이러한 다차원 신경 데이터 세트를 분석하기 위한 고급 계산 도구를 개발할 수 있는 상당한 여지가 여전히 있습니다. 적절한 도구와 방법론으로 무장한 HD-MEA 플랫폼의 잠재력은 확대되어 건강한 상태와 병리학적 상태 모두에서 뇌 기능의 복잡성에 대한 심오한 통찰력을 제공합니다.
본질적으로 HD-MEA 플랫폼은 논의된 세부 프로토콜 및 계산 도구와 통합될 때 뇌의 복잡한 작동을 이해하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다. 대규모, 다중 규모 및 다중 모드 역학을 캡처하여 학습, 기억 및 정보 처리와 같은 프로세스에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 또한 체외 인간 iPSC 네트워크에서의 적용은 약물 스크리닝 및 맞춤형 의학에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 이 플랫폼은 신경 과학 연구의 상당한 발전을 나타내지만 내재된 기술적 문제를 인정하고 해결하는 것이 중요합니다. 지속적인 개선과 고급 계산 도구의 통합을 통해 HD-MEA 플랫폼은 정밀 진단 도구, 특정 바이오마커 식별 및 신경 장애에 대한 표적 치료의 새로운 시대를 열 준비가 되어 있습니다.

종종 세포 어셈블리라고 불리는 뉴런 앙상블(neuronal ensemble)은 뉴럴 코딩(neural coding)에서 중추적인 역할을 하며, 다중 스케일 신경 정보 1,2,3을 처리하기 위한 복잡한 계산을 용이하게 한다. 이러한 앙상블은 광범위한 신경 네트워크와 미묘한 미세 회로의 형성을 뒷받침합니다4. 이러한 네트워크와 진동 패턴은 지각과 인지를 포함한 고급 뇌 기능을 주도합니다. 광범위한 연구가 특정 뉴런 유형과 시냅스 경로를 탐구했지만, 뉴런이 어떻게 협력적으로 세포 어셈블리를 형성하고 회로와 네트워크 전반에 걸쳐 시공간 정보 처리에 영향을 미치는지에 대한 더 깊은 이해는 여전히 어려운 상태로 남아 있다5.
급성, 생체 외 뇌 절편은 온전한 신경 회로를 연구하기 위한 중추적인 전기 생리학적 도구로, 신경 기능, 시냅스 전달 및 연결성의 진동 활동 패턴을 조사하기 위한 제어된 설정을 제공하며, 약리학적 테스트 및 질병 모델링에 영향을 미칩니다 6,7,8. 이 연구 프로토콜은 학습 및기억 과정에 관여하는 해마-피질(HC)과 냄새 감별을 담당하는 후각구(OB) 11,12,13의 두 가지 주요 뇌 회로를 강조합니다. 이 두 영역에서, 포유류의 뇌에서 일생 동안 성체 신경 발생에 의해 새로운 기능적 뉴런이 지속적으로 생성된다14. 두 회로 모두 기존 신경망을 재배선하는 데 참여하고 필요할 때 대체 정보 처리 전략을 용이하게 하는 다차원 동적 신경 활동 패턴과 고유한 가소성을 보여줍니다15,16.
급성 생체 외 뇌 절편 모델은 뇌 기능을 탐구하고 미세 회로 수준에서 질병 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 신경망에서 유래한 체외 세포 배양은 동물 실험의 결과를 잠재적인 인간 임상 치료에 원활하게 연결하는 중개 연구의 유망한 길을 제공합니다17,18. 이러한 인간 중심의 체외 분석은 약리학적 독성을 평가하고, 정확한 약물 스크리닝을 가능하게 하며, 혁신적인 세포 기반 치료 전략에 대한 연구를 심화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼 역할을 합니다19,20. iPSC 신경 세포 모델의 중추적인 역할을 인식하여, 당사는 이 프로토콜 연구의 세 번째 모듈을 통해 파생된 네트워크의 기능적 특성을 철저히 조사하고 관련 세포 배양 프로토콜을 미세 조정했습니다.
이러한 전기 발생 신경 모듈은 일반적으로 칼슘(Ca2+ 이미징), 패치 클램프 기록 및 저밀도 미세 전극 어레이(LD-MEA)와 같은 기술을 사용하여 연구되었습니다. Ca2+ 이미징은 단일 세포 활동 매핑을 제공하지만, 낮은 시간 분해능과 장기 기록의 어려움으로 인해 방해를 받는 세포 표지 기반 방법입니다. LD-MEA는 공간 정밀도가 부족한 반면, 패치 클램프는 침습적인 단일 부위 기술이며 힘들기 때문에 성공률이 낮은 경우가 많습니다 21,22,23. 이러한 문제를 해결하고 네트워크 전반의 활동을 효과적으로 조사하기 위해 대규모 동시 신경 기록은 뇌 복잡성의 기저에 있는 신경 역학의 계산 원리와 건강 및 질병에 미치는 영향을 이해하기 위한 중추적인 접근 방식으로 부상했습니다24,25.
이 JoVE 프로토콜에서는 생체 외 쥐 뇌 급성 절편(그림 1A-C)의 해마 및 후각 전구 회로(그림 1A-C) 및 체외 인간 iPSC 유래 신경 네트워크(그림 1D-E)를 포함한 다양한 뇌 양식에 걸쳐 시공간 신경 활동을 캡처하기 위한 고밀도 MEA(HD-MEA)를 기반으로 하는 대규모 신경 기록 방법을 시연합니다,27,28,29,30,31,32,33,34,35입니다. CMOS(Complementary-Metal-Oxide-Semiconductor) 기술을 기반으로 하는 HD-MEA는 온칩 회로 및 증폭을 자랑하며 7mm2 어레이 크기36에서 밀리초 미만의 기록이 가능합니다. 이 비침습적 접근법은 높은 시공간 분해능에서 4096개의 미세전극을 사용하여 수천 개의 신경 앙상블에서 동시에 다중 부위, 표지가 없는 세포외 발사 패턴을 캡처하여 국소전위(LFP) 및 다단위 스파이킹 활성(MUA)26,29의 복잡한 역학을 보여줍니다.
이 방법론에 의해 생성된 데이터의 방대함을 감안할 때, 정교한 분석 프레임워크가 필수적이지만37. 우리는 자동 이벤트 감지, 분류, 그래프 이론, 기계 학습 및 기타 고급 기술을 포괄하는 계산 도구를 개발했습니다(그림 1F)26,29,38,39). HD-MEA를 이러한 분석 도구와 통합하면 개별 세포 어셈블리에서 다양한 신경 양식에 걸쳐 더 광범위한 신경망에 이르는 복잡한 역학을 조사하기 위한 전체론적 접근 방식이 고안되었습니다. 이러한 결합된 접근법은 정상적인 뇌 기능의 계산 역학에 대한 우리의 이해를 심화시키고 병리학적 조건에 존재하는 이상에 대한 통찰력을 제공한다28. 또한 이 접근 방식의 통찰력은 뇌에서 영감을 받은 모델링, 뉴로모픽 컴퓨팅 및 신경 학습 알고리즘의 발전을 촉진할 수 있습니다. 궁극적으로 이 방법은 신경망 교란 이면의 핵심 메커니즘을 밝히고, 잠재적으로 바이오마커를 식별하고, 신경 질환에 대한 정확한 진단 도구 및 표적 치료법을 만드는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>150mm 유리 페트리 접시</td><td>일반</td><td>일반</td><td>뇌 준비 작업 공간, 뇌 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 멸균 필터 장치&nbsp;</td><td>모듬</td><td></td><td>모듬</td></tr><tr><td>90mm 플라스틱 배양 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>뇌 준비 작업 공간, 뇌 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>아가로 로스</td><td></td><td>로스 6351.5</td><td>두뇌 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>아가로 스 금형</td><td>CUSTOM</td><td></td><td>CUSTOM 두뇌 준비 작업 공간; 주문 설계되는 3D 인쇄 기계 디자인, 요청시 유효한</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>일반적인</td><td>일반적인</td><td>뇌 적출 작업장</td></tr><tr><td>마취 약실</td><td>일반적인</td><td>일반적인</td><td>뇌 적출 작업 공간; 모듬 비커, 침구 등</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>모듬 비커</td><td>일반</td><td>일반</td><td>솔루션 준비 작업 공간; 50 mL</td></tr><tr><td>모듬 루어</td><td>Cole Parmer</td><td>45511-00</td><td>Brain Slice Recording Workspace</td></tr><tr><td>모듬 부피 플라스크</td><td>일반</td><td>일반</td><td>솔루션 준비 작업; 500 mL, 1 L</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>BrainXell 상업 공급 업체 프로토콜</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>BrainXell 상업 공급 업체 프로토콜</td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 UV 램프</td><td>다양한</td><td></td><td>HD-MEA 코팅, 도금, 유지 보수 작업 공간</td></tr><tr><td>BrainPhys 뉴런 매체&nbsp;</td><td>스템셀 테크놀로지스&nbsp;</td><td>05790&nbsp;</td><td>CDI 및 BrainXell 상용 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>Brainwave Software</td><td>3Brain AG</td><td>버전 4</td><td>Brain Slice 및 Human iPSC 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>BrainXell&nbsp; 글루타메이터성 뉴런 분석&nbsp;</td><td>브레인셀</td><td>&nbsp; BX-0300&nbsp;</td><td>BrainXell 커머셜 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>카보겐</td><td>제네릭</td><td>일반</td><td>모든 작업 공간; 95%/5% O2 및 CO2 혼합물</td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터&nbsp;</td><td>다양한</td><td>어소티드</td><td></td></tr><tr><td>CMOS 기반 HD-MEA 칩</td><td>3Brain AG</td><td>CUSTOM</td><td>Brain Slice 및 Human iPSC 레코딩 워크스페이스</td></tr><tr><td>코니컬 튜브, 50 mL, Falcon (원심분리기 튜브)&nbsp;</td><td>스템셀 테크놀로지스&nbsp;</td><td>38010&nbsp;</td><td>CDI 상업 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>악어 클립 접지 케이블</td><td>JWQIDI</td><td>B06WGZG17W</td><td>Brain Slice Recording Workspace</td></tr><tr><td>Curved Forceps</td><td>FST</td><td>11052-10</td><td>Brain Extraction Workspace</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>BrainXell 상업 공급 업체 프로토콜</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Ca2+ 및 Mg2+ 없는 인산염 완충 식염수 (D-PBS)</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>37350&nbsp;</td><td>CDI 상업 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>여과지</td><td>Macherey-Nagel</td><td>531 011</td><td>뇌 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>미세 브러시</td><td>Leonhardy</td><td>773</td><td>뇌 슬라이스 준비 작업 공간, 뇌 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>겸자</td><td>VITLAB</td><td>67895</td><td>뇌 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>BrainXell 상업용 공급 업체 프로토콜</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life 기술</td><td>A1413201</td><td>BrainXell 상용 공급 업체 프로토콜</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Roth</td><td>4518</td><td>Brain Slice 준비 작업 공간, Brain Slice 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>BrainXell 상업용 공급 업체 프로토콜</td></tr><tr><td>중력 기반 관류 시스템</td><td>ALA</td><td>VC3-8xG</td><td>브레인 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>HD-MEA 기록 플랫폼</td><td>3Brain AG</td><td>CUSTOM</td><td>뇌 슬라이스 및 인간 iPSC 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>히터</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td>뇌 절편 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>혈구계 또는 자동 세포 계수기</td><td>모듬</td> 모<td>듬</td><td>HD-MEA 코팅, 도금, 유지 보수 작업 공간</td></tr><tr><td>하이포 니들스</td><td>워너 인스트루</td>먼트 <td>641489</td><td>브레인 슬라이스 녹음 작업 공간</td></tr><tr><td>iCell GlutaNeurons Kit, 01279&nbsp;</td><td>CDI</td><td>R1061&nbsp;</td><td>CDI 상업 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Vantage</td><td>V95-304</td><td>뇌 추출 작업 공간</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>뇌 추출 작업 공간</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-250G</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>라미닌&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>L2020년&nbsp;</td><td>CDI 상업 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>액체 질소 저장 장치&nbsp;</td><td>모듬</td><td></td><td>HD-MEA 코팅, 도금, 유지 보수 작업 공간</td></tr><tr><td>마그네틱 교반기</td><td>일반</td><td></td><td>일반 솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>금속 나사</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td><td>브레인 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138-250G</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>미세해부 도구 홀더&nbsp;</td><td>브라운</td><td>4606108V</td><td>브레인 슬라이스 준비 작업 공간, 브레인 슬라이스 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>미세 해부 도구 바늘</td><td>브라운&nbsp;</td><td>9186166</td><td>Brain Slice 준비 작업 공간, Brain Slice Recording 작업 공간</td></tr><tr><td>모듈식 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>CUSTOM</td><td>Brain Slice Recording Workspace; 사용자 정의 사양 및 수정</td></tr><tr><td>사항 N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>CDI 및 BrainXell Commercial Supplier Protocol</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-1KG</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751-100G</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>BrainXell 상업용 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>광학 케이지 시스템</td><td>Thorlabs</td><td>다양한</td><td>브레인 슬라이스 레코딩 작업 공간</td></tr><tr><td>광학 테이블 w/브레드보드</td><td>Thorlabs</td><td>SDA7590</td><td>Brain Slice 녹음 작업 공간</td></tr><tr><td>PDLO</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P0671</td><td>HD-MEA 코팅, Brain Slice 녹음 작업 공간</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 100배&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>15140-122년&nbsp;</td><td>CDI 상업 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>TipONE</td><td>S1120-8810</td><td>Brain Slice Recording Workspace</td></tr><tr><td>Pipettors&nbsp;</td><td>모듬</td><td>모듬</td> 모<td>듬</td></tr><tr><td>플래티넘 앵커</td><td>CUSTOM</td><td></td><td>CUSTOM Brain Slice 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>모듬</td> 모<td>듬</td><td>Brain Slice 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>펌프</td><td>MasterFlex</td><td>78018-22</td><td>Brain Slice 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>면도날</td><td>Apollo</td><td>10179960</td><td>Brain Preparation Workspace</td></tr><tr><td>참조 전극 세포 배양 캡</td><td>CUSTOM</td><td>CUSTOM</td><td>Human iPSC 기록 작업 공간; 맞춤형 설계 3D 프린터 디자인, 요청 시 사용 가능</td></tr><tr><td>고무 피펫 전구</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>292000205</td><td>Brain Slice 준비 작업 공간, Brain Slice 기록 작업 공간</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL</td><td>모듬</td> 모<td>듬</td><td></td></tr><tr><td>Slice Recovery Chamber</td><td>CUSTOM CUSTOM</td><td></td><td>Brain Slice 복구 작업 공간; 맞춤형 3D 프린터 디자인, 요청 시 제공</td></tr><tr><td>주걱</td><td>ISOLAB</td><td>047.06.150</td><td>뇌 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>84100-1KG</td><td>솔루션 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>슈퍼 접착제</td><td>UHU</td><td>358221</td><td>뇌 슬라이스 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>수술 가위</td><td>Peters Instruments</td><td>BC 344</td><td>뇌 추출 작업 공간</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기&nbsp;</td><td>다양한</td><td>모듬</td><td>모듬</td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td>BrainXell 상업 공급 프로토콜</td></tr><tr><td>티슈 페이</td>퍼 <td>일반</td><td>일반</td><td>뇌 추출 작업 공간</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>07050&nbsp;</td><td>CDI 상업 공급업체 프로토콜</td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>Olympus</td><td>CUSTOM</td><td>이미징 작업 공간; 사용자 정의 사양 및 수정</td></tr><tr><td>사항: Vacusip</td><td>Integra</td><td>159010</td>, <td>Brain Slice Recording Workspace</td></tr>, <tr><td>Vibratome</td>, <td>Leica, VT1200s</td><td></td>, <td>Brain Slice Preparation Workspace; 포함사항: 검체 플레이트, 버퍼 트레이, 얼음 트레이, 시편 플레이트 고정 도구, 비브라톰 블레이드 조정 도구</td></tr><tr><td>비브라톰 블레이드</td><td>Personna</td><td>N/A</td><td>Brain Slice 준비 작업 공간</td></tr><tr><td>수조</td><td>Lauda</td><td>L000595</td><td>Brain Slice 복구 작업 공간</td></tr></tbody></table>

cmos 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 multimodal large-scale neuronal ensemble dynamics 기록 및 분석

Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array

대규모 뉴런 네트워크와 복잡한 분산 미세 회로는 시공간 뉴런 활동 패턴에서 나타나는 지각, 인지 및 행동을 생성하는 데 필수적입니다. 상호 연결된 뉴런 앙상블의 작용 그룹에서 발생하는 이러한 동적 패턴은 다중 스케일 신경 정보를 처리하고 코딩하기 위한 정확한 계산을 용이하게 하여 더 높은 뇌 기능을 유도합니다. 이러한 복잡성의 기저에 있는 신경 역학의 계산 원리를 조사하고 건강과 질병에 대한 생물학적 과정의 다중 스케일 영향을 조사하기 위해 대규모 동시 기록이 중요한 도구가 되었습니다. 여기에서 고밀도 미세전극 어레이(HD-MEA)는 생체 외 쥐 뇌 절편의 해마 및 후각 전구 회로와 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 체외 세포 배양에서 얻은 신경 네트워크의 두 가지 신경 역학 방식을 연구하는 데 사용됩니다. 4096개의 미세전극이 있는 HD-MEA 플랫폼은 높은 시공간 분해능에서 동시에 수천 개의 신경 앙상블에서 세포 외 발화 패턴을 비침습적, 다중 사이트, 무표지 기록할 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 단일/다중 장치 스파이킹 활동 패턴 및 국부장 전위 진동을 포함한 여러 전기생리학적 네트워크 전반의 특징을 특성화할 수 있습니다. 이러한 다차원 신경 데이터를 면밀히 조사하기 위해 기계 학습 알고리즘, 자동 이벤트 감지 및 분류, 그래프 이론 및 기타 고급 분석을 통합하는 여러 계산 도구를 개발했습니다. 이 플랫폼으로 이러한 계산 파이프라인을 보완함으로써 셀 어셈블리에서 네트워크에 이르기까지 대규모, 다중 스케일 및 다중 모드 역학을 연구하기 위한 방법론을 제공합니다. 이것은 잠재적으로 건강과 질병의 복잡한 뇌 기능과 인지 과정에 대한 우리의 이해를 발전시킬 수 있습니다. 오픈 사이언스에 대한 헌신과 대규모 계산 신경 역학에 대한 통찰력은 뇌에서 영감을 받은 모델링, 뉴로모픽 컴퓨팅 및 신경 학습 알고리즘을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 손상된 대규모 신경 계산과 상호 연결된 미세 회로 역학의 기본 메커니즘을 이해하면 특정 바이오마커를 식별하여 신경 장애에 대한 보다 정확한 진단 도구 및 표적 치료법을 위한 길을 열 수 있습니다.

다중 모델 시공간 매핑 및 진동 발사 특징 추출 동적 신경 앙상블에서 나타난 네트워크 전반의 LFP 및 스파이크 이벤트를 정량화하기 위해 HC 및 OB 회로와 인간 iPSC 네트워크에서 동기식 대규모 발화 패턴을 조사했습니다. 3.2 단계로부터 기록된 뇌 절편 회로와 3.3 단계로부터 기록된 iPSC 네트워크는 프로토콜의 4.1-4.2 단계에 따라 분석되었다. 먼저, 기록된 모든 데이터 세트에 대해 이벤트 감지 및 노이즈 제거가 수행되었으며 회로 사양에 따라 지역적으로 해결되었습니다. 다음으로, 평균 대규모 LFP 및 스파이크 발사 패턴의 지형학적 의사 색상 공간 매핑, 감지된 이벤트의 래스터그램 및 필터링된 파형의 대표적인 5-s 트레이스를 표시했습니다(그림 3 A-I). 대규모 LFP 및 스파이크 발화 속도 패턴의 지형학적 유사 색상 매핑은 HC(그림 3A), OB(그림 3B) 및 인간 iPSC 신경 네트워크(그림 3C)의 현미경으로 캡처된 광학 이미지에 오버레이되었습니다. 이를 통해 개별 회로 및 네트워크 기반 진동 패턴과 응답을 조사할 수 있습니다. HC 및 OB 래스터그램에는 HC 회로의 DG, Hilus, CA3, CA1, EC 및 PC 계층과 OB 네트워크의 ONL, OCx, GL, PL 및 GCL 계층에 대해 60초 시간 빈에 걸쳐 정렬된 감지된 LFP 이벤트 수가 포함됩니다(그림 3D,E). 인간 iPSC 래스터그램은 20초 시간 빈에 걸쳐 상호 연결된 배양 네트워크의 동기 감지 스파이크 이벤트를 표시합니다(그림 3G). 다음으로, 대규모 HD-MEA 기록 부위의 5s 대표 이벤트 트레이스는 HC(즉, CA3에서 선택된 전극)(그림 3G) 및 OB(즉, GL에서 선택된 전극)(그림 3H) 회로에서 기록된 다양한 진동 주파수와 어레이에서 선택된 4개의 활성 전극에서 인간 iPSC 네트워크의 다중 단위 스파이크 파열 활동을 보여줍니다(그림 3I)). 이러한 예시적인 신호들은 대역통과 필터링된 δ, θ, β 및 γ 주파수 대역들을 갖는 저주파 LFP 발진(1-100Hz)을 포함하는 생체신호 시그니처를 보여주고; 날카로운 파동 리플 (SWR) (140-220 Hz); 및 고주파 단일 및 MUA(300-3500Hz). 마지막으로, 전력 스펙트럼 밀도(PSD) 분석을 사용하여 HD-MEA에서 기록된 상호 연결된 HC 및 OB 회로에서 특정 발진 대역의 전력 크기를 동시에 정량화했습니다(그림 3J,K).
멀티모달 네트워크 전반의 기능성 커넥톰 동시 활성 뉴런 앙상블의 동시 발사 패턴으로부터 다층 신경망의 대규모 연결을 추론하기 위해, 검출된 이벤트에서 활성 전극 쌍 간의 교차 공분산은 프로토콜의 4.2.6단계에 따라 계산되었습니다. 여기서, 상관 계수는 HC 및 OB 회로의 레이어를 기반으로 정렬되거나 iPSC 네트워크에서 정렬되지 않은 후 대칭 행렬에 저장되었습니다. HC 및 OB 회로의 기능적 커넥톰은 다변량 Granger 인과 관계 및 지시 전달 함수(DTF)를 적용하여 한 시계열이 다른 시계열에 미치는 영향을 정량화하고 별개의 네트워크에서 상관 링크 내의 방향 정보 흐름을 평가하여 생성되었습니다. HC(그림 4A) 및 OB(그림 4B)의 커넥톰 매핑 및 네트워크 시각화는 Gephi 프로그램 9.2 버전(https://gephi.org)을 사용하여 수행되었습니다. HC 및 OB 브레인 슬라이스 회로를 비교하기 위해 기능 링크에 유사한 매개 변수 제약 조건을 배치하고 감지된 LFP 이벤트의 기능적 연결성을 100초 동안 설명했습니다. 노드는 각도 강도에 따라 크기가 조정되며, 노드 색상은 레이어를 나타내고 링크 색상은 레이어 내 및 레이어 간 연결을 식별합니다. 인간 iPSC 네트워크의 기능적 커넥톰은 공간 시간 필터(STF) 및 거리 종속 대기 시간 임계값(DdLT)을 적용하여 생성되었으며, 필터링되고 정규화된 교차 상관 히스토그램(FNCCH) 분석을 적용하여 중요한 링크의 선택을 향상시키고 의미 있는 연결의 식별을 개선했습니다. Gephi를 사용하여 수행된 전체 HD-MEA 칩(그림 4C) 시각화에서 인간 iPSC 네트워크의 커넥톰 매핑. 노드 색상은 흥분성 또는 억제성 입력을 나타내고 링크 색상은 연결을 식별합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig01v2.jpg"> 그림 1: 대규모 HD-MEA의 실험 및 계산 플랫폼 개요. (A) HC, OB 및 인간 iPSC 신경 회로 및 네트워크에서 신경 역학을 캡처하기 위해 CMOS 기반 HD-MEA로 구현된 다중 모드 바이오 하이브리드 신경 전자 플랫폼의 등각 투영 개략도 표현. (B) HC 및 OB 슬라이스를 얻기 위한 마우스 뇌 슬라이싱 및 작업 환경에 대한 개략적인 워크플로. (C) 추출된 세포외 파형과 중첩된 전체 HC 및 OB 슬라이스로부터 동시에 기록된 대규모 소성 패턴의 지형학적 표현이 슬라이스 광학 이미지. (D) 인간으로부터 얻은 iPSC 신경 네트워크의 개략도. (E) HD-MEA 칩(왼쪽)에서 전체 인간 신경 네트워크의 세포 c-fos 및 체세포/수지상 MAP-2를 전체 평균 발사 활동 맵(오른쪽)과 일치시키는 형광 현미경 사진. (F) HD-MEA의 대규모 기록에서 얻은 다차원 신경 데이터를 분석하기 위한 고급 데이터 분석, 연결 매핑 및 AI 기계 학습 도구를 포함한 계산 프레임워크. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig02v2.jpg"> 그림 2: 생체 외 뇌 절편 및 체외 인간 iPSC 배양 준비 및 기록 작업 공간의 레이아웃. (A) HC 및 OB 슬라이스를 준비하기 위한 설정을 보여주는 개략적인 워크플로우로, 각 작업 공간에 필요한 도구와 장비가 포함되어 있습니다. (B) 필요한 도구 및 장치를 포함한 인간 iPSC 배양 준비를 위한 개략도. 전체 재료 목록은 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 단계 및 재료 목차에 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig03v2.jpg"> 그림 3: 네트워크 동역학의 시공간 패턴 매핑 및 추출. (A-C) 평균 LFP 및 스파이크 속도 공간 맵, 5분 동안 계산되어 현미경 광 이미지에 겹쳐집니다. (D-F) 60초 데이터 하위 샘플에서 감지되고 노이즈가 제거된 LFP 이벤트와 20초 데이터 하위 샘플에서 스파이크를 나타내는 래스터 플롯입니다. (지-I) 래스터 플롯 데이터 하위 샘플(래스터 플롯에서 빨간색으로 강조 표시)의 5초 세그먼트에서 대표 파형 추적 추출, 원시 LFP 진동 대역(1-100Hz)으로 표시됨; δ(1-4Hz), θ(5-12Hz), β(13-35Hz) 및 γ(35-100Hz) 주파수 대역; SWR(140-220Hz); 및 고주파 단일 및 MUA 스파이크(300-3500Hz). (J,K) 빠르고 느린 진동 LFP(1-100Hz) 및 SWR(140-220Hz)의 전력 스펙트럼 밀도 맵. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig04v2.jpg"> 그림 4: 멀티모달 네트워크 전반의 기능적 커넥톰의 구성. (A-C) Gephi 맵은 노드 기능 연결을 보여주며, 여기서 노드는 예제 색상 막대 범례(아래) 중 하나에 해당하고 링크(또는 가장자리)는 연결 노드와 일치하도록 음영 처리됩니다. (A) HC, (B) OB 및 (C) iPSC 레이어에 대한 범례 예가 64 x 64 배열에 표시됩니다. HC 및 OB 레이어는 시각화를 위해 표시되는 노드 및 링크의 수를 효과적으로 줄이기 위해 100초 시간 빈에 걸쳐 플로팅됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: iPSC 신경 세포 배양을 위한 뇌 절편 준비 및 배지용 솔루션. (A) 생체 외 뇌 절편 준비를 위한 고자당 절단 용액. (B) 생체 외 뇌 절편 준비 및 기록을 위한 aCSF 기록 용액. (씨디) 인간 신경 iPSC 배지 프로토콜, 여기서 (C)는 세포 해동, HD-MEA 칩 코팅 및 배양된 HD-MEA 유지에 사용되는 BrainPhys 완전 배지이고, (D) HD-MEA 세포 도금에 사용되는 도팅 배지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 일반적인 HD-MEA 레코딩 획득 문제 해결. HD-MEA 칩, 기록 플랫폼, 시스템 노이즈 및 소프트웨어와 관련된 일반적인 문제, 잠재적 원인 및 문제 해결 솔루션 목록입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from ...

우리의 연구는 신경 통신 및 대규모 네트워크를 디코딩하기 위한 고밀도 CMOS 기반 미세 전극 어레이를 통합하여 신경 기술의 최전선을 탐구합니다. 우리는 여러 척도에 걸친 신경 정보가 어떻게 고유하고 세부적으로 인코딩되는지에 대한 답을 제공하여 건강과 질병의 뇌 기능 및 기능 장애에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다. 신경 앙상블 연구의 복잡한 영역을 탐색하면서 우리는 뇌 활동 중에 정확한 신호 분해능을 달성하고 CMOS 기반 미세 전극 어레이의 생체 적합성을 보장하는 것과 같은 과제에 직면해 있습니다.이러한 장애물은 다중 모드 기록을 사용하여 신경 상호 작용의 풍부한 태피스트리를 정확하게 캡처하고 해석하는 데 중추적인 역할을 합니다. 우리의 연구는 신경 과학의 중요한 격차, 즉 높은 공간 및 시간 해상도로 더 큰 규모의 신경 앙상블의 역학을 다시 코딩하고 분석하는 포괄적인 방법의 부족을 해결합니다. 이 격차는 복잡한 뇌 네트워크와 건강과 질병의 기능에 대한 우리의 이해를 방해합니다.당사의 프로토콜은 해마, 후각 전구 및 인간 IPSC 유래 뉴런 전반에 걸쳐 멀티모달, 레이블 없는 고해상도 녹음을 가능하게 하여 다양한 실험을 위한 다목적 도구를 제공합니다. 이 독특한 접근 방식은 신경 역학에 대한 비할 데 없는 통찰력을 촉진하여 다양한 뇌 영역과 모델 시스템 간의 연구 격차를 해소하고 신경 기능 및 장애에 대한 이해를 크게 발전시킵니다. 우리 연구실의 향후 노력은 유전자에서 네트워크에 이르는 신경 계산 및 역학을 심층적으로 연구하여 건강과 질병의 분자 및 기능 서명을 연결하는 것을 목표로 합니다.첨단 생체 전자 공학 및 신경 기술을 통해 신경 가소성, 후각 코딩, AI 개발, 새로운 치료법 및 뇌 기계 인터페이스를 위한 기억력 향상 전략에 중점을 둘 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

대뇌 피질의 임계 상태 역학 지표의 연결 눈사태, 즉 스케일 - 불변량 spatio - 관자놀이 활동 파열을 연구하는 강력한 방법입니다. 눈사태 정확하게 제어 조건 하에서 평면 통합 다중 전극 어레이 (MEA)와 활동의 장기 측정을 허용 교양 피질의 표면 레이어를 개발에 자발적으로 등장.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

anesthetized 쥐의 실리콘 프로브를 사용하는의 연결 활동의 세포외 녹음이 설명됩니다. 이 기법은 동시에 100 개 이상의 뉴런에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 정보를 얻을 수 있습니다. 그것은 여러 지역의 회로에의 연결을 ensembles 역학에 대한 단세포 해상도 정보를 제공합니다.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

우리는 대규모 다중 단일 단위 기록 및 실리콘 프로브와 설치류 동물 행동은 현지 필드 가능성에 대한 방법을 설명합니다. 드라이브 제조, 드라이브 및 프로브 주입 공정에 프로브 첨부 파일은 쉽게 복제에 대한 충분한 세부 사항에 그림하고 있습니다.

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

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깨어있는 행동을 한 쥐의 만성 신경 녹음을위한 마이크로 드라이브 배열의 건설

이 연구는 두뇌, 심전도, 근, 로컬 필드 전위의 동시 녹음 하 고 자유롭게 움직이는 쥐의 신호를 호흡 하는 방법을 소개 합니다. 이 기법을 실험 비용 절감 및 데이터 분석을 단순화, 뇌 및 말 초 기관 간의 상호 작용의 이해에 기여할 것입니다.

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이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

이 프로토콜은 여러 뇌 영역에서마우스(Mus musculus)및 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)의 만성 및 급성 생체 내 전기 생리학적 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전기 전극 어레이를 구성하는 절차를 설명합니다. 미전지어 어레이 이식에 대한 원시 탄소 섬유를 구입한 후 각 단계는 미세 전기 전하 배열 구조에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

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우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.

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여기에서는 상보적 금속 산화물 반도체 고밀도 미세전극 어레이 시스템(CMOS-HD-MEAs)을 사용하여 생체 외 뇌 절편에서 발작과 같은 활동을 기록하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

Complementary Metal-Oxide-Semiconductor High-Density Microelectrode Array System을 사용한 급성 뇌 절편에서 고품질 발작 유사 활동

여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

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배우세요 고밀도 CMOS 미세전극 어레이를 활용한 대규모 신경 집합체 다중모달 기록 및 분석 방법입니다. 이 기술은 해마와 후각구 회로 및 인간 iPSC 유래 신경망의 시공간 활동을 고해상도로 포착하여 신경 기능과 장애 메커니즘 이해에 기여합니다.

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