Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

이 실험의 목표는 건강한 뇌 활동의 자기 조직화를 통해 대뇌피질의 임계 상태 역학의 특징인 뉴런 눈사태(neuronal avalanches)를 연구하는 것입니다. 이것은 코로나 층상 피질 절편과 중뇌 절편을 결합하여 이루어질 수 있으며, 이는 대뇌 피질에 발달적으로 중요한 도파민 입력을 제공합니다. 두 번째 단계로, Cortex 중뇌 공동 배양은 다중 전극 어레이에서 성장하며, 이를 통해 배양 내 신경 세포 활동을 다중 부위 자극하고 기록할 수 있습니다.

다음으로, 우리는 공동 배양이 평평해지고, 확장되고, 일반 공기와 배양에 노출되어 배양을 순환하는 맞춤형으로 설계된 인큐베이터에서 처음 1-2주 동안 MEA 표면에 부착되도록 합니다. 시공간 국소장 전위의 자발적인 자기 조직화가 뉴런 눈사태로 폭발하는 것을 보여주는 유체 결과가 얻어집니다. MEA 기록 및 오프라인 눈사태 분석을 기반으로 눈사태 크기에서 전력 법칙을 식별합니다.

disassociated cultures와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시스템, 신경 과학 측면입니다. 우리는 많은 뇌 영역을 함께 공동 배양할 수 있으며, 이러한 다중 영역 배양은 피질층 및 투영 시스템과 같은 큰 규모에서 올바른 뇌 조직을 구축합니다. 이 기술의 응용은 뉴로노 눈사태에 대한 연구를 넘어 확장됩니다.

예를 들어, 우리는 정밀하게 제어된 체외 조건 하에서 네트워크 수준에서 반응하는 자극을 연구할 수 있습니다. 혈장 트롬빈 혼합물의 적절한 적용과 MEA에서 조직의 위치를 파악하기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이러한 단계를 수행하려면 적절한 타이밍, 적절한 온도 구배가 필요하며 섬세한 MEA 표면을 직접 건드리지 않아야 합니다.

녹음을 위해 멸균 밀봉 가능한 유리 챔버를 준비하려면 먼저 스레드 바닥에서 약 2mm 떨어진 테프론 플라스틱 캡으로 나사산 유리 실린더를 절단합니다. 이는 안전하고 단단한 배양실 폐쇄에 필요합니다. 그런 다음 유리 링을 물로 세 번 헹구고 200 프루프 에틸 알코올에서 5 분 동안 끓여서 유리 링을 청소합니다.

건조하려면 유리 링을 MEA 표면에 부착하기 위해 실리콘 용액이 필요합니다. 셀 가드 180 4 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 15밀리리터의 부품 A와 B를 철저히 혼합합니다. 그런 다음 15분 동안 앉아서 기포를 제거합니다.

용액을 1mL Eloqua로 분리하고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이제 작은 게이지 바늘로 주사기에 섭씨 23도의 실리콘 1ml를 넣고 유리 링의 연마되지 않은 절단면에 적용하여 유리 링을 MEA에 붙입니다. 그런 다음 유리 링을 MEA의 중앙에 놓고 더 강력한 밀봉을 위해 링 외부에 추가 실리콘 층을 적용합니다.

핫 플레이트에서 약 섭씨 60도에서 1-2시간 동안 경화시킵니다. 다음으로, 마지막 헹굼을 위해 70% 알코올로 3회 헹구는 것보다 탈이온수로 3회 헹궈 라미나 플로우 후드 아래의 MEA 챔버 및 챔버 캡을 살균합니다. 챔버를 알코올에 10분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 챔버와 캡 내부를 10분 동안 자외선에 노출시킵니다. 섭씨 120도에서 45분 동안 오토클레이브합니다. 멸균이 완료되면 건조시키십시오.

이제 배양 챔버 내부의 MEA 표면을 폴리 D 라이신으로 코팅합니다. 이 실험에 사용된 새로운 meas는 다소 지방질이므로 반복적인 물방울에 의해 코팅됩니다. 전극 그리드에서 용액의 흡인.

캡을 부착하여 보관 및 향후 사용을 위해 MEA 챔버를 밀봉합니다. 이 절차는 약 12개의 공동 배양을 위한 피질 및 VTA 절편을 산출하며 건강한 출생 후 1-2일 동물을 사용하여 멸균 상태에서 얇은 판 흐름 후드 내에서 수행해야 하며 조직 채취를 위한 총 시간은 1시간 미만이어야 합니다. 참수 후 먼저 두피에서 피부를 제거하기 위해 두 개의 측면 가위 절단을 하여 뇌 제거를 시작합니다.

두개골을 제거한 다음 미세한 눈 가위를 사용하여 잘라내고, 피질 소뇌 접합부에서 한 번의 관상 절개에 하나의 시상 정중선을 절단합니다. 이 4개의 두개골 플랩을 모두 뒤집어 뇌를 드러냅니다. 다음으로 빽빽한 주걱으로 후각구를 정면으로 자릅니다.

그런 다음 주걱을 뇌 아래에서 분기별로 전진시킵니다. 두개골 밖으로 뇌를 부드럽게 들어 올려 차가운 시선으로 미끄러지게 합니다. 급속 냉각 및 임시 보관을 위한 솔루션.

두 개의 뇌에 대해 위의 절차를 반복합니다. VTA 조직을 얻으려면 뇌를 멸균된 건조 페트리 접시에 옮깁니다. 작은 주걱을 사용하여 각 뇌를 약 1cm 옆으로 부드럽게 밀어 과도한 액체를 제거합니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 소뇌 수준에서 관상 수직 절단을 하여 뇌간을 제거합니다. 이제 절단 절차 중에 뇌의 기계적 안정화를 위해 한천 블록을 장착 디스크에 붙입니다. 그런 다음 디스크의 한천 블록 앞에 몇 밀리미터 떨어진 얇은 슈퍼 접착제 선을 놓되 작은 주걱을 사용하여 접착제가 한천에 닿지 않도록 합니다.

각 뇌 전두엽을 아래로 옮기고 장착합니다. 정면 기둥이 장착 디스크에 접착되어 있고 복부 측면이 접착제 잔여물 없이 한천에 닿는지 확인합니다. 이것은 절단 중 적절한 기계적 안정화를 보장하고 절단 조각을 쉽게 들어 올릴 수 있습니다.

다음으로, 장착된 브레인이 있는 마운팅 디스크를 차가운 시선 용액으로 채워진 비브람 트레이에 조심스럽게 담그고 고정합니다. 그런 다음 세심하게 세척한 면도날을 절단하고, 흡입 전구가 있는 거꾸로 된 파스타 피펫을 사용하여 가장 높은 진동 주파수와 상대적으로 낮은 전진 속도로 중뇌의 400마이크로미터 두께의 관상 절편을 모아 VTA가 포함된 슬라이스를 모아 피질 절편을 위한 멸균 냉각 시선 용액으로 채워진 35 x 10mm 페트리 접시로 옮깁니다. 앞의 슬라이싱 단계를 반복하되, 피질과 소뇌 사이에 수직 절단을 적용하고 전두엽을 위로 향하게 하여 4개의 뇌를 장착한다.

선조체 수준에서 시작하여 350마이크로미터 두께의 약 3개의 코로나 조각을 수집합니다. 이제 부러진 면도날로 만든 마이크로 나이프를 사용하여 실체 현미경으로 VTA가 포함된 전두엽 피질과 중뇌 영역의 약 2mm 너비의 관상 절편을 해부합니다. 차가운 시선 용액으로 채워진 작은 접시에 조직 섹션을 별도로 수집합니다.

MEA 챔버 첫 번째 위치에 조직을 장착하기 시작하려면 전극 어레이에 초점을 맞춘 실체 현미경 아래 실온에서 MEA를 장착합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 플라즈마 방울을 깨끗하고 먼지가 없는 멸균 전극 어레이 매트릭스의 중앙에 놓습니다. 작은 주걱을 사용하여 피질과 VTA 절편을 혈장 액적에 조심스럽게 밀어 넣습니다.

이제 MEA를 냉각판에 놓고 보기의 초점을 다시 맞춥니다. 혈장 방울에 25마이크로리터의 트롬빈을 추가하기 전에 약 15초 동안 식히십시오. 그런 다음 트롬빈 피펫 팁을 사용하여 혈장 트롬빈 혼합물을 MEA를 가로질러 작은 원을 그리며 조심스럽게 펴 바릅니다.

부서지기 쉬운 전극 어레이를 직접 만지지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 어레이의 두 번째 전극 행을 따라 등쪽 경계가 있는 어레이에 피질을 부드럽게 배치합니다. 이런 식으로, 전개되는 표면 레이어는 결국 어레이의 나머지 부분을 덮게 됩니다.

그런 다음 VTA를 피질 섹션의 복부 경계에 인접하게 놓습니다. 이제 높은 습도를 유지하기 위해 MEA 챔버를 덮고 느슨하게 닫습니다. MEA 배양 어셈블리를 실온에서 후드 내부에 약 6분 동안 두어 혈장 트롬빈, 응고, 의기양양함을 허용합니다.

한편, 절차를 반복하여 세 가지 배양을 더 준비합니다. 다음으로, 작은 액적에서 25 x 5 8 게이지 바늘이 있는 1cc 주사기를 사용하여 600마이크로리터의 배양 배지를 배양 챔버에 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 MEA 챔버를 단단히 닫고 MEA 배양 어셈블리를 인큐베이터 내부의 흔들리는 보관 트레이에 놓습니다.

이틀 후, 체외에서 10마이크로리터의 유사분열 억제제를 첨가합니다. 그런 다음 체외 4일과 그 후 4일마다 배양 배지를 60% 새로 고칩니다. 정상적인 성장 중에는 배양이 상당히 평평해지고 배쪽으로 약간 확장됩니다.

표재성 피질층의 발달로 인해 건강한 배양은 명시야의 불투명한 회색 조직으로 식별됩니다. 반대로, 밝은 반사 소포는 배양을 준비한 후 약 10-12일이 지나면 죽은 퇴행성 세포의 특징으로, 기록하고 자극할 준비가 됩니다. 기록 세션을 시작하기 위해 MEA는 보관 트레이에서 기록 헤드 스테이지로 옮겨집니다.

국소 자기장 전위 또는 LFP를 기록하려면 1에서 200Hz까지의 대역 통과 필터를 사용합니다. 다단위 활성은 300-3000Hz의 대역 통과 필터를 사용하여 연구할 수도 있습니다. 건강한 자발적 활동은 다양한 크기와 지속 시간의 폭발로 발생하는 경향이 있습니다.

LFP와 단위 활동 간의 관계를 연구하기 위해 LFP의 스파이크 트리거 평균을 계산할 수 있습니다. 이러한 피질 배양의 경우, 음의 LFP 편향은 자극 유발 활동을 기록하기 위해 뉴런 스파이킹과 상관관계가 있습니다. 첫째, 자극의 시간적 파형과 진폭은 자극 생성기를 제어하는 소프트웨어로 지정됩니다.

유용한 자극 패러다임은 바이폴라 구형파를 갖는 전류 제어 전하 중립 단일 충격입니다. 다음으로, 자극을 전달하는 데 사용할 전극을 선택합니다. LFP 반응을 유발하는 전형적인 자극은 자발적인 활동 폭발과 유사하게 보입니다.

블랭킹 회로는 자극 중에 증폭기를 분리하여 자극 아티팩트를 줄이고 증폭기 포화를 방지합니다. 자극 전극은 자극에서 회복하는 데 몇 초가 걸리므로 반응 활동을 기록하는 데 사용할 수 없습니다. MEA에서 은 한 전극에서 활성을 보이는 시공간 클러스터에서 나타나는 경향이 있으며 종종 다른 부위에서의 활동을 동반합니다.

동시에, 이러한 활동 기간 동안 LFP의 일반적인 파형은 각 클러스터에 대해 몇 초 간격으로 발생하는 3개의 클러스터를 오버 플롯하여 여기에 표시됩니다. 여러 개의 음의 sd의 임계치를 교차하는 NLFP 피크를 추출할 때 1초 이내에 여러 전극에서 음의 LFP 편향을 볼 수 있으며, NLFP 피크 시간 형태의 활성은 다양한 전극에서 점 열이 거의 일치하는 NPS를 나타내는 Rasta에서 편리하게 시각화됩니다. 이 활동의 시공간 조직은 다소 복잡합니다.

낮은 시간 해상도에서 다소 균질하게 보이는 열은 더 높은 시간 해상도에서 별도의 클러스터로 구성됩니다. 공간, GEOTEMPORAL 및 LFP 클러스터의 출현은 피질 네트워크에서 고도로 조직화되어 있습니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 이 조직은 뉴런 눈사태에 대한 변형체를 가지고 있습니다.

이는 주어진 시간 해상도에서 클러스터 크기의 확률을 계산하여 입증됩니다. Delta T.Here 클러스터는 동일 또는 연속적인 시간 빈에서 발생하는 NL FPS로 구성되며, 이러한 클러스터의 크기가 클러스터당 총 NFPS 수 또는 클러스터당 통합 NLFP 진폭으로 표현될 때 클러스터 크기 분포는 지수가 마이너스 1.5에 가까운 멱법칙을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 세포의 자기 조직화를 연구하기 위해 뇌 조직을 주의 깊게 해부하고 다중 전극 어레이에서 배양을 성장시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이러한 방법은 또한 피질 네트워크에서 자발적 활동과 자극 유발 활동 사이의 관계를 연구하는 데 사용되었습니다.