March 28th, 2025
이 보고서는 단세포 연쇄상구균 조류인 Penium margaritaceum을 배양하고 실험적으로 조작하는 데 사용되는 기본 방법을 설명합니다. 또한 단클론 항체 및 기타 형광 프로브를 사용한 라이브 셀 라벨링 및 주사 전자 현미경을 포함한 현미경 기반 이미징의 기본 프로토콜을 제공합니다.
우리의 연구는 세포 모양을 유지하고 외부 스트레스에 반응하는 세포벽의 역할에 중점을 둡니다. 우리는 살아있는 세포의 세포벽 구조를 이미징하기 위해 다양한 광학 현미경 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 기술을 사용하고 세포벽의 고해상도 이미징을 위해 전자 현미경을 사용합니다.
세포벽 역학을 강조하기 위해 특정 세포내 단백질을 발현하는 연쇄상생균 조류에 대한 형질전환된 세포주가 현재 부족합니다. 그런 다음 연구를 위해 항체 및 기타 형광 프로브를 사용해야 합니다. Penium의 세포벽은 다양한 형태의 비생물적 및 생물적 스트레스에 반응하며 이는 표현형 가소성으로 이어집니다. 우리는 세포벽 펙틴이 이 과정의 중요한 부분이라는 것을 발견했습니다. 단세포 표현형과 페늄으로 살아있는 세포 표지를 수행하는 능력은 식물 생물학자에게 세포벽의 구조와 발달을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다.
[강사] 시작하려면 Penium margaritaceum의 활발하게 성장하는 액체 세포 배양물 5밀리리터를 제거합니다. 15밀리리터 플라스틱 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 원심분리합니다. 상청액을 부은 후 펠릿을 신선한 WHM 5밀리리터에 재현탁합니다. 튜브 캡을 단단히 고정하고 튜브를 10초 동안 세게 흔들어 펠릿을 재현탁하고 세포벽 표면에서 세포외 고분자 물질을 제거합니다. 최종 세척 후, 펠릿을 신선한 WHM 1밀리리터에 재현탁한 다음 세포 현탁액 200마이크로리터 분취량을 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 미세 원심분리기에서 캡 튜브를 1000G에서 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡인하고 펠릿을 400마이크로리터의 신선한 WHM에 재현탁합니다. 다음으로, 희석된 단클론 항체 20마이크로리터를 세포 현탁액에 첨가하고 잘 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 튜브를 알루미늄 호일로 싸고 실험실 회전 장치에서 90분 동안 배양합니다. 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 펠릿을 500마이크로리터의 신선한 WHM에 재현탁한 후 10초 동안 소용돌이치게 합니다. 최종 원심분리 후, 펠릿을 400마이크로리터의 WHM에 재현탁시키고 8마이크로리터의 염소 항쥐 TRITC 또는 FITC를 첨가합니다. 마지막으로 펠릿을 100마이크로리터의 성장 배지에 재현탁합니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 이미징 준비가 될 때까지 알루미늄 호일로 싸십시오. JIM5 항체로 표지된 세포를 WHM에서 10배 희석합니다. 희석된 세포 현탁액 50마이크로리터 방울을 커버 슬립에 추가합니다. 세포가 부착되도록 어두운 곳에서 2분 동안 세포를 배양한 다음 WHM 1밀리리터를 조심스럽게 피펫팅하여 부착되지 않은 세포를 헹굽니다. 부착된 셀 위에 30마이크로리터의 WHM을 추가합니다. WHM에 30마이크로리터의 따뜻한 4% 아가로스를 물방울에 겹쳐 놓고 응고시킵니다. 페트리 접시의 샘플의 경우 아가로스 포매 세포를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 WHM을 추가합니다. 커버 슬립의 세포의 경우 커버 슬립을 뒤집고 WHM으로 채워진 함몰 슬라이드 위에 부드럽게 놓습니다. 준비된 세포를 형광 현미경에 장착합니다. 외부 램프를 설치하거나 현미경에 내장된 조명을 사용하여 세포 성장과 움직임을 지원합니다. 세포벽 확장을 추적하기 위해 TRITC 필터 세트를 사용하여 10-30분마다 이미지를 캡처합니다. 세척된 10-14일 된 세포 배양물 5밀리리터가 들어 있는 튜브를 준비합니다. 다음으로, 약 100마이크로리터의 0.75마이크로미터 형광 구슬을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 추가합니다. WHM 1밀리리터를 튜브에 피펫팅하고 세게 흔들어 비드를 재현탁시킵니다. 튜브를 10,000G에서 3분 동안 원심분리합니다. 최종 펠릿을 500마이크로리터의 WHM에 재현탁합니다. 다음으로, 12웰 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 WHM 배지를 피펫팅합니다. 억제제 또는 성장 조절제를 첨가하여 원하는 농도를 달성하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 10마이크로리터의 비드 용액을 넣고 다시 부드럽게 소용돌이치며 혼합한 다음 혼합하기 전에 세척된 세포 10마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 빛 아래에서 24시간 동안 배양합니다. 플레이트를 방해하지 않고 FITC 필터가 장착된 도립 형광 현미경에 놓습니다. 1밀리리터의 세포 현탁액을 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 튜브를 4,000G에서 1분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 펠릿이 들어 있는 튜브를 액체 질소에 담그거나 섭씨 영하 80도에서 얼립니다. 해동된 펠릿을 20마이크로리터의 WHM에 재현탁합니다. 조밀한 세포 현탁액 한 방울을 45 x 50mm 크기의 커버 슬립에 놓습니다. 샌드위치를 만들기 위해 드롭 위에 두 번째 덮개 슬립을 놓습니다. 샌드위치를 30초 동안 계속 눌러 세포를 파열시킵니다. 커버 슬립을 조심스럽게 분리하십시오. 커버 슬립 위에 WHM을 추가하여 파열된 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브에 세척하고 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 흰색 또는 약간 녹색 펠릿을 검사합니다. 세포벽을 포함하는 펠릿을 탈이온수에 재현탁합니다. 세포 파열 및 원심분리 후, 펠릿을 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기기 전에 100마이크로리터의 탈이온수에 재현탁합니다. 다음으로 캠브리지 스텁 표면에 탄소 테이프를 부착합니다. 재현탁된 세포벽 현탁액 5마이크로리터를 탄소 테이프에 피펫팅합니다. 팔라듐 타겟을 사용하여 밤새 건조시킨 후 50초 동안 스텁을 스퍼터링 코팅합니다. 2차 전자 검출기에서 10cm 떨어진 곳에 적절한 스폿 크기로 5킬로볼트에서 세포를 관찰합니다. P. margaritaceum의 세포벽을 항펙틴 단클론 항체로 표지한 결과 불규칙한 격자 패턴을 형성하는 칼슘 복합 섬유의 네트워크가 밝혀졌습니다. 펙틴은 세포 중심 또는 협부에 침착되어 오래된 펙틴을 극 쪽으로 밀어냈습니다. JIM7 표지는 높은 메틸 에스테르화 펙틴이 초기에 협부의 좁은 띠에서 분비되었음을 보여주었습니다. 아라비노갈락탄 단백질과 같은 세포벽의 다른 중합체는 단클론 항체 JIM13으로 검출되었습니다. 세포벽 밖에서 다량의 세포외 고분자 물질이 분비되어 활공과 세포 응집이 가능했습니다. 라벨링 기술을 통해 정량적 세포벽 및 확장 연구가 가능해졌으며 발달 이미징 접근 방식을 통합했습니다. 상관 구조 연구에 따르면 전형적인 펙틴 격자는 별개의 돌출부에서 외부로 끝나는 섬유 메쉬로 구성되어 있습니다. 고농도의 칼슘으로 처리하면 JIM5 표지 세포에서 관찰된 바와 같이 펙틴 격자가 불규칙한 침전물로 변형되었습니다. 칼슘 처리된 세포벽을 주사 전자 현미경으로 검사한 결과, 무질서한 펙틴 구조가 자세히 관찰되었습니다.
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본 연구는 단세포 녹조류 Penium margaritaceum의 세포벽 구조와 기능을 조사하여 다양한 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 반응에 초점을 맞추었습니다. 연구는 다양한 현미경 기술을 사용하여 세포벽 역학을 시각화하고 표현형 가소성에 관여하는 중요한 구성 요소를 식별합니다.
Microscopy-based immunocytochemical screening in Penium margaritaceum enables high-resolution analysis of plant cell wall dynamics under stress, supporting early-stage target validation in plant biotechnology. The unicellular model and quantitative imaging outputs facilitate mechanistic de-risking and predictive confidence for cell wall modification strategies. These protocols position R&D teams to interrogate cell wall responses with translational continuity from discovery to preclinical research.
These protocols integrate from early discovery through lead identification and preclinical validation in plant cell wall research pipelines.