미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

우리는 액체 생검을 통한 정밀 종양학 발전을 위해 고성능 CTC 분리 및 분석 방법 개발에 집중하고 있습니다. 현재 상업용 CTC 절연 플랫폼은 처리량과 효율이 낮습니다. 또한 생물학적 정보 복원이 제한되는 하위 분석 플랫폼과도 호환되지 않습니다.

본 연구는 마이크로플루이딕 CTC 격리 플랫폼을 사용하여 검출률을 크게 향상시킵니다. 또한 더 깊은 액체 생검 분석을 위해 희귀 세포 단일 세포 시퀀싱 칩을 적용합니다. 우선, 세척 후 재현탁된 스트렙타비딘 변형 자기 구슬 25마이크로리터를 1마이크로그램의 비오티닐화 EpCAM 항체가 들어있는 튜브에 피펫팅합니다.

혼합물을 분당 20회전으로 회전시키면서 40분간 배양하여 면역 자기 구슬을 준비합니다. 자석 랙을 사용해 구슬을 상청액에서 분리합니다. 상환액을 제거한 후, 구슬을 25마이크로리터의 격리 완충제에 다시 매립합니다.

피펫으로 1초에서 2초 이내에 20마이크로리터의 자기 비드 현탁액을 채취하여 기포가 생기지 않도록 합니다. 즉시 칩을 자석에 세로로 올려놓고 구슬이 방해받지 않고 5분간 가라앉도록 하세요. 혈액 샘플 4밀리리터를 주사기에 채취하여 공기 방울을 제거하세요.

칩의 입구와 출구를 액체로 밀봉해 기포를 제거한 후, 샘플 입구와 출구 튜브를 칩에 삽입하세요. 주사기 펌프를 사용해 시속 1.5밀리리터의 유량으로 샘플을 주입합니다. 샘플을 적재한 후, HB 칩에 60마이크로리터의 DPBS를 시간당 0.2밀리리터의 유량으로 주입하여 결합되지 않은 세포를 씻어냅니다.

자석을 제거하고 5% BSA 1.5밀리리터를 수동으로 주입해 칩을 세척하고 포획된 종양 세포를 방출하세요. 에탄올에 10% MPTS 용액을 준비하세요. 즉시 20마이크로리터의 용액을 HB 칩에 주입하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

HB 칩을 무수 에탄올로 한 번 씻고, 100도 섭씨에서 1시간 말립니다. 다음으로, 0.5밀리그램/밀리리터 농도로 에탄올에 GMBS 용액을 준비합니다. 칩을 37도까지 냉각한 후 GMBS 용액을 도입하고 배양합니다.

HB 칩을 두 번 증류수로 두 번 씻고, 그 다음에 DPBS로 두 번 헹구세요. 즉시 15마이크로그램/밀리리터의 스트렙타비딘을 HB 칩에 추가하고, 실온에서 1시간 또는 4도에서 하룻밤 배양하세요. 배양 후에는 HB 칩을 DPBS 식염수로 두 번 세척합니다.

이제 CD45 항체 버퍼를 0.2% BSA와 20마이크로그램/밀리리터 비오티닐화 CD45 항체를 DPBS에 첨가하여 최종 부피에 맞게 조절합니다. 백혈구 선택을 위해 CD45 항체 완충제 20마이크로리터를 HB 칩에 주입합니다. 상온에서 1시간 배양한 후 칩을 DPBS로 헹구세요.

HB 칩에 3%BSA와 0.05%의 Tween 20이 포함된 차단액을 첨가하세요. 준비된 샘플을 주사기로 흡인하여 기포가 없도록 하세요. 그 다음 칩의 입구와 출구를 액체로 밀봉하고, 입구와 출구 튜브를 칩에 연결하세요.

주사기 펌프를 사용해 시속 0.6밀리리터의 유량으로 샘플을 주입합니다. 칩 배출구에서 정제된 종양 세포를 수집하여 계수와 단일 세포 시퀀싱을 수행합니다. 0.5%F-68 용액 200마이크로리터를 DPBS로 준비하여 칩 입구에 넣습니다.

칩을 잡은 채로 물욕 초음파 검사를 하세요. 미세공공성 영역에 기포가 보이면 30초간 초음파 검사를 계속하여 이중 웰에서 기포를 제거합니다. 다음으로, 60,000개의 듀얼웰이 포함된 칩에 200마이크로리터의 종양 세포 현탁액을 주입합니다.

칩 내 셀 현탁액을 부드럽게 위아래로 두 번 피펫팅하세요. 그 후 다시 탈색 셰이커에 올려 포획되지 않은 세포를 다시 떠올리고 가라앉히도록 5분간 두세요. 이제 200마이크로리터의 DPBS와 0.5% F-68 용액을 입구를 통해 추가하고 출구에서 흡입하세요.

바코드가 있는 비드 서스펜션을 다시 현지한 후, 즉시 칩 인렛에 200마이크로리터의 서스펜션을 주입하고 분당 10회전으로 20초간 흔듭니다. 비드 현탁액을 두 번 부드럽게 피펫팅한 후 다시 셰이커에 올려놓으세요. 이제 바코드 비드 현탁액을 출구에서 빼내고, 20X Tris-EDTA 200마이크로리터와 50밀리몰라 디티오트레이톨 용액을 피펫팅합니다.

액체를 출구에서 빼내세요. 세포 용해와 MRNA 포집을 위해 칩 입구에 세포 용해 버퍼 200마이크로리터를 천천히 첨가합니다. 즉시 200마이크로리터의 미네랄 오일을 추가하여 이중 우물을 밀봉하세요.

칩 출구에서 폐기물 저장소로 흐르는 용액을 제거하세요. 그 후 칩을 수평으로 놓고 실온에서 5분간 두세요. 천천히 6X 식염수 시트레이트 나트륨 용액 200마이크로리터를 흡입구에 추가하세요.

폐액을 제거하고 칩 출구에서 남은 용액을 흡입하세요. 6X 식염수 시트레이트 나트륨 200마이크로리터를 천천히 추가해 칩을 채우세요. 자석을 칩 표면 근처에 대고 천천히 흡입구에서 출구로 옮겨 바코드가 새겨진 구슬을 모으세요.

6X 식염수 시트레이트가 들어있는 원심분리관에 용액과 구슬을 빠르게 흡입합니다. 바코드 구슬을 6X 식염수 시트레이트 나트륨 200마이크로리터로 세 번 세척한 뒤, 역전사 버퍼로 한 번 세척합니다. 자기장 하에서 면역자기 구슬의 균일한 분포가 관찰되었고, 자기 제거 후 잔여 구슬이 최소화되어 성공적으로 방출되었습니다.

CTC 분리 칩은 1밀리리터와 10밀리리터 샘플 모두에서 종양 세포를 효율적으로 포획했습니다. 정제 칩의 추가로 종양 세포 순도가 더욱 향상되었습니다. LNCaP 세포가 거의 수치가 없는 말초혈액 샘플에서는 CTC 분류 시스템이 높은 포획 효율과 순도를 유지했습니다.

단일 셀 바코드 칩은 85.6%의 셀과 95.7%의 바코드 비드 점유율을 달성하여 81.9%의 쌍 비율을 달성했습니다. 부하된 셀 수를 늘리면 포획 효율을 떨어뜨리지 않으면서 마이크로 웰 점유율이 향상되었습니다. 통합 CTC 분리 및 단일 세포 시퀀싱 워크플로우는 매우 순도의 종양 세포를 생성하고 원래의 종양 세포 비율을 정확히 유지했습니다. TSNE 분석은 PC3, LNCaP, Jurkat 세포를 세 개의 클러스터로 구분했으며, 각 클러스터는 고유한 표지 발현을 특징으로 합니다.

Jurkat 세포 클러스터는 TRBC1, IGLL1, CD1E, CD3D의 강한 발현으로 확인되었으며, 이는 T세포 활성화를 위한 경로 풍부화로 확인되었습니다. PC3와 LNCaP 클러스터는 차등 발현 유전자로 구별되었으며, PC3는 미세 세미노단백질 발현이 높고 LNCaP는 NEDD4를 발현하였습니다.