유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법
2016년 9월 20일
이 프로토콜은 특정 관심 세포 유형을 분리하기 위해 desthiobiotin, streptavidin, APTES 시스템의 사용자 정의 가능한 표면 기능화를 설명합니다. 또한 이 원고는 이 프로세스의 적용, 최적화 및 검증을 다룹니다.
이 유리 표면 기능화 공정의 전반적인 목표는 관심 세포를 부드럽게 포획하고 방출하는 것입니다. 이 방법은 종양 혈관 신생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 약물 내성을 나타내는 세포 바이오마커를 스크리닝할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 거의 모든 관심 세포 유형에 대해 완전히 사용자 정의할 수 있다는 것입니다.
세포 유형에 특이적인 항체가 있는 한, 표면은 포획을 위해 조정될 수 있습니다. 이 방법은 암 혈관 신생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 보다 개인화된 치료 요법의 개발을 위해 정제된 샘플이 필요하기 때문에 다른 질병에도 적용될 수 있습니다. 우리는 Destiobiotin과 Adivin 계열 간의 상호 작용을 사용하여 세포를 포획하기 위한 가역적 방출 메커니즘을 개발하려고 할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.
텍스트 프로토콜에 따라 산소 플라즈마 기계에서 5분 동안 유리 표면을 세척한 후 원뿔형 튜브에 APTES 50마이크로리터와 에탄올 2.45ml를 결합하여 2% 재구성 3-아미노프로필 트리에톡시실란 또는 APTES 용액 2.5ml를 준비합니다. APTES 용액을 유리 표면에 피펫팅한 다음 표면을 덮고 실온에서 플랫폼 셰이커에 50분 동안 올려 APTES 층을 고르게 분포시킵니다. 그 동안 오븐을 8웰 및 24웰 플레이트의 경우 섭씨 55도로 예열하거나 유리 접시의 경우 섭씨 90도로 예열합니다.
셰이커에서 플레이트를 제거한 후 에탄올을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 유리 표면을 헹굽니다. 100% 질소 가스로 표면을 건조시킵니다. 그런 다음 8웰 플레이트와 24웰 플레이트를 오븐에 2시간 동안 넣거나 유리 접시를 오븐에 1시간 동안 넣습니다.
다음으로, 37.5 μl의 DMSO에 1.5 millig의 DSB를 혼합하고, 2,462.5 μl의 0.1 molar MES buffer, pH 6에 1 밀리리터당 5 mg의 EDC를 첨가하여 2.5 ml의 d-Desthiobiotin(DSB 용액)을 준비합니다. 그런 다음 두 솔루션을 결합합니다. 15분 후 1마이크로리터의 BME를 첨가하여 DSB와 EDC 사이의 반응을 소멸시킵니다.
오븐에서 뜨거운 APTES 기능성 유리 표면을 제거하고 5-10분 동안 식히십시오. MES 버퍼를 유리 표면에 추가하여 팁이 표면을 직접 가리키지 않도록 피펫을 70도 각도로 잡고 헹굽니다. 그런 다음 우물의 모서리와 같은 고정 된 지점에서 버퍼를 배출하고 끌어옵니다.
그런 다음 MES 버퍼를 사용하여 두 번 더 헹굽니다. 유리 표면에 DSB 용액을 바릅니다. 페트리 접시 안에 있는 젖은 종이 타월로 옮기고 접시를 덮고 냉장고에서 18-24시간 동안 배양합니다.
섭씨 4도에서 배양한 후 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 PBS를 사용하여 각 유리 표면을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 Streptavidin(SAV 원액)을 밀리리터당 0.4mg으로 희석하고 유리 표면에 균일하게 도포하여 얇은 층이 형성되도록 합니다. 유리를 18-24시간 동안 배양한 후 150마이크로리터의 PBS를 사용하여 각 표면을 세 번 헹굽니다.
그런 다음 종이 타월에 탈이온수를 적시고 플레이트를 둘러싼 14cm 페트리 접시에 평평하게 놓아 우물에 수분을 유지합니다. 페트리 접시를 유리 표면으로 덮고 필요할 때까지 섭씨 4도의 생물 안전 레벨 1 냉장고에 넣습니다. 세포 포획을 수행하려면 세포의 T175 플라스크에서 배지를 흡인합니다.
그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 헹구고 완충액을 흡인합니다. Cell Dissociation Solution과 같은 비효소 리프팅 에이전트 10ml를 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 6분 동안 배양합니다.
6분 후 차가운 HBSS 10ml를 첨가하여 리프팅제를 희석합니다. 그런 다음 20 마이크로 리터의 세포를 피펫으로 넣고 혈구계를 사용하여 계산합니다. 500 x g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
그리고 HBSS를 사용하여 세포를 10의 1배에서 밀리리터당 6번째 세포로 재현탁합니다. 피펫을 위아래로 사용하여 용액 내 세포를 재현탁시키고 항체 결합을 감소시킬 수 있는 세포 응집을 줄입니다. 그런 다음 세포 현탁액을 별도의 대조군 용액과 실험 용액으로 분리합니다.
비오틴화된 항체를 각 세포 용액에 첨가하고 섭씨 4도의 엔드-투-엔드(end-over-end) 믹서에서 30분 동안 배양합니다. 150마이크로리터의 HBSS를 사용하여 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 8웰 플레이트에서 기능화된 유리를 세 번 세척합니다. 세포 용액을 웰에 넣고 셰이커의 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.
그 동안 멸균 HBSS에서 20밀리몰의 비오틴 용액을 준비합니다. 그런 다음 배양 후 150 마이크로 리터의 HBSS를 부드럽게 사용하여 유리에서 세포 용액을 헹굽니다. 헹굼을 두 번 더 반복한 후 각 방출 웰에 150마이크로리터의 비오틴 용액을 첨가하고 반응이 진행될 수 있도록 20분 동안 배양합니다.
HBSS를 사용하여 세포를 세척하여 비특이적으로 결합된 세포를 회수합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 형광 이미징 및 분석을 진행합니다. 플라스크에 살아 있는 세포의 이미지를 대조군으로 포함합니다.
이 실험에서는 MCF7GFP 세포를 기능화된 표면에 노출시켰습니다. 세포의 60%는 HLA-ABC 항체를 사용하여 포획했습니다. 20 millimolar 비오틴에 노출되자, 포획된 세포의 80%가 방출되었습니다.
여기에서 볼 수 있듯이 MCF7GFP 세포를 RAW 264.7 세포와 혼합했을 때 RAW 대식세포의 50%가 포획되었으며, 이후 20마이크로몰 비오틴을 첨가하여 포획된 RAW 세포의 80%가 방출되었습니다. 이 그림은 positive control RAW 대식세포가 형광 활성을 나타내지 않음을 보여줍니다. 그러나 음성 대조군 MCF7GFP 세포는 GFP 형광에 양성입니다.
과잉 항체는 세포 포획을 감소시킬 수 있기 때문에, 항체 농도는 0에서 10, HLA 항체의 밀리리터 당 000 nanograms를 적정해서 낙관되었습니다. 그 결과 이상적인 항체 농도는 밀리리터당 100에서 1, 000나노그램 사이인 것으로 나타났습니다. 또한, 세포 최적화 실험을 통해 포획할 수 있는 세포의 이상적인 농도는 10에서 5번째 세포까지, 그리고 10에서 6번째 세포까지 1배 사이인 것으로 확인되었는데, 그 이유는 그 숫자 미만의 양이 배경보다 낮기 때문입니다.
이 기술을 마스터하면 3일 만에 완료할 수 있으며, 하룻밤의 배양을 제외한 6시간 미만의 실험 시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 표면의 효과에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있으므로 실험 중에 세포 세척제를 수집하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 관심 세포가 가질 수 있는 수용체 발현 수준과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.
개발 후 표면 기능화는 생체 재료 분야의 연구자들이 다양한 질병 및 부상에 대한 환자의 임플란트와 같은 재료의 생물학적 안전 통합을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유리 표면의 표면 기능화를 통해 관심 세포를 포착 및 방출하여 다운스트림 분석을 가능하게 하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 아지드화나트륨의 살아있는 세포로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 교육, PPE 및 폐기와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 프로토콜은 desthiobiotin, streptavidin, 그리고 APTES를 사용한 특정 세포 유형을 분리하기 위한 사용자 정의 표면 기능화 방법을 설명합니다. 이는 세포를 부드럽게 포획하고 방출할 수 있게 해주며, 종양 혈관신생 및 약물 내성 연구에 도움을 줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 종양학
- 생명공학
배경
- 종양 혈관신생을 이해하는 것은 암 연구에 매우 중요합니다.
- 세포 바이오마커는 약물 내성을 나타낼 수 있습니다.
- 사용자 정의 방법은 다양한 세포 유형의 연구를 향상시킵니다.
- 세포 포획을 위한 가역적 방출 메커니즘은 중요합니다.
연구 목적
- 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 개발합니다.
- 암 생물학 및 치료에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 개인화된 의학을 위한 바이오마커 선별을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- desthiobiotin 및 streptavidin을 이용한 표면 기능화.
- 대상 세포 유형에 특이적인 항체 사용.
- 포획 및 방출 조건의 최적화.
- 세포 분리에 대한 방법의 효과성 검증.
주요 결과
- 이 방법은 다양한 세포 유형을 효과적으로 포획할 수 있습니다.
- 종양의 약물 내성을 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
- 사용자 정의 가능한 표면은 기술의 다양성을 향상시킵니다.
- 얻은 통찰은 개인화된 치료 전략에 정보를 제공할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 세포 분리에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다.
- 암 연구 외의 잠재적 응용이 있습니다.
- 이 방법은 개인화된 의학의 발전에 기여할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in personalized medicine by enabling gentle, reversible isolation of specific cell populations without altering physiological expression. It supports biomarker screening for drug resistance in tumor angiogenesis studies, directly informing target validation and lead identification efforts. The customizable surface functionalization platform enhances reproducibility and scalability for downstream applications in oncology and immunology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isolation of specific cell types for biomarker analysis.
- Operational Value: Provides a reversible capture-release system that preserves native cellular expression profiles.
- Predictive Value: Supports functional target validation by isolating cells indicative of drug resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified cell populations suitable for downstream screening assays and receptor expression analysis.
- Operational Value: Achieves up to 80% capture efficiency in single-cell mixtures with biotin-mediated gentle release.
- Platform Value: Enables assay standardization through quantifiable surface verification using plate reader and ImageJ analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical studies by providing disease-relevant isolated cells for xenograft and cancer separation models.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through gentle cell recovery.
- Translational Value: Supports biomarker-aligned screening for personalized treatment regimen development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, enabling isolation of biomarker-positive cell populations for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating cells expressing specific surface markers.
- Screening: Delivers assay-ready purified cells with quantifiable capture and release metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell capture efficiency and release kinetics via fluorescence imaging and hemocytometer counting.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through application in xenograft models and cancer separation studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to any cell type with available antibody, reducing need for re-optimization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by minimizing expression artifacts during isolation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized surface functionalization and biotin-mediated release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling reliable screening of drug resistance biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in isolated cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, antibody conjugation, and cell handling techniques.
- Depends on access to oxygen plasma equipment, ovens for silanization, and fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of antibody titration and cell concentration ranges for optimal capture.
- Involves adaptation considerations for different cell types and surface geometries (well plates vs. glass dishes).
- Includes practical limitations such as background signal at low cell concentrations and antibody optimization requirements.
