유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

이 유리 표면 기능화 과정의 전반적인 목표는 관심 세포를 부드럽게 포집하고 방출할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 종양 혈관 형성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 주며, 약물 내성을 나타내는 세포 바이오마커의 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 사실상 모든 관심 세포 유형에 대해 완전히 맞춤화가 가능하다는 점입니다.

특정 세포 유형에 특이적인 항체만 있다면, 해당 항체를 사용하여 세포를 포획할 수 있도록 표면을 조정할 수 있습니다. 이 방법은 암의 혈관 신생에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 더욱 개인화된 치료법 개발을 위해 정제된 샘플이 필요한 다른 질환에도 적용될 수 있습니다. 저희는 처음에 desthiobiotin과 avidin 패밀리 간의 상호작용을 이용하여 세포 포획을 위한 가역적 방출 메커니즘을 개발하려던 중 이 방법 아이디어를 얻었습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 산소 플라즈마 기기에서 유리 표면을 5분 동안 세척한 후, 코니컬 튜브에 APTES 50 µL와 에탄올 2.45 mL를 혼합하여 2%로 재구성된 3-Aminopropyl triethoxysilane(APTES) 용액 2.5 mL를 준비합니다. 유리 표면에 APTES 용액을 피펫으로 분주한 다음, 표면을 덮고 상온의 플랫폼 쉐이커에서 50분 동안 반응시켜 APTES 층이 균일하게 분포되도록 합니다. 그동안 오븐을 예열하며, 8-well 및 24-well 플레이트의 경우 55 °C로, 유리 디쉬의 경우 90 °C로 설정합니다.

쉐이커에서 플레이트를 꺼낸 후, 텍스트 프로토콜에 따라 에탄올을 사용하여 유리 표면을 헹굽니다. 100% 질소 가스로 표면을 건조합니다. 그런 다음 8-웰 및 24-웰 플레이트는 오븐에 2시간 동안, 유리 디시는 오븐에 1시간 동안 넣습니다.

다음으로, 1.5 mg/mL 농도의 DSB 37.5 µL를 DMSO에 혼합하고, 5 mg/mL 농도의 EDC를 0.1 M MES 완충액(pH 6) 2,462.5 µL에 첨가하여 2.5 mL의 d-Desthiobiotin(또는 DSB 용액)을 준비합니다. 그 후 두 용액을 혼합합니다. 15분 후에 BME 1 µL를 첨가하여 DSB와 EDC 사이의 반응을 정지시킵니다.

가열된 APTES 기능화 유리 표면을 오븐에서 꺼내 5분에서 10분 동안 식힙니다. 파이펫 팁이 표면을 직접 향하지 않도록 70도 각도로 유지하며 MES 버퍼를 유리 표면에 첨가하여 세척합니다. 그 다음, 웰의 모서리와 같은 고정된 지점에서 버퍼를 흡입하고 배출합니다.

그 후, MES buffer를 사용하여 두 번 더 헹굽니다. 유리 표면에 DSB 용액을 도포합니다. 이를 페트리 접시 내부의 젖은 종이 타월로 옮기고, 접시의 뚜껑을 닫은 후 냉장고에서 18~24시간 동안 배양합니다.

4 °C에서 배양한 후, 이 비디오의 앞부분에서 보여준 것과 같이 PBS를 사용하여 각 유리 표면을 3회 세척합니다. 그 다음, Streptavidin(또는 SAV 스톡 용액)을 0.4 mg/mL 농도로 희석하고, 유리 표면에 얇은 층이 형성되도록 고르게 도포합니다. 유리를 18~24시간 동안 배양한 후, 150 µL의 PBS를 사용하여 각 표면을 3회 세척합니다.

그 다음 탈이온수로 페이퍼 타월을 적신 후, 웰의 습도를 유지하기 위해 플레이트를 둘러싸도록 14 centimeter 페트리 접시에 평평하게 배치합니다. 페트리 접시를 유리 표면으로 덮고, 필요할 때까지 4 °C의 생물안전 1등급(biosafety Level 1) 냉장고에 보관합니다. 세포 포획을 수행하려면, T175 플라스크에서 세포 배지를 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 헹구고 버퍼를 흡입하여 제거합니다. Cell Dissociation Solution과 같은 비효소적 세포 분리제를 10 milliliters 플라스크에 첨가합니다. 이후 37 °C에서 6분 동안 배양합니다.

6분 후, 차가운 HBSS 10 milliliters를 첨가하여 리프팅 제제를 희석합니다. 그다음 세포 20 microliters를 피펫으로 취해 헤모사이토미터(hemocytometer)로 세포 수를 측정합니다. 세포 현탁액을 4 °C에서 500 x g로 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 HBSS를 사용하여 세포를 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 피펫팅을 통해 세포를 용액 내에 재현탁하고, 항체 결합을 저해할 수 있는 세포 응집을 줄여줍니다. 그 후, 세포 현탁액을 각각 대조군 용액과 실험군 용액으로 나누어 분할합니다.

비오틴화 항체를 각각의 세포 용액에 추가하고, end-over-end 믹서를 사용하여 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 비디오의 앞부분에서 보여준 것과 같이 150 µL의 HBSS를 사용하여 8웰 플레이트의 기능화된 유리를 3회 세척합니다. 웰에 세포 용액을 추가하고, 쉐이커 위 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.

그동안 멸균된 HBSS에 biotin 20 millimolar 용액을 준비합니다. 그 후, 배양 단계가 끝나면 150 microliters의 HBSS를 사용하여 유리 표면에서 세포 용액을 부드럽게 헹굽니다. 헹굼 과정을 두 번 더 반복한 후, 각 방출 웰(release well)에 biotin 용액 150 microliters를 첨가하고, 반응이 진행될 수 있도록 20분 동안 배양합니다.

HBSS를 사용하여 세포를 세척함으로써 비특이적으로 결합된 세포를 회수합니다. 그런 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 형광 이미지 촬영 및 분석을 진행합니다. 대조군으로서 플라스크 내의 살아있는 세포 이미지를 포함하십시오.

본 실험에서는 MCF7GFP 세포를 기능화된 표면에 노출시켰습니다. HLA-ABC 항체를 사용하여 세포의 60%를 포집하였습니다. 20 millimolar biotin에 노출시켰을 때, 포집된 세포의 80%가 방출되었습니다.

여기서 보시는 바와 같이 MCF7GFP 세포를 RAW 264.7 세포와 혼합했을 때 RAW 대식세포의 50%가 포획되었으며, 이후 20 micromolar biotin을 첨가하자 포획된 RAW 세포의 80%가 방출되었습니다. 이 그림은 양성 대조군인 RAW 대식세포가 형광 활성을 나타내지 않음을 보여줍니다. 반면, 음성 대조군인 MCF7GFP 세포는 GFP 형광 양성 반응을 보입니다.

과량의 항체는 세포 포획 효율을 떨어뜨릴 수 있으므로, HLA 항체의 농도를 0에서 10,000 ng/mL까지 적정하여 최적화하였습니다. 실험 결과, 이상적인 항체 농도는 100에서 1,000 ng/mL 사이인 것으로 나타났습니다. 또한, 세포 최적화 실험을 통해 포획 가능한 세포의 이상적인 농도는 1 × 10⁵에서 1 × 10⁶ cells 사이임을 확인하였으며, 이 수치 미만의 양은 배경 신호보다 낮았습니다.

이 기술을 숙달하면 하룻밤 동안의 배양 시간을 제외하고 3일 이내에, 총 6시간 미만의 실험 시간만으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 진행할 때, 실험 중 세포 세척액을 수집하는 것이 중요합니다. 세척액은 표면의 유효성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있기 때문입니다. 본 절차 이후에는 관심 세포의 수용체 발현 수준과 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

표면 기능화 기술의 발전으로 생체 재료 분야의 연구자들은 다양한 질환 및 부상 환자를 위한 임플란트와 같은 재료의 생체 안전한 통합 방안을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 관심 세포를 캡처하고 방출하여 후속 분석이 가능하도록 유리 표면을 기능화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. sodium azide를 사용한 살아있는 세포 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 교육, 개인 보호 장구(PPE) 착용 및 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.