Name: 유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 학습하세요 유리 표면 기능화를 통한 표적 세포 격리 방법으로 종양 혈관신생 및 약물 내성 연구에 활용하세요. 이 기술은 맞춤형 세포 포착 및 해제가 가능하여 맞춤 의료 발전에 기여합니다.

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기금 지원에 대해 American Cancer Society, Illinois Division(282802) 및 National Science Foundation CBET(1512598)에 감사드립니다. 또한 현미경 교육을 제공해 주신 University of Illinois Beckman Institute의 Dianwen Zhang 박사에게도 감사드립니다. 마지막으로, 통찰력 있는 토론을 해주신 Jared Weddell, Stacie Chen, Spencer Mamer에게 감사드립니다.

1. 유리 표면 청소 및 준비 시약 <ol><li> 청소 50 % 전력에서 5 분 동안 산소 플라즈마 시스템에서 유리 표면을 놓는다. </li><li> APTES 50 μL 및 원뿔형 튜브에 2.45 mL의 에탄올을 첨가하여, 2.5 mL의 2 % 재구성 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES) 용액을 제조 하였다. </li></ol> 2. APTES와 DSB의 기능화 <ol><li> 표면에 APTES 솔루션을 추가합니다. 8 웰 플레이트에 잘 당 피펫 150 μL. 24 웰 플레이트에 잘 당 피펫 100 μL. 60 X 15mm의 유리 접시 1.1 ml를 피펫. 증발 APTES 용액의 치우침을 방지하기 위해 표면을 커버한다. APTES 층의 고른 분포를 만들어 실온에서 50 분을위한 플랫폼 통의 표면을 놓습니다. 주 : APTES 표면의 제 1 층을 형성하는 아미노 실란이다. 다른면을 사용하는 경우에는 경험적으로 표면을 커버하는 데 필요한 용액의 부피를 결정한다. </li><li> 표면이 통에있는 동안, 오븐의 온도를 선택 : 열을 55 ° C로 8 웰 플레이트 2 시간 24 웰 플레이트에 대해. 열 유리 1 시간 동안 90 ° C 만 요리. </li><li> 에탄올로 표면을 씻어. <ol><li> 사용되는 표면에 기초한 참조하여 요구되는 에탄올의 양을 관리. 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 각 웰 24 웰 플레이트에 125 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 유리 접시 1.1 ml의 에탄올을 추가합니다. </li><li> 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 두 번 더 사용하여 에탄올을 씻어. 참고 : 유리 바닥 웰 플레이트의 그들에 어떤 플라스틱이있는 경우 플라스틱이 녹아 워프하기 시작으로, 65 ° C 이상을 가열하지 않습니다. </li></ol></li><li> 탱크로부터 분배 100 %의 질소 가스로 건조. 오의 표면을 배치VEN. </li><li> 2462.5에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 37.5 ㎕의 1.5 ㎎ / ㎖ DSB 결합하여 D-desthiobiotin (DSB) 용액 2.5 ml를 준비하고, 5 ㎎ / ㎖ 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 (EDC) 0.1 M 4 morpholinoethanesulfonic 산 수화물 (MES) (산도 6) 버퍼의 μL. 그런 다음 두 솔루션을 결합한다. </li><li> DSB 및 EDC의 반응을 해소하기 위해 용액에, 15 분 후, 2-β 머 캅토 에탄올의 1 μl를 추가합니다. 오븐에서 유리 표면을 기능화 뜨거운 APTES를 제거합니다. 냉각 유리 표면에 대해 5 ~ 10 분을 기다립니다. </li><li> MES 표면에 기초한 양을 사용하여 세척 할 표면 버퍼에 추가. 150 μL의 MES 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 125 μL의 MES 24 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 유리 접시 1.1 ML의 MES 버퍼를 추가합니다. </li><li> 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁 직접 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡고표면에. MES 버퍼와 두 번 더 씻어. </li><li> 그들이 부화 할 수 있도록 표면에 DSB 솔루션을 적용합니다. 8 웰 플레이트 잘 당 150 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 24 웰 플레이트 잘 당 100 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 유리 접시의 DSB 솔루션 1.1 ML을 추가합니다. </li><li> 페트리 접시 내부에 젖은 종이 타월에 DSB 덮여 유리 표면을 놓습니다. 덮고 18 ~ 24 시간 동안 4 ° C 냉장고에 품어. </li></ol> 3. 스트렙 타비 딘 작용 화 <ol><li> 1.0 배 인산염 완충액 (PBS) 1 ml를 각각 유리 표면을 세 번 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 0.4 밀리그램에 스트렙 타비 딘 (SAV) 원액을 희석 / ㎖ (권장). 주 : 희석 및 세척을위한 매체로서 이용 될 수 있도록 PBS가 등장한다. PBS는 SA를위한 용매로서 사용되는V, 따라서 표면에 결합하는 SAV의 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. </li><li> 유리의 아래쪽 형태의 얇은 층이 표면에 기반 용액의 양을 선택할 수 있도록 표면에 균일 SAV 용액 0.4 ㎎ / ㎖을 적용한다. 8 웰 플레이트를 들어, 웰 당 150 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 24 웰 플레이트를 들어, 웰 당 100 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 유리 접시를 들어, 1.1 ml의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 커버와 수분을 유지하기 위해 14cm 페트리 접시에 접시를 이동합니다. 18 ~ 24 시간 동안 냉장고에 페트리 접시를 품어. 참고 : 각면에 APTES, DSB 및 SAV의 일관된 볼륨을 사용하는 것이 필수적이다. </li><li> SAV을 제거하기 위해 각각의 유리 표면을 PBS 150 ㎕를 3 회 헹군다. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. </li><li> 종이 타월 w 젖은i 번째 탈 이온수와 우물에 수분을 유지하기 위해 판을 주변 14cm 페트리 접시에 평평한 종이 타월을 배치합니다. 웰을 함유하는 페트리 접시 커버. 필요할 때까지 4 ° C 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1) 냉장고에 페트리 접시를 품어. </li></ol> 4. 셀 캡처 및 릴리스 <ol><li> 실험을위한 세포의 T175 플라스크 (들)로 시작합니다. 플라스크 (들)에서 미디어를 대기음. 실온 PBS 5 ㎖로 나머지 용지를 세척 할 것. 플라스크 (들)에서 대기음 PBS. </li><li> 세포의 T-175 플라스크에, 이러한 세포 해리 솔루션 등의 비 효소 리​​프팅 제 10 ㎖를 추가합니다. 플라스크에서 세포의 리프팅 수 있도록 6 분 동안 인큐베이터에서 플라스크를 넣습니다. </li><li> 6 분 후, 차가운 행크의 균형 소금 용액 10ml를 추가 (HBSS를, 재료의 목록 참조) 리프팅 에이전트를 비활성화 할 수 있습니다. hemacytometer를 사용하여 솔루션에서 세포의 수를 계산하는 세포의 20 μl를 꺼냅니다. 주 : FUNC에 따라캡처 실험에 사용 된 표면 tionalized 필요한 세포의 수는 변한다. 작용 8 웰 플레이트를 들어, 잘 당 30 만 셀을 사용합니다. 작용 유리 접시를 들어, 110 만 셀을 사용합니다. 기능화 된 24 웰 플레이트를 들어, 125,000 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 계수에 대한 자세한 내용은 부록에서 발견된다. </li><li> 단계를 반복 4.1- 4.3 세포의 또 다른 플라스크를 들어, 적은 세포 실험에 필요한 것보다있는 경우. 솔루션에서 세포의 총 수를 얻기 위해 세포 현탁액 및 재계 세포를 결합합니다. </li><li> 집중 세포의 펠렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기에 세포 현탁액을 스핀. 다음 ml의 당 1 × 10 6 세포의 농도를 얻을 스핀 다운 세포에서 뜨는을 대기음하고, 계산 된 볼륨을 추가하기 위해 세포 현탁액에 추가 할 HBSS의 적절한 양을 찾습니다. 이 볼륨은 부록의 방정식을 사용하여 계산 될 수있다. </li><li> 피펫 상하 (씹다) 일을 재현 탁하기솔루션 전자 세포와 항체 결합을 감소시킬 수있다 용액에 세포 응집을 줄일 수 있습니다. 별도의 제어 및 실험 솔루션에 셀룰러 솔루션을 분할합니다. 구성 요소와 계산을위한 보충 파일을 볼 수 있습니다. </li><li> 보조 파일에 기술 된 바와 같이, 각 세포 용액을 비 오티 닐화 된 항체를 추가한다. 엔드 오버 엔드 믹서에 4 ° C에서 30 분 동안 품어. 참고 : MCF7GFP 세포, 0.5 ㎎ / ㎖ hIgG 0.5 ㎎ / ㎖ HLA-ABC 항체를 들어 권장합니다. RAW 대 식세포를 들어, 1 ㎎ / ㎖ mCD11b은 희석 차이를 설명하기 위해 절반 볼륨을 권장합니다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) 0.5 mg을 들어 / ㎖ hCD31 권장합니다. </li><li> HBSS로 작용 유리 표면을 세척 할 것. 이 실험을 위해, 8 웰 플레이트를 권장합니다. <ol><li> 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 추가합니다. HBSS를 사용하여 두 번 더 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어.팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 4 ℃에서 저온 보관하십시오. </li></ol></li><li> 우물에 셀 솔루션을 추가하고 세포가 셰이커에 얼음에 부화를 위해 45 분을 기다립니다. 는 Supplement에 설명 된대로 계산 볼륨을 사용하여 무균 HBSS에 비오틴의 솔루션을합니다. </li><li> HBSS를 사용하여 유리 웰의 세포 용액을 제거한다. <ol><li> 조심스럽게 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 피펫. 그런 다음 HBSS을 피펫. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. </li><li> 두 번 더 반복합니다. 세안 후 젖은 세포를 유지하기 위해 우물에 HBSS를 추가합니다. </li></ol></li><li> 또한 각각의 릴리스에 20 mM의 비오틴 용액 150 μl를 추가 한 다음 반응을 허용하는 20 분을 기다립니다. </li><li> 비특이적으로 결합 된 세포를 채취HBSS로 세척하여 (S)는 전술 한 바와 후 형광 표지 된 세포를 사용하는 경우, 화상을 세포를 형광으로 진행. 또한, 플라스크 내의 화상 생균 (a 대조군으로는 웰의 세포와 비교). 녹색 형광 단백질 (GFP) 형질 감염된 세포를 사용하는 경우, 470 nm의 여기 것이고, 방출 515 nm 인 것이다. </li></ol> 5. 항체 최적화 : 항체 적정 <ol><li> 단계 4.1- 4.3에 설명 된대로 T75 또는 T175 플라스크에서 세포를 올려 시작합니다. 참고 :이 볼륨을 24 웰 플레이트에 대한 교정되어 있지만, 경험적 테스트를 통해 모든 유리 작용 표면에 맞게 변경할 수 있습니다. 대표적인 항체 적정는 그림 1과 같다. </li><li> hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산하고, 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 튜브에 세포 용액을 스핀. 는 Supplement에 설명 된 계산을 이용하여, 용액 100 만 세포에 세포를 재구성한다. </li><li> 1 미터 분할항체 (AB) 솔루션에 대한 다른 원심 분리기 튜브에 500 ㎕의 6 가지 솔루션으로 ㎖의 용액 당 illion 세포. <ol><li> 10 ㎍ / ㎖, 1 μg의 / ㎖, 100 ng를 / ㎖, 10 ng를 / ㎖, 1 NG / ㎖의 항체 원액을 희석. 얼룩 완충액 (PBS + 1 % 아 지드 화 나트륨 + 1 % BSA) 100 ㎕ 및 가지지과 AB 컨트롤 세포 500 μl를 사용하여 제어를 만든다. 빈 제어를 위해 (없음 순이없이 세포), 300 ㎕의 PBS 용액을 사용하지 않습니다. 참고 :주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이 폭발하고, 그것을 사용하는 경우 극도의주의를 기울여야합니다. 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하여 적절한 안전 장비를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 결합하고 30 분 동안 4 ℃에서 엔드 오버 엔드 혼합기 셀 솔루션 구간 솔루션을 배양한다. HBSS로 3 회 기능화 된 24 웰 플레이트를 씻어. 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 파이를 잡고pette 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도. </li><li> 적절한 APTES에 각 시료 용액의 분취 량 125 ㎕를가 DSB 및 SAV 잘 관능. 39 ° C에서 또는 유리 표면에 45 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 비특이적으로 부착 된 세포를 제거하는 HBSS로 3 회 표면을 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 그 컨트롤과 마찬가지로, 맨 아래 행을 씻어하지 마십시오. </li><li> 잘 세척 각 HBSS 150 μl를 추가 얼음에 24 잘 접시를 넣어, 다음 GFP 세포 (여진 485 nm의 / 방출 528 ㎚)의 형광을 측정하는 플레이트 리더를 사용합니다. </li></ol> 6. 셀 최적화 : 셀의 적정 <ol><li> 단계 4.1 -4.3에서 언급 한 바와 같이 세포를 올립니다. </li><li> hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 그래서 세포를 스핀 다운4 ° C에서 5 분 500 XG에 원뿔 튜브에 lution. ml의 당 1,000,000 세포에 세포를 복원합니다. 참고 : hemacytometer의 사용에 대한 자세한 내용은 부록에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 피펫 원뿔 튜브에 160 만 셀 재고 및 장소 셀 솔루션에서 1.6 ml의. 원뿔 관에서 80 만 셀 재고 및 장소에 대한 세포 용액으로부터 세포를 800 μl를 피펫. 피펫 원뿔 관에서 80,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 80 μL. 피펫 원뿔 관에서 8,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 8 μL. 참고 : 농도는 필요에 따라 복제, 8 웰 플레이트 측정에 따라 제공됩니다. 플레이트 출력의 예는도 2에 도시되어있다. </li><li> 네 원액을 가지고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기의 회전. HBSS 400 μL의 모든 재고 솔루션을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 는 160 만 셀 재고로 100 NG / ㎖ 항체의 1.6 μl를 추가 0.8 μ800,000 셀 재고에 리터, 그리고 다른 모든 주식 0.5 μL. 4 ℃에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 혼합기에서 30 분 동안 인큐베이션 항체. HBSS로 3 회 작용 유리 표면을 세척 할 것. 주 : 기능화 된 24 웰 플레이트는 플레이트 리더 정량화하는 것이 좋습니다 동안 작용 8 웰 플레이트, 현미경 정량화하는 것이 좋습니다. 8000 세포 주식에 대한 항체 농도는 용액 중의 항체의 부족하지 않다고 포집 표면의 제한 요소를 허용하도록 감소하지만되지 않고 표면의 촬상 특성. </li><li> 각 웰에 샘플 솔루션의 150 μl를 적용합니다. 왼쪽에있는 우물의 첫 번째 열에에 160 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 두 번째 컬럼에 80 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 세 번째 열에에 80,000 세포 주식을 적용합니다. 마지막으로 마지막 열까지 8,000 셀 주식을 적용합니다. 진탕 기에서 4 ° C에서 45 분 동안 품어. 참고 : 160 만세포 스톡 시험 될 최고의 농도로 제공하며, (600,000 셀 웰 당) 세포 분리 실험에 통상적으로 사용되는 것이 일반적인 셀룰러 농도 그대로 800,000 세포 스톡 실험을위한 대조군으로 제공되는 세포의 두 배이며 즉 (웰당 300 세포) 세포 분리 실험에 사용된다. 80,000 세포 주식은 휴대 캡처 낮은 농도 (물론 당 30,000 세포)를 테스트 할 수있는 10 배 희석 역할을한다. 백 배 희석 세포 분리의 하한 (물론 3,000 세포)를 확인하는 테스트로 사용할으로 8000 셀 주가는 역할을한다. </li><li> HBSS로 3 회 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 모든 세척를 수집합니다. </li><li> 이미지는 형광 현미경에 세포를 8 웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 SUR를 촬영할얼굴과 진탕 기에서 4 ° C에서 1 시간 동안 각면에 150 μL 비오틴을 적용합니다. 일시간 후, 이전과 HBSS 3 회와 비오틴 릴리스 우물을 씻어. 혈구와 이미지 릴리스 우물에 카​​운트 우물에서 모든 세척를 수집합니다. </li><li> 24 웰 플레이트를 사용하는 경우, 1 시간 동안 비오틴 릴리스 우물을 적절한 다음 HBSS로 그 우물 3 번 씻어 20 밀리미터를 초과하는 비오틴 용액 150 μl를 적용합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 24 웰 플레이트를 정량. 수집 된 모든 잘 세척에서 세포를 계산하기 위해 hemacytometer를 사용합니다. </li></ol> 7. 이미지 분석 참고 : 피지 소프트웨어 패키지 (http://fiji.sc/Fiji) 이미지 분석을 권장합니다. 초기에, 이미지를 그레이 스케일 이미지로 변환 한 후, 휘도 / 콘트라스트 셀을 가지고 변경 하였다. <ol><li> 이미지를로드하고, &quot;유형&quot;아래로 스크롤 한 다음 이미지 탭을 클릭 한 다음 클릭하여 그레이 스케일로 변환4 8 비트 &quot;. </li><li> 이미지 탭을 클릭 한 다음 &quot;조정&quot;으로 스크롤하여 이미지의 대비를 높입니다. &quot;밝기와 대비&quot;를 클릭 한 다음 세포가 눈에 띄는 수 있도록 스크롤 막대를 사용합니다. 형광 이미지를 사용하는 경우,보다 한정된 세포를 확인하기 위해 이미지를 반전한다. </li><li> ImageJ에이 이미지를 분석하는 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN 전화에 플러그인을로드합니다. </li><li> 열기 ITCN. 대화 상자는 해당 셀의 크기를 추정하기 위해 여러 매개 변수를 사용자에게 프롬프트를 표시 할 때, 제 관심 셀의 최소 폭을 설정한다. 이미지가 형광 및 세포를 어둡게하는 경우 &quot;감지 다크 봉우리&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;개수&quot;버튼을 클릭 한 후 처음 2의 임계 값을 설정합니다. 사진의 새로 계산 버전은 세포가 계산 된 위치를 서술 빨간 점으로 표시됩니다. </li><li> defini보다 정확한 셀룰러 데이터를 얻을 수있는 임계 값과 폭 매개 변수를 조정는 &quot;셀&quot;의 크기 겨. 참고 : 오른쪽의 대화 상자에있을 것입니다 계산 세포의 수입니다. 매개 변수 변경 카운트 세포의 다른 수를 줄 것이다. </li><li> 좋은 추정치는 세포의 수에 도달 할 때까지 임계 값 및 폭 매개 변수를 통해 반복을 계속합니다. </li></ol>

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세포 분리 기술의 향상은 혈관 생물학 (19)의 세포 재생 생물학 프로그래밍 및 혈관 신생 신호 줄기, 신경 과학 (18)의 구조 - 기능 관계의 과학적 연구를 발전한다. 실제로, 일차 세포 배양 물 (20)은 (예 된 HUVEC), 혈관 생물학 주로 세포 분리 기술의 사용을 통해 수행된다. 세포 격리는 최근 세포막 수용체 3,14,15,19,21 정량적 흐름 (qFlow) 계측법 분석에 사용 하였다. 그러나, 기존의 세포 분리 방법은 세포 표면 수용체 수준에 영향을 미치는 인력 및 시약 모두에서 비용이 많이 든다. 우리는 이러한 단점을 충족 세포 유형의 혼합물로부터 단일 세포 유형의 재현성 캡처 완만 시스템의 생성을 허용 표면 기능화 17의 새로운 방법을 고급. 이 기술은 C의 가능성을 가능하게하는 반복적 인 시스템에 통합 될 수있다특이 적 항체를 사용하는 단계에서 다른 세포 유형 apturing. 추가 절차를 ...

현재 벤치 탑 세포 분리 방법 (예, 형광 활성화 셀이 1 정렬, 레이저 캡처 마이크로 해부 (2), 면역 자기 비드 분리 1) 준비 및 정렬의 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 큰 시간 규모는 생리적 반응 (3)의 대표하지 분석 결과, 생리적 반응과 표현 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 시스템은 신속하고 효율적으로 생체 의학 애플리케이션에 세포 분리 및 농축을 향상시키기 위해 세포 표면 수용체 수준을 중단없이 특정 세포 유형을 분리 할 수​​있는 요구된다. 따라서, 우리의 접근 방식에 대한 이론적 근거는 세포 분리를위한 부드러운 접근 방식을 개발하는 것입니다. 은 &quot;칩에 연구소는&quot;개념은 크기 빨리 (시간 - 투 - 분) 세포 분리의 주문 약속을 제공하며, 가장 자주 표면에 세포를 캡처하고 세포 또는 세포 내 콩트를 방출 포함물리 4,5를 통해 국세청 또는 화학적 방법 6. 이러한 방법은 체외 배양 (12, 13)에 대한 세포를 제공하는 경우에도 RNA 발현 9-11, 식별, 단백질 7,8 식을 식별하거나 몇 가지 장점을 제공하지만, 이러한 기술의 대부분은 이러한 세포 수용체 프로파일로 인해에게로 진단로 번역 할 수 없습니다 자신의 비 생리 학적 환경. 이러한 정확한 생리 학적 데이터를 생성하지 않습니다이 해제 에이전트를 사용하여 세포 수용체의 정량화 기법을 의미 이러한 수용체 수량 14, 15에 영향을 미칠 수있는 콜라게나, 같은 효소 리프팅 에이전트. 세포 용해는 기본 표면 수용체 사이의 분화를 방지하고 이전 16 내재화 된 것과. 이 프로토콜은 세포 분리를위한 빠르고 부드러운 접근 방식을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>2% APTES 용액</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너 Pico</td><td>Diener</td><td>Model 1</td>을 만드는 데 사용 <td>PDMS를 유리에 접착 가능</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>세포 포획 표면에서 방출 메커니즘으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>DSB를 용액</td></tr><tr><td>1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)</td>에 용해시키다<td>Thermo-Scientific</td><td>5g: 22980 25g: 22981</td><td>카르복실산을 활성화하고 단백질을 유리 표면에 결합할 수 있도록 합니다.</td></tr><tr><td>코팅되지 않은 8-웰 배양 슬라이드</td><td>BD Falcon</td><td>24개의 경우: 354118 96개의 경우: 354108</td><td>초기 포획 및 방출 정량화 실험과 같은 Zeiss 형광 현미경과 관련된 세포 실험에 사용됨</td></tr><tr><td>유리 바닥 24웰 플레이트</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>항체 및 세포 적정 실험과 같은 플레이트 리더와 관련된 세포 실험에 사용됨</td></tr><tr><td>메르캅토에탄올</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>EDC와 DSB 사이의 반응을 담금질하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>EDC 반응에 사용하기 위한 0.1M MES 버퍼를 만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Precision Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>PDMS 및 APTES 층의 경화에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Shaker</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>APTES가 표면에 고르게 분포되도록 하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]</td> <td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>비오틴 결합 단백질. 자극을 유발할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>5cm 유리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>HUVEC 연구 및 향후 프로파일링 연구에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>덮개가 있는 14cm 페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>기능화되는 샘플을 잡고 운반하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>MCF7-GFP 세포</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>액체 질소에 보관</td></tr><tr><td>RAW264.7 마우스 대식 세포</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>일리노이 대학의 스미스 연구실에서 우리에게 선물했습니다. 액체 질소에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>실온에서 100ml에 보관</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modified Eagle medium</td><td>Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC</td><td>50003PC</td><td>공급업체: Corning</td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC</td><td>25-025-CI</td> 이미 <td>시설별로 DMEM에 추가되었습니다. 공급 업체: Corning.</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>소형 23cm 50</td></tr>팩 <tr><td>세포 해리 솔루션</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>세포 실험에 사용하기 위해 비효소로 세포를 들어 올리는 데 사용</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>세포 용액의 정량화와 포획 및 방출 유효성을 위해 세포를 계수하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>표면에서 세포를 방출하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr>레시피 <td>N/A</td><td>로 만든</td> <td>HBSS</td><td>현탁액에서 세포를 살아있게 유지하고 비특이적 결합의 표면을 세척하는 데 사용됩니다. Cold Spring Harbor Protocols에서 발췌: In 500&nbsp; ml, 사용 4&nbsp; g NaCl, 0.2&nbsp; g KCl, 0.0402&nbsp; g Na2PO4&#8226; 7H2O, 0.03&nbsp; g KH2PO4 및 0.5&nbsp; G 포도당. DI 워터를 추가하여 얻으십시오&nbsp; 500ml를 걸러낸 후 냉장 보관하십시오.</td></tr><tr><td>HLA-ABC 항체</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>MCF7gfp 세포를 캡처하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>hIgG 항체</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>MCF7gfp 세포를 캡처하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>MCF7 GFP 세포</td><td>, Cell Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>Luminal Breast Cancer 라인은 녹색 형광 단백질로 transfection되었습니다.</td></tr><tr><td>모듬 원뿔형</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>용액 및 분취액 보관용 50/15ml 플라스틱 원뿔형.</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td> Axiovert 200M (형광 현미경)을 <td>혼합하기 위해 항체를 배양하고 다른 세포 용액을 혼합하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Zeiss Axiovert 200 M 도립 형광 현미경.</td></tr><tr><td>Zeba 탈염 컬럼</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Biotinylation Kit 사용 후 새로 비오틴화된 항체를 정제하는 데 사용됩니다. 지침: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit</td><td>Thermo- Scientific</td><td></td><td>항체를 비오틴화하여 포획 표면과 통합할 수 있도록 하는 데 사용됩니다.</td></tr> Plate <tr><td>Reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Multimode Reader</td><td>적정 실험에서 형광 강도를 정량적으로 측정하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

개인 맞춤형 의학의 채택과 발전을 제한하는 요인 중 하나는 환자 간 표현의 개별 뉘앙스를 조사하는 진단 도구를 개발할 수 없다는 것입니다. 이 틈새를 채우기 위해 세포를 분리하려는 현재의 방법론은 생리학적 발현을 방해하여 분리 기술을 진단 도구로서 무용지물로 만듭니다. 이 프로토콜에서는 세포 포획 및 방출을 위한 표면의 기능화 및 최적화에 대해 설명합니다. 이 기능화된 표면은 비오틴화 항체와 아미노실란(APTES), 데스티오비오틴 및 스트렙타비딘으로 기능화된 유리 표면을 통합합니다. 세포 방출은 비오틴의 도입을 통해 촉진되어 표면에 포착된 세포의 회수 및 정제를 가능하게 합니다. 이 방출은 2차 부분 desthiobiotin의 표적화를 통해 이루어지며, 이는 훨씬 더 부드러운 방출 패러다임을 초래합니다. 이러한 가혹한 시약과 전단력의 감소는 세포 발현의 변화를 감소시킵니다. 기능화된 표면은 단일 세포 혼합물에서 세포의 최대 80%를 포착하고 이중 세포 혼합물에서 50%를 포착하는 것으로 입증되었습니다. 이 기술을 이종 이식편 및 암 분리 연구에 적용하는 방안이 조사되고 있습니다. 플레이트 리더 및 ImageJ 분석과 같은 표면 검증을 위한 정량화 기술도 설명되어 있습니다.

우리는 세포 포착 (도 3A) 및 MCF7GFP 세포의 세포 분리 (도 3C)뿐만 아니라, 생균 제어 (도 4)이 표시 프로토콜 사용. 60 % 및 80 % (그림 3C) 발표 된 바와 같이 우리는 세포 캡처를 정량화. 우리는 RAW 264.7 대식 세포 및 MCF7GFP 세포의 혼합물에이 방법을 확장하면, RAW 식세포의 50 %를 점령 하였다 (도. 3D) 및 RAW 식세포의 80 %는 20 mM의 비오틴 (도 3b)와 분리 하였다. 과량의 항체가 세포 캡처를 줄일 수 있기 때문에, 우리는 HLA 항체의 0-10,000 nM의 적정을 통해 최적화 및 최적의 항체 농도가 100-1,000 mM의 항체 (그림. 1) 사이에 있는지 관찰한다. 마찬가지로, 우리가...

이 프로토콜은 특정 관심 세포 유형을 분리하기 위해 desthiobiotin, streptavidin, APTES 시스템의 사용자 정의 가능한 표면 기능화를 설명합니다. 또한 이 원고는 이 프로세스의 적용, 최적화 및 검증을 다룹니다.

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

이 유리 표면 기능화 과정의 전반적인 목표는 관심 세포를 부드럽게 포집하고 방출할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 종양 혈관 형성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 주며, 약물 내성을 나타내는 세포 바이오마커의 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 사실상 모든 관심 세포 유형에 대해 완전히 맞춤화가 가능하다는 점입니다.특정 세포 유형에 특이적인 항체만 있다면, 해당 항체를 사용하여 세포를 포획할 수 있도록 표면을 조정할 수 있습니다. 이 방법은 암의 혈관 신생에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 더욱 개인화된 치료법 개발을 위해 정제된 샘플이 필요한 다른 질환에도 적용될 수 있습니다. 저희는 처음에 desthiobiotin과 avidin 패밀리 간의 상호작용을 이용하여 세포 포획을 위한 가역적 방출 메커니즘을 개발하려던 중 이 방법 아이디어를 얻었습니다.텍스트 프로토콜에 따라 산소 플라즈마 기기에서 유리 표면을 5분 동안 세척한 후, 코니컬 튜브에 APTES 50 µL와 에탄올 2.45 mL를 혼합하여 2%로 재구성된 3-Aminopropyl triethoxysilane(APTES) 용액 2.5 mL를 준비합니다. 유리 표면에 APTES 용액을 피펫으로 분주한 다음, 표면을 덮고 상온의 플랫폼 쉐이커에서 50분 동안 반응시켜 APTES 층이 균일하게 분포되도록 합니다. 그동안 오븐을 예열하며, 8-well 및 24-well 플레이트의 경우 55 °C로, 유리 디쉬의 경우 90 °C로 설정합니다.쉐이커에서 플레이트를 꺼낸 후, 텍스트 프로토콜에 따라 에탄올을 사용하여 유리 표면을 헹굽니다. 100% 질소 가스로 표면을 건조합니다. 그런 다음 8-웰 및 24-웰 플레이트는 오븐에 2시간 동안, 유리 디시는 오븐에 1시간 동안 넣습니다.다음으로, 1.5 mg/mL 농도의 DSB 37.5 µL를 DMSO에 혼합하고, 5 mg/mL 농도의 EDC를 0.1 M MES 완충액(pH 6) 2,462.5 µL에 첨가하여 2.5 mL의 d-Desthiobiotin(또는 DSB 용액)을 준비합니다. 그 후 두 용액을 혼합합니다. 15분 후에 BME 1 µL를 첨가하여 DSB와 EDC 사이의 반응을 정지시킵니다.가열된 APTES 기능화 유리 표면을 오븐에서 꺼내 5분에서 10분 동안 식힙니다. 파이펫 팁이 표면을 직접 향하지 않도록 70도 각도로 유지하며 MES 버퍼를 유리 표면에 첨가하여 세척합니

a-method-targeted-cell-isolation-via-glass-surface

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

출처: Fattahi, N., et al. 박테리아 스크리닝, 선택 및 분리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스. J. Vis. 경험. (2021).이 비디오는 UV 광선을 사용하여 광분해성 하이드로겔에서 박테리아 콜로니를 추출하는 방법을 보여줍니다. 특정 콜로니가 선택되고 패턴화된 빛 노출이 국부적인 하이드로겔 분해를 시작하도록 설계되었습니다. 빛의 강도와 지속 시간을 조정한 후 UV 광선이 적용되어 콜로니가 방출됩니다. 그런 다음 콜로니는 튜브를 통해 흡인되고 다운스트림 분석을 위해 튜브로 옮겨집니다.

Light-patterned Hydrogel Degradation을 사용한 표적 박테리아 콜로니 분리

이 비디오에서는 말초 혈액 샘플에서 EpCAM 발현 상피암 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 기술에는 표적 세포를 포착하기 위해 EpCAM 항체로 기능화된 의료용 와이어를 사용하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 포획된 세포는 이후에 버퍼 용액으로 추출됩니다.

기능성 와이어 기반 표적 세포 분리: 스파이크된 말초 혈액에서 암세포를 분리하는 생체 외 기술

비접촉 유전 (cDEP)는 자신의 고유 유전 특성을 통해 정렬 및 입자의 농축 달성한다. 유체 전극 채널 살균 특성을 비 손상 및 생물학적 입자의 정렬에 cDEP 양복지, DEP에 대한 기존의 금속 전극을 교체합니다. 우리는 cDEP의 마이크로 디바이스를 준비하고 세포의 특성 및 정렬 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비접촉식 유전을 통해 라벨이없는 분리 및 세포의 농축

형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

고해상도 광 패터링 도구를 이용하여 세균 세포를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 것이 보고된다. 프로세스의 필수 실험 절차, 결과 및 이점을 검토합니다. 이 방법은 이질적인 지역 사회 또는 인구에서 희귀하거나 독특한 기능을 보여주는 표적 박테리아의 신속하고 저렴한 격리를 가능하게합니다.

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

학습하세요 유리 표면 기능화를 통한 표적 세포 격리 방법으로 종양 혈관신생 및 약물 내성 연구에 활용하세요. 이 기술은 맞춤형 세포 포착 및 해제가 가능하여 맞춤 의료 발전에 기여합니다.

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

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