JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 6:37 분 • May 29th, 2025
운동 피질 위에 두개골 창이 있는 마취된 마우스를 런닝머신에 고정합니다.
마우스는 피질 뉴런에서 단백질 키나아제-A 리포터를 발현합니다.
런닝머신을 2광자 FLIM 대물렌즈 아래에 배치합니다.
대물렌즈와 두개골 창 사이에 물방울을 추가합니다.
마우스가 깨어나 런닝머신에 적응하도록 합니다.
명시야 조명을 사용하여 이미징 영역을 찾습니다. 현미경 인클로저를 닫아 외부 빛을 차단합니다.
이미징 매개변수를 설정하고 트레드밀 회전을 시작하여 이동을 유도한 다음 이미징을 시작합니다.
강제 이동은 PKA를 활성화하여 리포터를 인산화하여 기증자와 수용체 형광단을 더 가깝게 만듭니다.
현미경은 적외선 레이저를 지시하여 기증자를 자극하여 에너지를 수용체로 전달하여 기증자의 형광 수명을 단축시킵니다.
이동이 멈추면 PKA와 리포터는 비활성 상태로 돌아가 에너지 전달을 감소시키고 기증자의 형광 수명을 늘립니다.
이미지를 분석하여 휴식 및 이동 중 피질 PKA 수준을 비교합니다.
두개창 설치 후 최소 2주 후에 2광자 여기 레이저 파장을 960나노미터로 설정하고 마취된 실험 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응 부족을 확인합니다. 마취된 마우스를 전동 런닝머신에 놓고 마우스의 헤드 플레이트를 런닝머신 설정의 헤드 플레이트 홀더에 장착합니다. 70% 에탄올로 두개골 창 커버슬립의 표면을 청소하고 전동 런닝머신을 2pFLIM 대물렌즈 아래에 놓습니다.
대물렌즈의 두개골 창 덮개 사이에 증류수 한 방울을 바르고 마우스가 깨어나 최소 10분 동안 런닝머신과 현미경 환경에 적응하도록 합니다. epi-illumination 하에서 주입 위치로 이동하고 명시야 아래에서 기준 특징을 문서화하여 후속 이미징 세션 동안 동일한 관심 영역의 이미징을 돕습니다.
epi-illumination 광원을 끕니다. 2pFLIM 현미경 장비의 인클로저를 동봉합니다. 2pFLIM 현미경 광전자 증배관을 활성화하려면 하드웨어 명령 전압 제어를 켜십시오. Z-stack 2pFLIM 이미지를 획득하려면 이미지 크기를 128 x 128 픽셀로 설정합니다. 스캔 속도는 라인당 2밀리초, 시야는 프레임에서 90-100마이크로미터, 평균 3프레임입니다.
준비 및 하드웨어 구성에 따라 이미징 설정을 조정합니다. 그리고 획득한 이미지를 FLIM 보기로 검사합니다. 필요에 따라 시야 감소, 스캔 속도 감소, 레이저 출력 증가, 평균화 프레임 수 증가를 사용하여 통합 광자 수를 늘리고 수명 추정 오류를 줄
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