Saccharomyces cerevisiae에서 신생 및 성숙 전사체의 RNA 구조 비교 분석
February 27th, 2026
RNA 2차 구조는 주로 구조 탐사 방법을 통해 성숙한 RNA에서 관찰되었습니다. 공동전사구조추적시퀀싱(CoSTseq)은 핵 런온을 구조 탐지와 결합하여 신생 RNA의 중합효소 위치를 연구하는 데 사용되었습니다. CoSTseq는 활성 전사 상태에서 RNA 내 RNA 2차 구조를 관찰할 수 있게 합니다.
우리는 공속전사적 RNA 처리를 연구했으며, 여기에는 RNA 중합효소에서 나오는 초기 RNA가 어떻게 접히는지도 포함됩니다. 이 방법 이전에는 합성 중 RNA가 어떻게 접히는지 모니터링할 수 없었고, 이것이 연구를 제약하고 있었습니다. 그래서 이 새로운 방법은 그런 공백을 극복합니다.
CoSTseq는 효모에서 초기 RNA 접힘을 조사하기 위해 개발되었습니다. 특히 풍부하게 존재하는 RNA 분석에 효과적입니다. 우선, Saccharomyces cerevisiae 균주 BY4741을 50밀리리터 YPAD 배지에 접종하고, 30도 섭씨에서 분당 200회전으로 진동시키며 배양 중간에 로그 단계에 도달할 때까지 배양합니다.
약 3밀리리터의 효모 배양을 채취하고, 1.8 광학 밀도 단위에 해당하며, 2,500 x g 원심분리기를 4도 섭씨에서 3분간 원심분리기로 가열합니다. 상원액을 폐기통에 버리세요. 펠릿을 10밀리리터의 차가운 PBS에 다시 담고, 다시 2,500 x g에서 4도 섭씨에서 3분간 원심분리합니다.
상원액을 제거하고 효모 펠릿은 얼음 위에 보관하세요. 효모 펠릿을 10밀리리터의 차가운 0.5% 사르코실 알코올에 조심스럽게 재현탁하세요. 거품이 생기지 않도록 하세요. 재현탁된 효모를 얼음 위에 20분간 배양하여 투과를 허용한 후, 400 x g 온도에서 4도 섭씨에서 5분간 펠릿 세포를 투여한 후, P-1000 피펫을 사용해 100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 다시 부탁합니다.
2.5배 전사 버퍼와 새로 첨가한 5밀리몰라 디티오트레이톨, 그리고 2.5배 구조 탐침 완충제를 섭씨 30도까지 예열하여 작업 용액을 준비합니다. 깨끗한 2밀리리터 튜브에 필요한 모든 반응 성분을 넣고 완전히 섞습니다. 다음으로, 준비된 효모세포 100마이크로리터를 반응관에 넣고 30도 섭씨로 설정한 열믹서에서 분당 500회전으로 2분간 흔들어 배양합니다.
그 후 미리 가열된 2.5X 구조 탐침 완충제 200마이크로리터와 디메틸 설페이트 시약 25마이크로리터를 동시에 빠르게 추가합니다. 튜브를 두 번 부드럽게 소용돌이로 돌려 인큐베이터에 넣고, 30도 섭씨, 분당 500회전으로 설정하세요. 샘플 간격을 30초로 두고 4분간 열화기 믹서에서 계속 배양하세요.
정지 및 세척 완충제를 미리 준비해 얼음 위에 올려두면 사용 가능해요. 디메틸 황산염 메틸화는 반응관에 1밀리리터의 정지 버퍼를 첨가하여 멈춥니다. 이제 디메틸 설페이트 표지된 샘플을 3,500 x g에서 5분간 프리쿨 원심분리기에서 원심분리합니다.
회전 후에는 상원액을 적절한 폐기물에 버립니다. 냉각된 워시 버퍼 1밀리리터를 펠릿에 넣고 다시 현탁하세요. 3, 500 x g에서 원심분리를 5분간 반복합니다.
즉시 RNA 추출을 진행하고 효모 펠릿을 냉동하지 마세요. 디메틸 황산염 표지된 효모 펠릿을 600마이크로리터의 RNA 용해 완충제에 재현탁한 후, 현탁액을 20% 도데실 황산나트륨 40마이크로리터가 들어있는 튜브로 옮깁니다. 샘플을 65도 섭씨에서 30초간 배양하고, 분당 950회전으로 흔듭니다.
다음으로, 표준 절차에 따라 RNA의 페놀-클로로포름 추출을 수행합니다. 스테렙타비딘을 자기 구슬에 돌리고, 총 80마이크로그램 RNA 샘플당 44마이크로리터의 구슬을 새로운 튜브로 옮깁니다. 자석 비즈를 자석 거치대에 올려 비즈가 안정될 때까지 보관하세요.
저장 버퍼를 제거한 후, 구슬을 1밀리리터 프리워시 버퍼 A에 다시 매립합니다. 이제 현탁액을 실온에서 2분간 배양한 후 자화하여 상원액을 제거합니다. 세척 후에는 2배 결합 완두제 88마이크로리터에 비즈를 다시 부유합니다. 80마이크로리터의 현탁액을 80마이크로리터에 80마이크로리터 용량의 비오티닐화 RNA 샘플이 들어 있는 멸균 1.5밀리리터 튜브에 옮깁니다.
비드 샘플 혼합물을 실온에서 회전기 위에서 20분간 돌립니다. 그 후 튜브를 자기 랙에 올려 성숙한 RNA를 통과하는 흐름을 수집하고, 침전용으로 저장하여 DMS-MaPseq 워크플로우를 이용해 성숙한 RNA의 폴리-A 선별을 수행합니다. 다음으로, 구슬 생성 RNA 복합체를 500마이크로리터의 고염 완충제로 두 번 세척합니다.
그 후 1X 결합 완충제 500마이크로리터로 한 번 씻고, 마지막으로 저염 완충제 500마이크로리터로 세척합니다. 이제 구슬=신생 RNA 복합체에 RNA 시약 300마이크로리터를 추가하고, 완전히 재현탁한 후 60도 섭씨에서 5분간 열믹서에서 배양합니다. 다음으로 클로로포름 60마이크로리터를 넣고 보텍스를 한 뒤 실온에서 3분간 배양합니다.
샘플을 14,000 x g에서 5분간 프리쿨 원심분리기에서 원심분리합니다. 마지막으로, 상부 수상 약 180마이크로리터를 새로운 수집관으로 옮깁니다. 남은 유기 상은 버리고, 구슬과 잔류 수용액만 남겨둡니다.
초기 RNA를 정제한 후, 템플릿 전환 역전사를 수행하고, 5'어댑터를 연결하며, 시퀀싱을 위한 라이브러리를 선택합니다. 1% 아가로스 겔에서 검사 PCR 산물을 시각화한 결과, 프라이머 다이머 형성이 최소한이었고, 공동 전사 구조 추적 시퀀싱 또는 CoSTseq 및 DMS-MaPseq 라이브러리에서 약 300개의 염기쌍 주변에서 특징적인 스미어가 나타났습니다. CoSTseq 샘플 1의 전기영구도(electropherogram)는 라이브러리 크기 분포를 확인했으며, 피크는 약 285염기쌍으로 나타났습니다.
ASC1 mRNA의 리드 정렬 결과, CoSTseq 라이브러리가 인트론 전체에 걸쳐 적용되어 RNA가 초기 단계임을 확인했습니다. 반면 DMS-MaPseq 라이브러리는 인트론 커버리지가 없어 RNA가 성숙했음을 나타냅니다. 18S pre-rRNA의 cot 전사 접힘 기진은 RNA 중합효소가 rDNA 유전자좌의 790에서 811로 진행할 때 DMS 반응성이 급격히 변화함을 보였음을 밝혀냈습니다.
ADH1 mRNA의 DMS 반응성 분석에서는 초기 형태와 성숙 형태 간에 유사한 프로필이 나타나 구조적 안정성 영역을 나타냈습니다. 반면, SSA2 mRNA는 신생 형태와 성숙 형태 사이에 서로 다른 DMS 반응성 영역을 보였으며, 이는 성숙 과정에서 구조적 변화를 시사합니다. CoSTseq를 통해 연구자들은 생체 내 신생 RNA 2차 구조와 RNA 전사체 내 RNA 중합효소의 위치를 확인할 수 있습니다.
CoSTseq는 시간에 민감한 단계가 있고, 독성 화학물질을 사용합니다. 한 번에 두 개 이상의 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. CoSTseq에서 생성된 총 RNA 중에서 비비비티닐화 RNA는 전통적인 DMS-MaPseq를 이용한 동시 성숙 구조 탐침에 사용할 수 있습니다.
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Overview
This article presents Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq), a method for probing the secondary structure of nascent RNA as it emerges from RNA polymerase in Saccharomyces cerevisiae. CoSTseq enables simultaneous mapping of RNA polymerase position and RNA base pairing status, overcoming previous limitations in studying transient, low-abundance nascent transcripts. The protocol also allows parallel analysis of mature RNA structures using DMS-MaPseq.
Key Study Components
Area of Science
- RNA biology
- Structural genomics
- Molecular genetics
Background
- RNA secondary structures formed during transcription influence gene expression, RNA processing, translation, and stability.
- Traditional methods primarily analyze mature RNA, leaving nascent RNA folding poorly understood.
- Nascent RNAs are rare and transient, making their isolation and structural characterization challenging.
- Understanding cotranscriptional folding is critical for elucidating RNA function and regulation.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a protocol for capturing the structure of nascent RNA in vivo.
- To simultaneously determine RNA polymerase position and RNA base pairing status during transcription.
- To compare nascent and mature RNA structures within the same experimental framework.
Methods Used
- Growth and preparation of S. cerevisiae cultures.
- Transcriptional run-on with biotin-NTP incorporation to stall RNA polymerase at active sites.
- DMS (dimethyl sulfate) treatment to methylate unpaired A, C, and U nucleotides in RNA.
- Biotin-based enrichment of nascent RNA using streptavidin magnetic beads.
- RNA extraction, reverse transcription with template switching, and library preparation for sequencing.
- Parallel DMS-MaPseq workflow for mature RNA structure analysis.
Main Results
- CoSTseq libraries showed coverage across introns, confirming capture of nascent RNA, while DMS-MaPseq libraries lacked intron coverage, indicating mature RNA.
- DMS reactivity profiles revealed abrupt structural changes in 18S pre-rRNA as RNA polymerase progressed along the gene.
- ADH1 mRNA displayed similar DMS reactivity in nascent and mature forms, suggesting structural stability.
- SSA2 mRNA exhibited differences in DMS reactivity between nascent and mature forms, indicating structural remodeling during maturation.
Conclusions
- CoSTseq enables in vivo mapping of nascent RNA secondary structures and RNA polymerase positions.
- The method provides insights into cotranscriptional RNA folding and structural transitions during RNA maturation.
- CoSTseq can be performed alongside DMS-MaPseq for comprehensive analysis of RNA structure dynamics.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq) enables direct analysis of nascent RNA folding and polymerase position in vivo, addressing a critical gap in understanding RNA structure dynamics during transcription. This capability enhances predictive confidence in gene regulation studies and supports mechanistic de-risking at the target validation stage. Integrating nascent and mature RNA structure analysis informs early discovery decisions and portfolio triage in RNA-targeted drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA folding states as transcripts emerge from RNA polymerase.
- Supports functional target validation by mapping structural transitions relevant to gene regulation.
- Improves predictive confidence in RNA-targeted therapeutic hypotheses.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing stable versus dynamic RNA regions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA structure datasets for downstream screening workflows.
- Enables assay standardization by providing quantitative DMS reactivity profiles.
- Supports reproducibility through parallel analysis of nascent and mature transcripts.
- Facilitates reliable evaluation of compound effects on RNA structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns RNA structure analysis with disease-relevant gene expression systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of RNA-targeted mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement by revealing structural remodeling during RNA maturation.
- Supports mechanistic de-risking for RNA-based therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
CoSTseq integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling comprehensive RNA structure analysis at multiple pipeline stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nascent RNA folding in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible DMS reactivity outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers paired-end sequencing data to compare structural states across transcript maturation.
- Translational Research: Connects RNA structure dynamics to disease-relevant gene expression and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA structure analysis across diverse targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes RNA structure probing with scalable, parallelizable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying RNA structural transitions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, sequencing, and chemical probing techniques.
- Needs access to paired-end sequencing platforms and analytical infrastructure for DMS reactivity analysis.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or RNA abundance levels.
- Throughput is limited by time-sensitive steps and handling of toxic chemicals.
