Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae

이 절차의 전반적인 목표는 산화 스트레스를 받는 효모의 발현 차이를 조사하여 학부생에게 마이크로어레이 기술을 소개하는 것입니다. 이는 먼저 과산화수소로 처리된 효모 배양물과 처리되지 않은 대조군에서 전체 RNA를 분리하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이러한 RNA 샘플에서 CDNA를 생성하고 정제하는 것입니다.

그런 다음 CDNA를 사용하여 in vitro transcription을 통해 CRNA로 표지된 비오틴을 제조합니다. 절차의 마지막 단계는 AFI 메트릭 효모 유전자 칩에 대한 혼성화를 위해 비오틴 표지 CRNA를 단편화하는 것입니다. 궁극적으로 두 효모 샘플의 발현 차이를 보여주고 생물정보학을 통해 학부생에게 마이크로어레이 분석의 힘을 입증하는 결과를 얻을 수 있습니다.

Vermont Genetics Network Outreach 팀은 과학 교육을 강화하기 위해 버몬트 주 전역의 과학 학생들에게 마이크로레이 기술을 제공하는 업무를 맡았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 현재까지 이 방법은 주 전역의 8개 학사 대학의 여러 사이트에 전달되었습니다. 따라서 교육 모듈의 마이크로레이를 사용하는 주요 이점은 실험실 전체에서 매일 사용되는 일반 분자 생물학 기술을 개인 그룹에게 가르칠 수 있는 기능을 제공합니다.

그리고 우리는 또한 이것을 사용하여 학생과 교사 모두, 그리고 우리 그룹에게 가르칠 수 있습니다. 실제로 학생과 교수가 같은 프로젝트에서 함께 일하고 있습니다. 그들은 RNA를 다루는 것과 같이 많은 기교가 필요한 특정 기술을 배우는데, 이는 쉬운 일이 아닙니다.

그들은 시각화 시약을 사용하여 DNA를 침전시키는 방법을 배웁니다. 그들은 실제로 대학원 연구나 일상적인 분자 생물학 실험실에서 접하게 될 기술을 사용하게 됩니다. 이 방법은 산화 스트레스와 효모에 대한 통찰력을 얻는 데 적합하지만, 보고 싶은 다른 모델 유기체 및 기타 생물학적 시스템에도 확실히 적용할 수 있습니다.

유전자 발현은 발달 변화, 환경 독소, 특정 질병 상태 등과 관련이 있는지 여부에 관계없이 변화합니다. 산화 스트레스를 받는 효모의 발현 차이를 조사하기 위해 먼저 효소 용해를 통해 두 개의 효모 배양물에서 총 RNA를 추출합니다. 한 배양액은 행크의 완충 식염수에 0.5 밀리몰의 과산화수소를 1시간 동안 처리하여 산화 스트레스에 노출시켰고, 다른 배양액은 HBSS만 대조군으로 처리했습니다.

먼저 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브 2개에 적절한 식별 정보를 표시합니다. 1.5ml의 적절한 효모 배양액을 각 튜브로 옮깁니다. 5, 실온에서 2분 동안 000Gs에서 튜브를 원심분리하십시오.

원심분리 후, 마이크로 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 절차를 계속하기 전에 펠릿이 충분히 큰지 확인하십시오. 펠릿이 너무 작으면 펠릿이 들어 있는 동일한 튜브에 1.5ml의 배양물을 추가한 다음 원심분리하여 더 큰 펠릿을 얻습니다.

마이크로 피펫으로 상등액을 버리고 효모 펠릿에서 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 SG 버퍼와 30마이크로리터의 리아제 용액을 효모 펠릿 와류에 추가하여 혼합합니다. 배양 중 두 튜브를 실온에서 30분 동안 배양합니다.

10분마다 각 튜브를 부드럽게 휘젓어 플래트를 생성합니다. 효모의 스페로 플레이팅을 할 때 가장 중요한 단계 중 하나는 처리 후 실제로 100% 스페로 플라스트를 만들었는지 확인하는 것입니다. 이는 모든 용해 효소가 동일하게 생성되지 않는다는 것을 의미합니다.

따라서 좋은 용해 효소가 좋은 스페로 도금을 제공하고 있는지 확인해야 하는데, 이는 이러한 샘플을 채취하여 현미경 슬라이드에 넣고 0.1% SDS를 추가하여 현미경 아래에서 확인하여 원형질체가 형성되어 있는지 확인해야 한다는 것을 의미합니다. 완전한 스페로 도금을 관찰하기 위해 효모 시료 10마이크로리터를 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 0.1%SDS 1마이크로리터에서 현미경으로 시료를 검사하여 효모 세포가 팽창하여 완벽한 구 또는 스페로이드를 형성하도록 합니다. 발아 세포도 S 스페로이드를 형성하는 것을 관찰하는 것이 중요합니다.

부분적인 스페로 도금이 관찰되면 리아아제(liase)를 사용한 장시간 치료가 권장됩니다. 각 튜브에 350마이크로리터의 BRLT 버퍼에서 완전한 스페로 도금이 확인되면 250마이크로리터의 100% 에탄올을 추가합니다. 뚜껑을 닫고 1분 동안 격렬하게 소용돌이쳐 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.

이 절차는 Sphero plats를 이가 만듭니다. 그런 다음 R 및 easy Z 스핀 컬럼을 사용하여 두 배양물에서 RNA를 수집하고 세척합니다. 마지막으로, 전기영동을 위한 1.2% 프리캐스트 아로스 겔을 사용하여 추출된 RNA의 품질을 평가하여 비오틴 표지 CRNA를 준비합니다.

효모 세포에서 추출한 총 RNA는 먼저 역전사에 의해 CD NA를 합성하는 데 사용됩니다. CD NA 생성 후 CD NA 침전 원심분리기 위상 잠금 겔 튜브에 사용할 위상 잠금 겔 튜브를 1분 동안 최고 속도로 준비하여 겔이 튜브 바닥에 있는지 확인합니다. pH 8.0 트리스 완충 페닐 클로로포름, 이소 아밀 알코올 또는 PCI 혼합물의 바닥 층의 CD NA 피펫 162 마이크로 리터를 침전시키고 두 번째 가닥의 162 마이크로 리터 함량에 첨가하기 위해 위상 잠금 튜브를 와류시키지 마십시오. 이 단계에는 동일한 부피의 수성 및 유기 혼합물이 필요합니다.

내용물을 섞기 위해 5초 동안 소용돌이칩니다. 다음으로, 마이크로 피펫을 사용하여 모든 CD N-A-P-C-I 혼합물을 위상 잠금 겔 튜브로 옮깁니다. 위상 잠금 젤 튜브 원심 분리기를 2분 동안 최고 속도로 와류로 돌리지 마십시오.

그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 위상 잠금 겔 튜브의 최상층을 새로 라벨링된 1.7ml 튜브로 옮깁니다. 가능한 한 많은 레이어를 수집하십시오. 1.7밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브, 405마이크로리터의 100% 에탄올, 80마이크로리터의 아세트산 암모늄 및 1마이크로리터의 펠릿 페인트 소용돌이에 다음을 추가합니다.

튜브의 힌지가 바깥쪽을 향하도록 하여 튜브를 원심분리기에 잠시 놓고 20분 동안 최고 속도로 원심분리합니다. 실온에서 원심분리가 완료되면 CD NA 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거합니다. 펠릿은 펠릿 페인트와 대략 소금 알갱이 크기 때문에 분홍색이어야 합니다.

그리고 힌지 아래의 튜브 측면에 CD NA 펠릿을 얼음 위에 놓고 즉시 펠릿 청소를 진행하십시오. CD NA 펠릿 세척 절차를 시작하려면 P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 튜브에서 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

500 마이크로 리터의 차가움, 튜브에 80 % 에탄올의 샘플입니다. 튜브를 부드럽게 덮고 천천히 여러 번 뒤집습니다. 펠릿이 튜브 측면에서 분리되지 않도록 매우 면밀히 관찰하십시오.

펠릿이 분리되면 튜브를 랙에 다시 넣고 펠릿을 바닥에 가라앉히거나 15초 동안 최고 속도로 튜브를 원심분리하여 튜브 바닥으로 다시 가져올 수 있습니다. 다음으로, P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 에탄올을 조심스럽게 제거합니다. 가능한 한 많은 액체를 제거할 수 있도록 튜브를 기울이십시오.

80% 에탄올의 차가운 새 Eloqua를 추가하고 튜브를 덮고 천천히 여러 번 뒤집습니다. P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 가능한 모든 에탄올을 제거한 후. 튜브를 5초 동안 최고 속도로 원심분리합니다.

그런 다음 P 10 마이크로 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 마지막 몇 마이크로리터의 에탄올을 제거합니다. 열린 튜브를 건조 상자에 10-20분 동안 넣어 남은 에탄올을 증발시킵니다. 펠릿은 건조되면 쉽게 잃어버리므로 튜브를 부드럽게 다루고 캡을 닫을 때 주의하십시오.

건조가 완료되면 건조된 펠릿을 시각화하여 튜브에 있는지 확인합니다. 마지막으로 건조된 펠릿을 RNA 자유수 22마이크로리터에 재현탁하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 이 CDNA를 사용하여 Enzo BioArray 키트를 사용하여 시험관 내 전사를 통해 비오틴 표지 CRNA를 제조하는 데 사용됩니다.

CRNA로 표지된 비오틴을 세척하고 정량화한 후 표적 준비를 위해 단편화합니다. CDNA가 생성되면 표준 in vitro transcription 방법론을 사용하여 비오틴화된 CRNA를 생성합니다. CRNA는 마이크로레이 칩에 적용되기 전에 단편화를 거쳐야 합니다.

이 절차를 시작하려면 CRNA 5마이크로그램에 해당하는 양을 표지된 0.5밀리리터 PCR 튜브에 전달합니다. 총 부피가 16 μliter가 되도록 충분한 RNA 자유수를 추가한 다음 5 x 단편화 완충액 4 μl를 튜브에 추가합니다. 튜브의 총 부피는 20마이크로리터여야 합니다.

튜브와 원심분리기를 10초 동안 소용돌이칩니다. 그런 다음 섭씨 94도에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 열순환기에서 배양 후 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다.

그런 다음 각 샘플의 단편화되고 단편화되지 않은 CRNA를 1.2% 프리캐스트 AROS 겔을 사용하여 전기영동으로 평가합니다. 실행이 완료되면 겔이 트랜스루미네이터에서 시각화되고 이미지가 획득됩니다. 최종 합성 산물은 atric yeast gene chips에 혼성화되며 마이크로어레이 분석의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.

이 첫 번째 그림은 atrics 유전자 칩 운영 소프트웨어에 의해 생성된 스캔된 atrics yeast gene chip 이미지의 예입니다. 이것은 모든 유전자 전사체의 2D 산점도이며, 대조군 및 처리된 효모 데이터를 비교하는 약 6, 700개의 유전자입니다. 각 점은 단일 유전자를 나타냅니다.

보라색으로 표시된 유전자는 다르게 발현된 유전자를 나타내지만 빨간색으로 표시된 유전자는 그렇지 않습니다. 이 예에서, 차등적으로 발현된 유전자의 대부분은 그들의 설명에 나타난 바와 같이 세포주기 조절에 관여하는 유전자입니다. 주석 시각화 및 통합 발견을 위한 데이터베이스의 이 순서도는 영향을 받은 생물학적 경로에서 차등적으로 발현된 유전자를 보여줍니다.

빨간색 별표로 표시된 유전자는 miotic pathway에서 하향 조절된 유전자를 나타냅니다. 마지막으로, 지질종 유전자 선별 소프트웨어를 사용하여 생성된 화산 플롯의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 대조군 및 처리된 샘플을 0.05의 P-값 컷오프 및 1.5 폴드 발현 변화 컷오프와 비교했습니다.

우리는 효모가 빠르게 자라기 쉽기 때문에 효모를 사용하기로 선택했지만, 효모 작업에서 가장 중요한 부분은 실제로 적절한 스페로 도금을 만드는 것이라는 것도 깨달았습니다. 마이크로어레이에서 우리가 하고 싶지 않은 것 중 하나는 실제로 불완전한 소화를 하고 실제로는 G 1 또는 G 2 M 단계에 있는 스페로 플라스트 세포만 수행하는 것입니다. 그런 다음 특정 복제 단계에 있는 효모에 대한 마이크로어레이 실험을 하고 있습니다.

이 연습에서 우리가 집으로 가져오려고 하는 또 다른 복잡한 요점은 CD NA 사람들을 펠릿화하는 것이 매일 이야기하지만 반드시 쉬운 것은 아니라는 것입니다. 그리고 우리가 모듈에서 한 것은 실제로 특수 튜브와 시각화 시약을 사용했다는 것입니다. 그래서 우리는 실제로 DNA를 스핀다운할 수 있고 항소를 시각화할 수 있어 학생과 교사 모두에게 더 쉽게 만들 수 있습니다.

DNA와 RNA의 모든 단계에서 사용할 수 있도록 개발 후 작업합니다. 이 모듈은 학사 학위 연구소의 교수진이 기존 커리큘럼 또는 자신의 연구 관심사와 양립할 수 있는 다른 모델 유기체 또는 기타 치료 요법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 몇 가지 수정 사항을 예로 들자면, 한 사이트는 제초제 처리가 효모에 미치는 영향을 조사한 사이트였고, 다른 사이트는 효모에 대한 LAMP IDE 처리의 효과를 조사한 사이트였고, 다른 사이트는 특히 관심을 가졌던 포유류 세포주의 발달 변화를 조사했습니다.

마지막으로, 또 다른 사이트에서는 애기장대 또는 식물에 대한 차동 광원의 영향을 조사했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 효모에서 총 RNA의 분리, CDNA의 생성, 비오틴 표지 CRNA의 단편화를 포함하여 과학 학부생과 함께 마이크로레이 실험을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 높은 수준의 기술에 대한 실무 경험은 학부 과학 교육을 강화하고 강화하는 데 도움이 됩니다.